Name: Uzun Vadeli Kronik Pseudomonas aeruginosa Havayolu Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Öğrenin, farelerde kronik Pseudomonas aeruginosa solunum yolu enfeksiyonu oluşturmak için agar boncuk yöntemini. Bu teknik, bakteri yükünü bir aya kadar stabil tutarak kronik enfeksiyon araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bragonzi laboratuarında Araştırma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı (CFaCore) ve AB-F7-2009-223670 tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışmanın bir parçası alembic, gelişmiş mikroskobu laboratuvarında gerçekleştirildi ve fare histopatoloji Patolojik Anatomi (San Raffaele Bilimsel Enstitüsü) Ünitesinde yapıldı.

1.. Kronik Enfeksiyon için hazırlık Bakteriler (önceki Fare Mücadelesi Üç ve İki Gün) <ol><li> Uygun P ismi seçin aeruginosa ırk test edilmesi. </li><li> P. loopful inoküle Bir Trypticase Soy Agar (TSA) plakaya bir -80 ° C stok kültüründen aeruginosa ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tek bir koloni almak ve bir 15 ml ek-kapaklı bir tüp içinde 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) içine inoküle ve 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatör içinde gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 2. Kronik Enfeksiyon Agar Boncuk Bakteriler katıştırma (önceki Enfeksiyon One Day) <ol><li> , Bakteri kültürü gece boyunca küçük bir kısım al fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1:50 seyreltilmiş ve 600 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) ölçün. </li><li> Taze TSB 20 ml içeren, yeni bir çırpıda-kapaklı tüp içinde 2 OD ekleyerek gecede bakteri kültürü sulandırmak. </li><li> Yaklaşık 3 boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin -10-15 OD toplam ulaşana kadar, 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe log fazına kadar 4 saat. </li><li> Bu arada,% 1.5 ağar, otoklav ve bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;de dengeye ile TSB yapılmış TSA hazırlamak. Bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;de bir Erlenmeyer şişesi içinde preautoclaved ağır mineral yağ 150 ml dengelenmesi. </li><li> Bir kez P. aeruginosa, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2700 x g&#39;de santrifüj ile bakteriyel hücreleri toplamak ve supernatant atmak log fazına ulaşır. </li><li> Iyice tamamen pelet tekrar süspansiyon için 1 ml steril PBS ve vorteks de bakteriyel pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Sıvı TSA 9 ml, 50 ° C&#39;de önceden dengelendi ile karıştırın 1 ml bakteri süspansiyonu </li><li> 10 ml-TSA P. ekleme hemen aeruginosa (50 ° C&#39;de önceden ısıtılmış), ağır mineral yağ elde karışımı oda sıcaklığında 6 dakika boyunca karıştırın. Ajitasyon yağ içinde görünür bir girdap üretmelidir. </li><li> En az sp karıştırıldıktan sonra, 4 ° C&#39;ye soğutun35 dakika (Şekil 1) için Bayram. </li><li> Ilave bir 20 dakika boyunca buz içinde agar-boncuk-yağ karışımı bekletin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2700 x g&#39;de 50 ml Falcon tüpleri ve santrifüj içine agar-boncuk Transferi </li><li> Doğru mineral yağı çıkarmak ve aşama 2.11 &#39;de tarif edildiği gibi, steril PBS ile altı kez yıkayın. Üç yıkamadan sonra, boncuklar yerine santrifüj kullanılarak yer çekimi ile tane haline edilebilir. Son yıkamadan sonra, 20-30 ml PBS içinde tekrar süspansiyon agar-boncuklar. </li><li> Boncuklar (yaklaşık 0.5 mi) bir kısım alın ve aseptik homojenleştirin. </li><li> Homojenize boncuk 100 ul alın ve steril PBS içinde 900 ul seyreltik. Seri 10 -6 aşağı 01:10 sulandırmak. </li><li> -6 Aşağı 10 ve 37 ° C de inkübe etmek plakaları seyreltilmemiş örnek de dahil olmak üzere TSA plakaları üzerine Plate seri seyreltme, </li><li> Çeşitli alanlarda bir ters ışık mikroskobu kullanarak boncuk çapını ölçün. Bir kordon çapı (100-200 um arasında olmalıdır <strong&gt; Şekil 1). </li><li> 4 ° C de bir gece boncuk saklayın </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. Agar boncuk hazırlama ve fare enfeksiyon bakış. P. aeruginosa hücreler PBS içinde 1 ml yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve sıvı TSA (50 ° C) 9 ml eklenir. Bu karışım, bir şişe içinde 50 ° C de, 150 ml, ağır mineral yağ ilave edildi ve oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yüksek hızda karıştırılır. Şişe 35 dakika boyunca yavaş bir karıştırma ile 4 ° C&#39;ye soğutulur, agar boncuk oluşturma katılaşarak ve bu karışım içinde mevcut bakteri agar boncuklar içine gömülürler. Bakteriyel hücreler ihtiva eden bir agar kordonun Detay (A) gösterilmektedir. Steril PBS ile birkaç yıkama ile mineral yağı ayrılmasından sonra, agar-boncuk süspansiyonu f hazırya da soluk borusuna enjeksiyon (B) farelerin akciğerlerinde aşılama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . 