Name: Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin fare retinası için immünhistokimyasal boyama ve görüntüleme yöntemini. Bu teknik sinir dokusunun yapısal bütünlüğünü koruyarak sinaptik proteinlerin canlı doku görüntülemesinde üstün bir altyapı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe R01-EY020535 (BTS), Uluslararası Retinal Araştırma Vakfı ve Karl Kirchgessner Vakfı (BTS) tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürlerde hayvanlar, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Bildirisi'ndeki düzenlemelere göre ve Weill Cornell Tıp Koleji tarafından onaylanan protokollere uygun olarak tedavi edildi. Hayvanlara karbondioksit ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapıldı.
1. Wholemount Retina Diseksiyonu
<ol>
	<li>Fare ötenazi yapıldıktan sonra, gözlerini enüklee edin ve oksijenli HEPES tamponlu Ringer çözeltisine yerleştirin (Tablo 1).</li>
	<li>Ora serrata boyunca küçük bir makasla dairesel bir yol keserek, gözü forseps ile limbusta tutarak korneayı çıkarın. Lensi forseps ile dışarı çekin.</li>
	<li>Künt kenarlı forseps kullanarak mümkün olduğunca fazla vitreus çıkarın. Bu adım bolus enjeksiyonları ve elektrofizyolojik kayıtlar için önemlidir; Tek başına immünohistokimya yapılırken gerekli değildir.</li>
	<li>Forsepsleri retina ve vizör lastiği arasına yerleştirerek retinayı göz kabından ayırın ve forsepsleri çevre boyunca yavaşça hareket ettirin. Sklerayı ikinci bir forseps seti ile sıkıca tutarak göz kabını stabilize edin. Retinanın göz kabından ayrılmasını kolaylaştırmak için retina ile göz kapağı arasındaki yerde optik siniri kesin.</li>
	<li>Retina parçalara ayrılabilir (örn. çeyrekler) veya bir bütün olarak kullanılabilir. Parçalara ayırmak için, retina çevresinden optik sinire kadar kesiler yapmak için makas kullanın. Alternatif olarak, tüm retinayı kullanmak için, çevreden optik sinirin yarısına kadar kesiler yapın. Kesiler düz bir hazırlık yapılmasına yardımcı olacaktır.</li>
</ol>
2. Hidrofilize PTFE Membran Ek Parçasına Montaj
<ol>
	<li>Membranı aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın. Fizyolojik kayıtlar veya boya enjeksiyon deneyleri yapıldığında, kalan halkanın yüksekliği 1 mm olacak şekilde bir torna tezgahı veya el testeresi kullanarak tutucuyu kısaltın. 
	Not: Kültür plakası ekleri değiştirilmemiş veya modifiye edilmiş olabilir (Şekil 1A). Konfigürasyonun seçimi, deneyin amacına göre belirlenir. İmmün boyama için, değiştirilmemiş bir uç uygundur.</li>
	<li>Pürüzlü yüzeyleri ince (300 kum veya daha yüksek) zımpara kağıdı ile cilalayın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Halkanın altındaki ayakları makasla çıkarın.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için, zarı damıtılmış suda 2-3 dakika durulayın veya sonikleştirin.</li>
	<li>Dokuyu zarın üzerine monte edin (Şekil 1A). Dokuyu bir miktar solüsyonla plastik bir transfer pipeti ile zarın üzerine yerleştirin. Aktarım sırasında doku örneğinin pipete yapışmasını önlemek için gerekirse pipetin dar ucunu kesin.</li>
	<li>Retinayı ganglion hücreleri (GC'ler) yukarı gelecek şekilde takın: zar üzerinde, retinayı yayarken ve kıvrımları forseps ile açarken çözeltiyi yavaş yavaş çıkarın.</li>
