Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü
December 13th, 2013
Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.
Bu prosedür, yapısal bütünlüğü korumak için hassas sinir dokusunun nasıl stabilize edileceğini göstermek için fare retina dokusunu kullanır. İmmünohistokimyasal boyamanın birkaç aşaması sırasında, önce gözü çekirdeklendirin, korneayı çıkarın ve retinayı skleradan ayırın. Dokuyu düzleştirmek için retina göz kabına kesiler yapın.
Daha sonra, dokunun bütünlüğünü korumak için doğrudan manipülasyon olmadan bir emme transferi kullanarak retinayı halka zorlamalı bir zara tutturun. Şimdi halkayı boyama için çok kuyulu bir plakaya aktarın. Sonuçlarımız, bu tekniğin canlı dokuda etkili bir şekilde kullanılabileceğini ve diseke retinanın işlenmesinde mevcut metallere kıyasla sinaptik proteinlerin görüntülenmesi için üstün bir substrat sağladığını göstermektedir.
Bu teknikler, hassas dokunun minimum fiziksel manipülasyon ile transferine izin verir. Bu, bozulma ve hasar olasılığını azaltacaktır. Bu fikir ilk olarak, bir retina dejenerasyonu modeli olan RD bir farede düz monte edilmiş dokudan kaydetmemiz gerektiğinde aklımıza geldi ve bu fare retinası, mutasyon Şefinin neden olduğu geniş hücre kaybı nedeniyle son derece ince ve kırılgan.
Laboratuvarımızdaki bir doktora sonrası araştırmacı, prosedürü göstermek için bana katılacak. İlk olarak, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerini çekirdeklendirin ve gözleri oksijenli yığınlar tamponlu zil çözeltisine aktarın. Korneayı çıkarmak için, gözü forseps ile limbusta tutun ve ardından ora serrata boyunca dairesel bir yol kesin.
Bolus enjeksiyonları ve elektrofizyolojik kayıtlar için lensi forseps ile dışarı çekin. Mümkün olduğunca fazla camsı çıkarmak için harmanlanmış kenar forsepsleri kullanın. Şimdi sklerayı forseps ile sıkıca tutarak göz kabını sabitleyin.
Retina ve göz kabı arasına ikinci bir forseps seti yerleştirin. Forsepsleri çevrenin etrafında yavaşça hareket ettirin. Retina ile göz kabı arasındaki optik siniri kesin ve göz kabını makasla çıkarın.
Retina çevresinden optik sinire kadar kesiler yapın. Alternatif olarak, retinanın tamamını kullanmak için, tutucuyu kısaltmak için çevreden optik sinirin yarısına kadar kesiler yapın. Fazla kısmı bir torna tezgahı ile çıkarın.
Daha sonra pürüzlü yüzeyleri ince zımpara kağıdı ile cilalayın. Ayakları halkanın altından çıkarın. Plastik bir pipetin dar ucunu kesin.
Daha sonra dokuyu bir miktar çözelti ile zara aktarın. Retinayı yayarken çözeltiyi yavaş yavaş çıkarın ve dokuyu açın. Şimdi retinayı, ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde zara tutturun.
Bir mililitrelik şırınganın tutma ucunu kesin ve doğrudan dokunun altına yerleştirin. Dokuyu zarın içine fiziksel olarak örmek için pistonu yaklaşık 0.3 mililitrelik bir hacme geri çekin. Yaklaşık bir mega'lık bir direnç kullanarak bazı boro silikat kılcal pipetleri çekin.
Ardından her yama pipetinin ucunu nazikçe kırın. Daha sonra, 10 mikrolitre yığın tamponlu zil çözeltisine 0.3 mikrolitre is seçici stok leke çözeltisi ekleyin. Şimdi membranı, ılık oksijenli yığınlar tamponlu zil çözeltisi ile perfüze edilmiş kayıt odasına yerleştirin.
Boya içeren pipeti bir mikrom manipülatör kullanarak iç sınırlayıcı zara karşı konumlandırın. İç sınırlayıcı membrana nüfuz etmek için pipeti daha da ilerletin. Daha sonra boyama solüsyonunu tek veya birden fazla hedeflenen yere enjekte edin.
Şimdi, epi floresan aydınlatması altında görüntülerken dokunun enjeksiyondan iyileşmesi için 10 dakika bekleyin. İstenirse, eki retina tarafı aşağı bakacak şekilde bir cam tabanlı kültür kabına aktarın. Numuneyi nemli tutmak için bir damla yığın çözeltisi ekleyin.
Ayrıca, ek parçayı kültür kabına sıkıca sabitlemek için plastik halkanın çevresine üç nokta vakumlu gres yerleştirin. Fiksasyondan sonra çanağı mikroskop aşamasına aktarın, zarı sükroz gradyan çözeltilerine batırın. Membranı plastik ekleme halkasından çıkarın.
Kim mendilleriyle mümkün olduğu kadar çok solüsyonu çıkarın ve retina yukarı bakacak şekilde param üzerine yerleştirin. Paraformu doku ile birlikte kriyostat odasına aktarın ve bir damla OCT ortamı ekleyin. Donmayı hızlandırmak için hızlı dondurucu cihazını kullanın.
Dondurulmuş numuneyi ayırın ve ters çevirin. Şimdi fazla donmuş OCT'yi kesin. Numunenin etrafında üç taraftan yaklaşık iki milimetre ve tutucuya takılacak olan yandan milimetre bırakın.