3. Agar-boncuk olan fareler meydan Etik Beyanı: Bu protokol ve deney San Raffaele Bilimsel Enstitüsü hayvan bakımı ve etik komitesinin yönergeleri izleyin. <ol><li> Agar-boncuk süspansiyon CFU / ml sayısını belirlemek için TSA plakaları üzerine koloni oluşturan birim sayısı (CFU) sayısı. 50 ul 1-2 x 10 6 optimal inokülümü elde etmek için 2-4 x 10 7 CFU / ml steril PBS ile agar-boncuk seyreltin. </li><li> C57Bl/6NCr (6-8 haftalık, 20-22 g) ile 0.002 ml / g vücut ağırlığı hacminde tatbik% 0.9 NaCI içinde ketamin (50 mg / ml) ve ksilazin (5 mg / ml) ile birlikte erkek farenin anestezisi intraperitoneal enjeksiyonu. Not: Anestezi adeq düşünülmektedirUATE hayvan sessizce hala kaldığında, dış uyaranlara yanıt vermeyen ve sürekli kalp ve solunum oranları vardır. </li><li> Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin. </li><li> Cilt dikey kesim tarafından trakea Açığa ve trakea içine aşağı hareket ederken stylette kaldırmak dikkat tutarak, steril, esnek 22 G 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Değil çok derin trakea içine kateter yerleştirin. Karina (çatallanma) ulaşmadan önce durdurun. </li><li> Derhal bir 1 ml şırınga ile agar boncuk süspansiyonu, 50 ul bir hacmi almak ve katetere ekleyin. Yavaşça boncuklar akciğer içine implante izin vererek, şırınga pistonu itin. Dikiş klipleri kullanarak kesi kapatın. </li><li> Tamamen uyanık kadar bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. </li></ol> 4. Fareler Değerlendirme <ol><li> Ceket kalitesi, duruş dahil klinik belirtileri için günlük fareler gözlemlemek,ambulasyon ve hidrasyon durumu. Günlük vücut ağırlığı izleyin. ≥% 20 vücut kilo Fareler ötenazi edilmelidir. </li><li> Bronkoalveoler lavaj (BAL) ile akciğer toplanması ve toplam CFU analizinde, histolojik analiz, BAL, sitokin analizleri için toplam ve diferansiyel hücrelerin sayısı açısından iltihap tepkisi ve için İlgi 6 ya da 7 toplanması için Noktası 5 izleyin miyeloperoksidaz (MPO) etkinliği. </li></ol> 5. BAL Sıvı Toplama ve Analizi <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla fareler Euthanize. </li><li> Yatar pozisyonda fare yerleştirin. % 70 etanol ile fare kat dezenfekte edin. </li><li> Cilt dikey kesik ile trakea ve göğüs kafesi Açığa. Diyafram keserek akciğerleri Açığa. </li><li> Cımbız kullanarak trakea altında bir dikiş ipliği takın ve bir steril, esnek 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter ile trakea entübe. Ca bağlamak için dikiş ipliğinin her iki ucu çekintrakea için theter ve trakea etrafında iplik düğüm. </li><li> Bir 1 ml şırınga ile RPMI 1640 içinde 1 ml&#39;lik bir hacim alın ve katetere ekleyin. Akciğer yıkama ve hemen sıvı geri, bir 15 ml tüp içinde depolamak için, enjektörün pistonu itin. NOT: sitokinler analiz edilecek ise, RPMI 1640 proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> RPMI 3 ml bir toplam Bu adımı üç kez tekrarlayın. Şu andan itibaren, buz üzerinde BAL sıvısı saklayın. Akciğerlerin toplama ve analiz için 6. adıma gidin. NOT: tüm sıvı (2.8 ml maksimum) alınacağını unutmayın. </li><li> BAL sıvısında bulunan bakteri miktarının için, küçük bir kısım (300 ul) örnek, seri TSA plakaları üzerinde, steril PBS içinde plaka 1:10 seyreltin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir Bürker hücre sayısı odası içinde Tuerk çözeltisi ile BAL sıvısı 1:02 arasında bir kısım seyreltilmesi ters bir ışık optik mikroskop kullanılarak toplam hücre sayımı. </li><li> R santrifüj4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 330 x g BAL sıvısı emaining -80 ° C&#39;de depolamadan, ELISA sitokin analizi için üstteki sıvı kısmı alınır Sitospin tarafından diferansiyel hücre sayımı için adımları 5,10-5,13 izleyin. </li><li> Pelet kırmızı ise, RBC liziz tamponu 250-300 ul içinde topağın tekrar askıda eritrositler 3 dakika için ultra-saf damıtılmış su içinde 1:10 seyreltilir lize edildi. 