	<li>Zarın karşı tarafında, doğrudan dokunun altına boş bir şırınga (1 ml) yerleştirin. Pistonu 0.2-0.3 ml'lik bir hacme geri çekerek emme uygulayın. Kullanmadan önce şırınganın tutma ucunu keserek emme yüzey alanını artırın. Doku, fiziksel olarak zarın içine yerleştirildiği için yapışma için daha fazla tedavi gerektirmez.</li>
</ol>
3. İzolektin Alexa 488'in Bolus Enjeksiyonu
<ol>
	<li>Yama pipetleri ve boyama solüsyonu hazırlayın. Yama pipetlerini borosilikat kılcal camdan ~1 MΩ dirençli Alevli/Kahverengi çektirme ile çekin. Pipetin ucunu yavaşça kırın.</li>
	<li>Adım 1.2'de açıklanan HEPES tamponlu Ringer çözeltisinin 10 μl'sine 0.3 μl izolektin Alexa 488 stok çözeltisi ekleyerek boyama çözeltisi yapın.</li>
	<li>Numuneyi enjeksiyon için yama kelepçesi kurulumuna aktarın (Şekil 1C). Membranı, bağlı doku ile birlikte, ısıtılmış (37 ° C) ve oksijenli HEPES tamponlu Ringer çözeltisi ile perfüze edilmiş kayıt odasına yerleştirin.</li>
	<li>Boya içeren pipeti iç sınırlayıcı zara yerleştirin (ILM, Şekil 2A). Mikromanipülatör kullanarak, pipeti ILM'ye nüfuz edene kadar ILM'ye karşı daha da ilerletin. Boyama solüsyonunu bir picospritzer kullanarak 1 saniye boyunca 10-20 psi'lik bir basınçla enjekte edin. Enjeksiyon için tekli veya çoklu yerler hedeflenebilir (Şekil 2B). Bir picospritzer mevcut değilse, enjeksiyon için pozitif bir hava basıncı sağlamak için 10 ml'lik bir şırınga kullanılabilir.</li>
	<li>Enjekte edilen dokuyu 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, enjekte edilen doku epifloresan aydınlatması altında görüntülenebilir.</li>
	<li>Etiketlemeden sonra, preparat görüntüleme için bir mikroskoba alınabilir. Inserti, retina tarafı aşağı bakacak şekilde cam tabanlı bir kültür kabına aktarın (Şekil 1C).</li>
	<li>Numuneyi nemli tutmak için bir damla HEPES solüsyonu ekleyin.</li>
	<li>Ek parçayı kültür kabının dibine sıkıca sabitlemek için plastik halkanın çevresine 2-3 nokta vakumlu gres yerleştirin.</li>
	<li>Çanağı mikroskop aşamasına aktarın.</li>
</ol>
4. Paraformaldehit ve Karbodiimid Fiksasyonu
<ol>
	<li>Ek parçayı 15 dakika boyunca fiksatife aktararak numuneyi sabitleyin. Uygulamaya bağlı olarak daha uzun veya daha kısa fiksasyon süreleri kullanılabilir. Her iki fiksatif de GFP, izolektin veya floresan Alexa hidrazidlerini (örneğin, yama kelepçe kayıtlarında hücreleri doldurmak için kullanılır) sabitlemek için etkili bir şekilde kullanılabilir. 
	Not: Fiksasyon için %4 karbodiimid veya %4 paraformaldehit çözeltileri kullanılabilir. Yapışmayı sürdürmek için, doku zara zaten bağlandıktan sonra fiksasyon yapılmalıdır. Doku, montajdan hemen sonra veya fizyolojik kayıt ve / veya bolus enjeksiyonundan sonra sabitlenebilir.</li>
	<li>Dokuyu fosfat tamponunda (PB) 30 dakika durulayın. Bundan sonra, doku ya bir bütün montaj olarak işlenebilir (adım 5) ya da dikey bölümler halinde kesilebilir ve daha sonra işlenebilir (adım 6 ve 7).</li>
</ol>
5. Retinal Wholemounts'un İmmün Boyanması
<ol>
	<li>24 oyuklu bir tabakta (Şekil 1D), bir boyama solüsyonunda 1 saat boyunca zar üzerindeki retina parçalarını bloke edin.</li>
	<li>Fare anti-PSD-95 primer antikorlarını boyama solüsyonunda 1:300 oranında seyreltin ve karanlıkta oda sıcaklığında 48 saat boyunca uygulayın. Doku ile her oyuğa ~ 100-150 μl antikor çözeltisi ekleyin. Kurumasını önlemek için, kullanılmayan kuyuları damıtılmış suyla doldurun.</li>
	<li>PB, 3x'te 20 dakika durulayın.</li>