Açıkta kalan retina tarafını bir damla OCT ile örtün ve ekli alanı serbest bırakın. Retina dokusunu içeren zarı dondurun. Soğuk bir tutucu halkaya bir damla OCT koyun.
Dondurulmuş numuneyi hemen damlanın içine yerleştirin. Eksi 19 santigrat derecede 10 ila 20 mikronluk kesitler kesin ve bunları ılık polilisin yapışma slaytlarına yerleştirin. Slaytları, ekli bölümlerle birlikte karanlıkta iki ila üç dakika boyunca 41 santigrat derecelik bir ısıtma platformuna yerleştirin.
Ardından numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu deney, retina damar sisteminin, birden fazla retina tabakası boyunca uzanan ayrıntılı bir kan damarı ağı olarak hızlı ve basit bir karakterizasyonunu göstermektedir. İzo selektinin bolus yüklemesini sülfa rumin daldırma etiketlemesi ile birleştirerek, canlı doku retinada neredeyse anında görselleştirilebilir ve taranabilir, kan damarları yüzeyselden derin tabakaya kadar etiketlenebilir.
Nispeten iyi yayılabilir olanın aksine, SRH seçici iç sınırlayıcı zar boyunca iyi nüfuz etmez. Sinaptik proteinleri etiketlerken, örneğin sinaptik belirteç için karbimid immünofloresan boyama ile kısa bir fiksasyon süresinden sonra, para formaldehit ile konvansiyonel fiksasyona göre karbimid ile fiksasyonun çeşitli avantajları vardır. IPL'deki PSD 95, bireysel sinapsları ayırt etmekle tutarlı parlak noktasal bir görünüme sahipti.
Buna karşılık, geleneksel paraform aldehit fiksatifi kullanıldığında, sinaptik bileşenlerin tanımlanması daha az açıktır. Retinal kriyostat kesitlerinde de benzer sonuçlar elde edildi. Bu videoyu izledikten sonra, bu zar üzerine hassas bir dokunun nasıl monte edileceğini ve bir ustanın preparatına sito kimyasal boyamanın nasıl uygulanacağını iyi anlamalısınız.
Retinayı filtreye takmanız 15 dakikanızı alacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, sinaptik proteinlerin görüntülenmesi için doku bütünlüğünü korumak amacıyla fare retina dokusu kullanılarak yapılan retinal preparasyonların yapısal değerlendirmesi için bir yöntem sunar. Diseksiyon, montaj ve boyama süreçlerini ayrıntılı olarak açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünohistokimya
- Retinal Biyoloji
Arka Plan
- Sinir dokusunun yapısal bütünlüğü, doğru görüntüleme için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, diseksiyon sırasında doku kalitesini tehlikeye atabilir.
- Floresan belirteçler, hücresel bileşenlerin görselleştirilmesini artırır.
- Optimal sonuçlar için fiksasyon yöntemlerinin karşılaştırılması şarttır.
Çalışmanın Amacı
- Retinal doku preparasyonu için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Farklı fiksasyon yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek.
- Sinaptik proteinler için görüntüleme tekniklerini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Göz ve kornea çekirdeğinin çıkarılması.
- Retina ve skleranın ayrılması ve doku düzleştirilmesi.
- Retina'nın emme transferi kullanılarak bir membrana bağlanması.
- Sinaptik proteinlerin boyanması ve görüntülenmesi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, doku bütünlüğünü etkili bir şekilde korur.
- Floresan belirteçler, üstün görselleştirme sağlar.
- Fiksasyon yöntemlerinin karşılaştırılması önemli bilgiler sağlar.
- Bu teknik, canlı doku görüntülemesine uygulanabilir.
Sonuçlar
- Açıklanan yöntem, retinal dokunun yapısal değerlendirmesini artırır.
- Sinaptik proteinlerin görüntülenmesi için güvenilir bir alt tabaka sunar.
- Gelecekteki uygulamalar diğer sinir dokularına uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical challenge in neuroscience drug discovery: preserving the structural integrity of fragile neural tissue during immunohistochemical processing. By enabling reliable visualization of synaptic proteins and vascular networks in retinal wholemounts, it supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease models. The method enhances predictive confidence in preclinical assays by minimizing tissue distortion artifacts that could confound target engagement readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic protein localization and retinal vasculature architecture in disease models.
- Operational Value: Provides a stabilized platform for consistent antibody staining and fluorescent marker delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of synaptic marker puncta and vascular networks.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats for standardized immunostaining and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from live tissue imaging to fixed tissue analysis for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in histological preparations, improving reproducibility across preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing in neural tissue to preclinical validation of modulator effects on synaptic integrity and vascular function.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by enabling clear visualization of synaptic protein distribution and neurovascular unit integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunofluorescence outputs suitable for high-content analysis of compound effects on retinal structure.
- Analytics: Generates puncta density and vascular network metrics that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of retinal synaptic and vascular biomarkers with preclinical disease progression and treatment response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue stabilization platform applicable to multiple neural tissue types and staining protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through unambiguous synaptic and vascular visualization in fragile neural tissue.
- Operational Value: Improves assay reproducibility and reduces failure rates in immunohistochemical processing of delicate preparations.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives from tissue damage during preparation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective compounds based on reliable structural and functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and tissue handling techniques.
- Depends on access to ring-supported hydrophilized PTFE membranes and suction transfer apparatus.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols across research teams.
- Involves adaptation considerations for varying tissue thickness and fragility across neural models.
- Practical limitations include the need for specialized equipment to prepare and maintain the supporting membrane system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
