Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Bu prosedür, yapısal bütünlüğü korumak için hassas sinir dokusunun nasıl stabilize edileceğini göstermek için fare retina dokusunu kullanır. İmmünohistokimyasal boyamanın birkaç aşaması sırasında, önce gözü çekirdeklendirin, korneayı çıkarın ve retinayı skleradan ayırın. Dokuyu düzleştirmek için retina göz kabına kesiler yapın.

Daha sonra, dokunun bütünlüğünü korumak için doğrudan manipülasyon olmadan bir emme transferi kullanarak retinayı halka zorlamalı bir zara tutturun. Şimdi halkayı boyama için çok kuyulu bir plakaya aktarın. Sonuçlarımız, bu tekniğin canlı dokuda etkili bir şekilde kullanılabileceğini ve diseke retinanın işlenmesinde mevcut metallere kıyasla sinaptik proteinlerin görüntülenmesi için üstün bir substrat sağladığını göstermektedir.

Bu teknikler, hassas dokunun minimum fiziksel manipülasyon ile transferine izin verir. Bu, bozulma ve hasar olasılığını azaltacaktır. Bu fikir ilk olarak, bir retina dejenerasyonu modeli olan RD bir farede düz monte edilmiş dokudan kaydetmemiz gerektiğinde aklımıza geldi ve bu fare retinası, mutasyon Şefinin neden olduğu geniş hücre kaybı nedeniyle son derece ince ve kırılgan.

Laboratuvarımızdaki bir doktora sonrası araştırmacı, prosedürü göstermek için bana katılacak. İlk olarak, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerini çekirdeklendirin ve gözleri oksijenli yığınlar tamponlu zil çözeltisine aktarın. Korneayı çıkarmak için, gözü forseps ile limbusta tutun ve ardından ora serrata boyunca dairesel bir yol kesin.

Bolus enjeksiyonları ve elektrofizyolojik kayıtlar için lensi forseps ile dışarı çekin. Mümkün olduğunca fazla camsı çıkarmak için harmanlanmış kenar forsepsleri kullanın. Şimdi sklerayı forseps ile sıkıca tutarak göz kabını sabitleyin.

Retina ve göz kabı arasına ikinci bir forseps seti yerleştirin. Forsepsleri çevrenin etrafında yavaşça hareket ettirin. Retina ile göz kabı arasındaki optik siniri kesin ve göz kabını makasla çıkarın.

Retina çevresinden optik sinire kadar kesiler yapın. Alternatif olarak, retinanın tamamını kullanmak için, tutucuyu kısaltmak için çevreden optik sinirin yarısına kadar kesiler yapın. Fazla kısmı bir torna tezgahı ile çıkarın.

Daha sonra pürüzlü yüzeyleri ince zımpara kağıdı ile cilalayın. Ayakları halkanın altından çıkarın. Plastik bir pipetin dar ucunu kesin.

Daha sonra dokuyu bir miktar çözelti ile zara aktarın. Retinayı yayarken çözeltiyi yavaş yavaş çıkarın ve dokuyu açın. Şimdi retinayı, ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde zara tutturun.

Bir mililitrelik şırınganın tutma ucunu kesin ve doğrudan dokunun altına yerleştirin. Dokuyu zarın içine fiziksel olarak örmek için pistonu yaklaşık 0.3 mililitrelik bir hacme geri çekin. Yaklaşık bir mega'lık bir direnç kullanarak bazı boro silikat kılcal pipetleri çekin.

Ardından her yama pipetinin ucunu nazikçe kırın. Daha sonra, 10 mikrolitre yığın tamponlu zil çözeltisine 0.3 mikrolitre is seçici stok leke çözeltisi ekleyin. Şimdi membranı, ılık oksijenli yığınlar tamponlu zil çözeltisi ile perfüze edilmiş kayıt odasına yerleştirin.

Boya içeren pipeti bir mikrom manipülatör kullanarak iç sınırlayıcı zara karşı konumlandırın. İç sınırlayıcı membrana nüfuz etmek için pipeti daha da ilerletin. Daha sonra boyama solüsyonunu tek veya birden fazla hedeflenen yere enjekte edin.

Şimdi, epi floresan aydınlatması altında görüntülerken dokunun enjeksiyondan iyileşmesi için 10 dakika bekleyin. İstenirse, eki retina tarafı aşağı bakacak şekilde bir cam tabanlı kültür kabına aktarın. Numuneyi nemli tutmak için bir damla yığın çözeltisi ekleyin.

Ayrıca, ek parçayı kültür kabına sıkıca sabitlemek için plastik halkanın çevresine üç nokta vakumlu gres yerleştirin. Fiksasyondan sonra çanağı mikroskop aşamasına aktarın, zarı sükroz gradyan çözeltilerine batırın. Membranı plastik ekleme halkasından çıkarın.

Kim mendilleriyle mümkün olduğu kadar çok solüsyonu çıkarın ve retina yukarı bakacak şekilde param üzerine yerleştirin. Paraformu doku ile birlikte kriyostat odasına aktarın ve bir damla OCT ortamı ekleyin. Donmayı hızlandırmak için hızlı dondurucu cihazını kullanın.

Dondurulmuş numuneyi ayırın ve ters çevirin. Şimdi fazla donmuş OCT'yi kesin. Numunenin etrafında üç taraftan yaklaşık iki milimetre ve tutucuya takılacak olan yandan milimetre bırakın.

Açıkta kalan retina tarafını bir damla OCT ile örtün ve ekli alanı serbest bırakın. Retina dokusunu içeren zarı dondurun. Soğuk bir tutucu halkaya bir damla OCT koyun.

Dondurulmuş numuneyi hemen damlanın içine yerleştirin. Eksi 19 santigrat derecede 10 ila 20 mikronluk kesitler kesin ve bunları ılık polilisin yapışma slaytlarına yerleştirin. Slaytları, ekli bölümlerle birlikte karanlıkta iki ila üç dakika boyunca 41 santigrat derecelik bir ısıtma platformuna yerleştirin.

Ardından numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu deney, retina damar sisteminin, birden fazla retina tabakası boyunca uzanan ayrıntılı bir kan damarı ağı olarak hızlı ve basit bir karakterizasyonunu göstermektedir. İzo selektinin bolus yüklemesini sülfa rumin daldırma etiketlemesi ile birleştirerek, canlı doku retinada neredeyse anında görselleştirilebilir ve taranabilir, kan damarları yüzeyselden derin tabakaya kadar etiketlenebilir.

Nispeten iyi yayılabilir olanın aksine, SRH seçici iç sınırlayıcı zar boyunca iyi nüfuz etmez. Sinaptik proteinleri etiketlerken, örneğin sinaptik belirteç için karbimid immünofloresan boyama ile kısa bir fiksasyon süresinden sonra, para formaldehit ile konvansiyonel fiksasyona göre karbimid ile fiksasyonun çeşitli avantajları vardır. IPL'deki PSD 95, bireysel sinapsları ayırt etmekle tutarlı parlak noktasal bir görünüme sahipti.

Buna karşılık, geleneksel paraform aldehit fiksatifi kullanıldığında, sinaptik bileşenlerin tanımlanması daha az açıktır. Retinal kriyostat kesitlerinde de benzer sonuçlar elde edildi. Bu videoyu izledikten sonra, bu zar üzerine hassas bir dokunun nasıl monte edileceğini ve bir ustanın preparatına sito kimyasal boyamanın nasıl uygulanacağını iyi anlamalısınız.

Retinayı filtreye takmanız 15 dakikanızı alacaktır.