	<li>Boyama solüsyonunda 1:500 oranında çözülmüş eşek anti-fare Alexa 568 ikincil antikorunda 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>PB, 3x'te 20 dakika durulayın.</li>
	<li>Lekeli dokuyla birlikte eki PB solüsyonu ile doldurulmuş standart 3 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Küçük bir makasla, retinayı içeren zarın bir kısmını halkadan kesin.</li>
	<li>Zar üzerindeki retinayı yukarı doğru kayan bir retina üzerine aktarın. PB'yi çıkarın, montaj ortamı ekleyin. Retinanın aşırı sıkışmasını ve hasar görmesini önlemek için sürgü ile lamel camları arasına kırık bir kapak kayma camından küçük parçalar yerleştirin. Lameli yerleştirin.</li>
	<li>Lameli oje ile yerine kapatın. Slaytları karanlıkta, buzdolabında saklayın.</li>
</ol>
6. Membrana Monte Dokunun Dikey Kesiti
<ol>
	<li>Fiksasyondan sonra, zar üzerindeki dokuyu 30 dakika, 1 saat ve gece boyunca sırasıyla% 10,% 20 ve% 30 sükroz gradyan çözeltilerine daldırın. Gece adımı buzdolabında 4 °C'de, diğer tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.</li>
	<li>Makas kullanarak, dokuyla birlikte zarı plastik ekleme halkasından çıkarın.</li>
	<li>Kesilen zarı retina yukarı bakacak şekilde Parafilm üzerine yerleştirin ve Kimwipes ile mümkün olduğunca fazla solüsyonu çıkarın.</li>
	<li>Parafilmi doku ile birlikte kriyostat odasına koyun ve bir damla OCT ortamı ekleyin. Donmayı hızlandırmak için hızlı dondurucu cihazını kullanın.</li>
	<li>Dondurulmuş numuneyi ayırın ve ters çevirin.</li>
	<li>Fazla donmuş OCT'yi kesin. Numunenin etrafında üç taraftan yaklaşık 2 mm bırakın ve tutucuya takılacak taraftan 5-6 mm bırakın.</li>
	<li>Açıkta kalan retina tarafını (zar tarafı) bir damla OCT ile örtün. Takma alanını boş bırakın.</li>
	<li>Membranı retina dokusu ile dondurun. Artık numune bir kesme tutucusuna yerleştirilmeye hazırdır.</li>
	<li>Soğuk bir tutucu halkaya bir damla OCT koyun. Dondurulmuş numuneyi hemen damlanın içine yerleştirin.</li>
	<li>Kriyostat sıcaklığını -19 °C'ye ayarlayarak 10-20 μm kalınlığında kesitler kesin. Sıcak (oda sıcaklığında) polisin yapışma slaytları kullanın. Bölümlerin sıkı bir şekilde yapışmasını sağlamak için slaytları ekli bölümlerle birlikte karanlıkta ~2-3 dakika (41 °C) bir ısıtma platformuna bırakın.</li>
	<li>Slaytları bir saklama kutusuna koyun ve kullanana kadar -20 °C'de tutun.</li>
</ol>
7. Retina Bölümlerinin İmmün Boyanması
<ol>
	<li>Slaytları bölümleri olan dondurucudan çıkarın. Yoğuşmayı gidermek için 1 dakika oda sıcaklığında kalmalarına izin verin.</li>
	<li>Daha fazla inkübasyon için bir bariyer oluşturmak için bölümleri bir sıvı engelleyici ile çevreleyin.</li>
	<li>Slaytları inkübasyon kutusuna yerleştirin. Antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için kutunun altını suyla örtün.</li>
	<li>PB ile 5 dakika durulayın.</li>
	<li>Aynı boyama solüsyonlarını hazırlayın ve 5. adımdaki adımları izleyin. Birincil antikor ile inkübasyon gece boyunca ve ikincil antikor ile 1 saattir. Lamel ile sürgü arasında kırık cam kullanmayın.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Hidrofilize PTFE membranın yüksek biyouyumluluğu ve çözeltilerdeki şeffaflığı, canlı doku ile çalışırken avantajlıdır. Bu hazırlık, ışık tepkileri8-10'un yama-kelepçe kayıtları için daha önceki çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Burada, bu yaklaşımın tüm mount retinanın yapısal analizi için nasıl benimsenebileceğini gösteriyoruz.
Bolus yükleme tekniği, canlı dokuyu etiketlemek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Bu tekniğe, membran ekinin yapısal desteği yardımcı olur. Uygul...

Hassas sağlam dokularda immünohistokimya yapmak, taşıma ve transfer sırasında hasar riski taşır. Bu, beyin dilimlerinde veya dejenere retina gibi diğer ince dokularda ortaya çıkabilir. Ek olarak, nöronal yapıların immün boyalanması için avantajlı olabilecek, ancak kullanımlarını engelleyerek yapısal stabilitenin bozulmasına neden olan belirli doku fiksasyon yöntemleri vardır. Bunun özel bir örneği, reseptörlerin vehormonların 1-7 boyanması için üstün olan, ancak sabit dokunun instabilitesi nedeniyle yaygın olarak kaçınılan karbodiimid bazlı fiksasyondur.
Burada, çeşitli boyama teknikleri için sabit veya sabitlenmemiş hassas dokuyu yapısal olarak desteklemek için hidrofilize bir PTFE membran kullanan bir prosedürü açıklıyoruz. Destek membranı, fiksasyondan önce ve sonra hassas dokunun manipülasyonuna izin vererek, doku hasarı riskini en aza indirirken birkaç işlem adımına izin verir. Genel olarak, doku bütünlüğünü korumak için bu basit yöntem, aksi takdirde kaçınılabilecek teknikleri kullanma fırsatı sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşım, dilimleme prosedürlerini takiben kırılgan hale gelen beyin dilimleri gibi çok çeşitli dokuların hazırlanması için de başarıyla kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Millicell Hücre Kültürü Eki, 12 mm, hidrofilik PTFE (Biyogözenek), 0,4 & mu; m</td><td>Millipore PICM01250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngası, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15003-08</td><td>diseksiyon</td></tr><tr><td>Forseps, Dumont # 55, inox</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td>diseksiyon</td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop Sistemi</td><td>Nikon</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal cam</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Alevli / Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam Alt Kültür Tabakları</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Çok kuyulu plakalar, 24 kuyulu</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı, #1</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Polisin yapışma slaytları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Engelleyici Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT orta</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm laboratuvar filmi</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning yüksek vakumlu gres</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>İzolelektin Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Engelleyici</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sülforhodamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Karbodiimid</td><td>Termo Bilimsel</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için retina wholemount hazırlık için optimize edilmiş protokolü

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Hassas doku ile çalışmak, immünohistokimyasal değerlendirme yapılırken karmaşık bir faktör olabilir. Burada, immünohistokimyasal işleme sırasında hem canlı hem de sabit dokuya yapısal destek sağlamak için halka destekli hidrofilize PTFE membran kullanan ve aksi takdirde dokuya zarar verebilecek çeşitli protokollerin kullanılmasına izin veren bir yöntem sunuyoruz. İlk olarak, bu, floresan belirteçlerin canlı retina dokusuna bolus yüklemesi ile gösterilir. Bu yöntem, hedeflenen yapıların hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verirken, membran desteği enjeksiyon sırasında doku bütünlüğünü korur ve daha fazla görüntüleme veya işleme için preparatın kolayca aktarılmasına izin verir.
İkinci olarak, karbodiimid ile sabitlenmiş dokuda antikor boyama için bir prosedür tarif edilmiştir. Paraformaldehit fiksasyonu daha yaygın olmasına rağmen, karbodiimid fiksasyonu sinaptik proteinlerin görselleştirilmesi için üstün bir substrat sağlar. Karbodiimidin bir sınırlaması, ortaya çıkan sabit dokunun nispeten kırılgan olmasıdır; Bununla birlikte, destekleyici membranın kullanılması ile bu durumun üstesinden gelinir. Retina dokusu bu teknikleri göstermek için kullanılır, ancak herhangi bir kırılgan dokuya uygulanabilir.

Burada, boyama prosedürleri sırasında bütün retina örneğini desteklemek için hidrofilize edilmiş bir PTFE membran kullanımından yararlanan iki temsili deney gösterilmektedir. İlk deney, birden fazla retinal tabakaya yayılan karmaşık bir kan damarı ağı olan retinal vaskülarizasyonun hızlı ve basit karakterizasyonu yöntemini örneklendirmektedir (Şekil 2). Bu yaklaşım, izolektinin bolus yüklemesini, SRH ile daldırma etiketlemesiyle birleştirir. Bu, neredeyse anında görselleştirilebilen ve taranabilen canlı ...

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Bu prosedür, yapısal bütünlüğü korumak amacıyla hassas nöral dokunun nasıl stabilize edileceğini göstermek için fare retinal dokusunu kullanmaktadır. İmmünohistokimyasal boyamanın çeşitli aşamaları sırasında, önce gözü nukle edin, korneayı çıkarın ve retinayı sklera'dan ayırın. Dokuyu düzleştirmek için retinal göz çanağına insizyonlar yapın.Ardından, doku bütünlüğünü korumak için doğrudan manipülasyon yapmadan, vakumlu transfer yöntemiyle retinayı halka destekli bir membrana sabitleyin. Şimdi halkayı boyama işlemi için çok kuyucuklu bir plakaya aktarın. Sonuçlarımız, bu tekniğin canlı dokularda etkili bir şekilde kullanılabileceğini ve diseke edilen retinanın taşınmasına yönelik mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, sinaptik proteinlerin görüntülenmesi için üstün bir substrat sağladığını göstermektedir.Bu teknikler, hassas dokuların minimum fiziksel manipülasyonla transfer edilmesine olanak tanır. Bu durum, distorsiyon ve hasar riskini azaltacaktır. Bu fikri ilk olarak, retinal dejenerasyon modeli olan RD one faresinde düz monte edilmiş dokulardan kayıt yapmamız gerektiğinde geliştirdik; bu farelerin retinaları, mutasyonun neden olduğu yaygın hücre kaybı nedeniyle son derece ince ve kırılgandır.Laboratuvarımızdaki bir doktora sonrası araştırmacı, prosedürü göstermemde bana eşlik edecek. Öncelikle, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerini nukle edin ve gözleri oksijenlendirilmiş heaps buffered ringer çözeltisine aktarın. Korneayı çıkarmak için, gözü limbus kısmından forsepsle tutun ve ardından ora serrata boyunca dairesel bir kesi yapın.Bolus enjeksiyonları ve elektrofizyolojik kayıtlar için lensi pensle dışarı çıkarın. Mümkün olduğunca fazla vitreusu temizlemek için küt uçlu pens kullanın. Şimdi, sklerayı pensle sıkıca tutarak göz çukurunu sabitleyin.İkinci bir pens setini retina ile göz çanağı arasına yerleştirin. Pensi çevresi boyunca yavaşça hareket ettirin. Optik siniri retina ile göz çanağı arasından kesin ve göz çanağını makasla çıkarın.Retina çevresinden optik sinire kadar insizyonlar yapın. Alternatif olarak, tüm retinayı kullanmak için, tutucuyu kısaltmak amacıyla çevreden optik sinirin yarı yoluna kadar insizyonlar yapın. Fazla kısmı bir torna ile çıkarın.Ardından pürüzlü yüzeyleri ince zımpara kağıdı ile düzeltin. Halkanın altındaki ayakları çıkarın. Plastik bir pipetin dar ucunu kesin.Ardından dokuyu bir miktar solüsyon ile birlikte membrana aktarın. Retinayı yayarken solüsyonu kademeli olarak uzaklaştırın ve dokuyu açın. Şimdi retinayı, ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde membrana sabitleyin.Bir mililitrelik bir şırınganın tutucu ucunu kesin ve doğrudan dokunun altına yerleştirin. Dokuyu membranın içine fiziksel olarak hapsetmek için pistonu yaklaşık 0.3 mililitre hacme kadar geri çekin. Yaklaşık bir mega direnç kullanarak bazı borosilikat kapiler pipetler çekin.Ardından, her bir yama pipetinin ucunu nazikçe kırın. Sonra, 10 µL HEPES tamponlu Ringer çözeltisine 0,3 µL selektin stok boyama çözeltisi ekleyin. Şimdi membranı, sıcak oksijenli HEPES tamponlu Ringer çözeltisi ile perfüze edilen kayıt haznesine yerleştirin.Boya içeren pipeti, bir mikro manipülatör kullanarak iç sınırlayıcı membrana karşı konumlandırın. Pipeti, iç sınırlayıcı membranı penetre edecek şekilde daha fazla ilerletin. Ardından, boyama solüsyonunu hedeflenen tek veya birden fazla konuma enjekte edin.Şimdi, epi floresan aydınlatma altında izlerken dokunun enjeksiyondan toparlanması için 10 dakika bekleyin. Arzu edilirse, inserti cam tabanlı bir kültür kabına, retina tarafı aşağı gelecek şekilde aktarın. Spesimeni nemli tutmak için bir damla HEP çözeltisi ekleyin.Ayrıca, ek parçayı kültür kabına sıkıca sabitlemek için plastik halkanın çevresine üç nokta vakum gresi sürün. Sabitleme işleminden sonra kabı mikroskop tablasına aktarın ve membranı sükroz gradyan çözeltilerine daldırın. Membranı plastik ek halkasından kesin.Kim wipe'lar ile mümkün olduğunca fazla solüsyonu uzaklaştırın ve retinayı yukarı bakacak şekilde paraform üzerine yerleştirin. Dokunun bulunduğu paraformu kriyostat haznesine aktarın ve bir damla OCT medyumu ekleyin. Dondurmayı hızlandırmak için hızlı dondurucu cihazı kullanın.Dondurulmuş örneği ayırın ve ters çevirin. Şimdi fazla dondurulmuş OCT kısmını kesin. Örnek etrafında üç kenarda yaklaşık iki milimetre ve tutucuya takılacak olan kenarda ise milimetreler kadar pay bırakın.Bağlı olan alanı boş bırakarak, açığa çıkmış retinal tarafı bir damla OCT ile kaplayın. Retinal dokuyu içeren membranı dondurun. Soğuk bir tutucu halka üzerine bir damla OCT yerleştirin.Dondurulmuş örneği derhal damlaya yerleştirin. -19 °C'de 10 ila 20 mikronluk kesitler alın ve bunları sıcak poli-L-lizin yapışma lamlarına yerleştirin. Kesitlerin tutturulduğu lamları, karanlıkta, 41 °C'lik bir ısıtma platformu üzerinde iki ila üç dakika bekletin.Ardından örnekleri -20 °C'de saklayın. Bu deney, retinal vaskülatürün, birden fazla retinal tabakaya yayılan karmaşık bir kan damarı ağı olarak hızlı ve basit karakterizasyonunu göstermektedir. İzo selektinin bolus yüklemesi ile sülfarumin daldırma etiketlemesi birleştirilerek, canlı retina dokusu neredeyse anında görselleştirilip taranabilir ve kan damarları yüzeysel tabakadan derin tabakaya kadar etiketlenebilir.Nispeten iyi difüze olan SRH'nin aksine, selektin iç sınırlayıcı membrandan iyi geçirgenlik göstermez. Sinaptik proteinlerin işaretlenmesinde, örneğin karbimid ile kısa süreli fiksasyonun ardından IPL'deki sinaptik belirteç PSD 95 için yapılan immünofloresan boyamanın, tekil sinapsların ayırt edilmesini sağlayan parlak noktasal bir görünüm sergilemesi gibi, karbimid ile fiksasyonun geleneksel paraformaldehit fiksasyonuna göre çeşitli avantajları vardır.Buna karşılık, geleneksel paraformaldehit fissatör kullanıldığında, sinaptik bileşenlerin tanımlanması daha az nettir. Retinal kriyostat kesitlerinde de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, hassas bir dokunun bu membrana nasıl monte edileceği ve preparata sitokimyasal boyamanın nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Retinanın filtreye takılması 15 dakikanızı alacaktır.

optimized-protocol-for-retinal-wholemount-preparation-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır.  Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.

Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Bu protokol, tam montajlı retinal organoidlerin tam hacimli konfokal görüntülemesi için optik temizleme ve immün etiketlemeyi birleştirir. 3D yapıyı koruyarak, temel nöronal yolların ayrıntılı görselleştirilmesini sağlar, retina olgunlaşması, mekansal organizasyon ve hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıptaki potansiyel uygulamalarının incelenmesini geliştirir.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Öğrenin fare retinası için immünhistokimyasal boyama ve görüntüleme yöntemini. Bu teknik sinir dokusunun yapısal bütünlüğünü koruyarak sinaptik proteinlerin canlı doku görüntülemesinde üstün bir altyapı sunar.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Daha fazla video keşfet