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 330 x g, 2 ml PBS ve santrifüj ile nötralize </li><li> Süpernatant atılır ve RPMI,% 10 cenin sığır serumu (FBS) içinde pelletini. Toplam hücre sayısı göre 1 x 10 6 hücre / ml &#39;sağlayacak bir ses kullanın. </li><li> Sitospin merkezine bakan karton filtreler ile Sitospin uygun yuvalara mikroskop slaytlar ve filtreleri yerleştirin. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir sitosantrifüj olarak Sitospin ve santrifüj uygun kuyulara her bir numune 150 ul Pipet. </li><li> Ma göre, Romanowsky bir ticari kit kullanılarak boyanarak slaytlar Lekenufacturer talimatları ve daha önce 12 açıklandığı gibi. Adımları MPO aktivite analizi için 5,14-5,17 izleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 380 x g &#39;de BAL kalan hacmi santrifüj Süpernatant atılır ve hücreleri lize etmek için ultra-saf damıtılmış su içinde heksadesiltrimetilamonyum klorür,% 0.5 250 ul pelletini. Süspansiyon deneyi gerçekleştirmeden önce birkaç gün -20 ° C de dondurulabilir. </li><li> 30 ° C&#39;de 4 dakika ve numunenin aynı zamanda uygun seyreltmeleri, iyi ve eğer gerekli her iki kez örneği ekleyerek, 96 oyuklu plakalar içinde MPO deneyi gerçekleştirmek için süpernatan kullanım için 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Kuyularda her bir örneğe ekle 3,3 eşit hacimde &#39;, 5,5&#39; da peroksidaz için bir alt-tabaka olarak-tetrametilbenzidin (TMB). Renginde bir gelişme söz kadar reaksiyon, en az 5 dakika süreyle karanlıkta yer alan ve izin verin. </li><li> 2 MH 2 SO 4 ilave ederek reaksiyonu durdurunnd 450 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün. OD değeri peroksidaz aktivitesi ile doğrudan orantılı olacaktır. </li></ol> 6. Akciğer ve Sitokin Analizi Bakteriyel Yük Ölçümü <ol><li> Hemen BAL sıvı toplandıktan sonra, fare tüketim akciğerler, steril PBS ayrı lobları yıkayın steril 2 ml PBS ile bir yuvarlak alt tüp koyun ve buz üzerinde saklayın. NOT: sitokinler analiz edilecek ise, tüplere PBS proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> Aseptik akciğer homojenleştirmek, homojenattan küçük bir kısım (300 ul) almak, seri TSA plakaları üzerinde, plaka PBS içinde 1:10 seyreltilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Toplam hava yolu bakteriyel yük BAL sıvısı ve akciğer bulunan CFU toplamı olacaktır unutmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 xg&#39;de kalan Homojenat santrifüj -80 ° C de ELISA sitokin analizi için supernatant ve mağaza almak </li></ol> 7. Histolojik Sınav &lt;ol&gt; <li> Akciğer yönü ve özelliklerini korumak için, sadece BAL sıvısı tahsil edilmemiştir hangi akciğerler üzerinde histolojik analizi yapın. </li><li> CO 2 inhalasyon yoluyla fare Euthanize. </li><li> Cilt dikey kesik ile göğüs kafesi Açığa, diyafram keserek akciğerlerin ortaya çıkartılması. </li><li> Tüketim akciğerler, PBS içinde yıkayın lobları ayrı, ışıksız bir ortamda 4 ° C &#39;de 5-10 ml% 10 luk nötral tamponlu formalin (% 4 formaldehid) ve deposu içeren bir tüpe koydu. </li><li> Standart prosedürler kullanılarak parafin gömmek akciğerler. </li><li> Mikrotom ile 5 mikron kalınlığında kesitler kesti. </li><li> Hematoksilin ve eozin ile ve Leke slaytlar, standart prosedürlere göre, bir lamel ile slaytlar kapsamaktadır. </li><li> Ters bir aydınlık mikroskop kullanarak slaytları inceleyin ve bir kameraya mikroskop bağlayarak görüntü kazanır. </li></ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

P. kritik adımlar aeruginosa-boncuk hazırlama ve fare meydan aşağıda rapor edilmiştir. Farenin meydan okuma için kullanılan P. aeruginosa ırk kritiktir. Mortalite, kronik enfeksiyon veya açıklık meydan okuma için kullanılan bakteri suşuna bağlı olarak önemli ölçüde farklılık gösterebilir. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu...

Kistik fibrozis (CF) kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) gen mutasyonlarının neden olduğu genetik bir hastalıktır. Bu gen, en epitel hücrelerinin membranı üzerinde ifade edilen bir klorür kanal için kodlar. Bronşektazi, mukus tıkacı ve parankimal yıkım giderek ciddi akciğer hastalığı ve CF hastaların 1 çoğunda mortaliteye neden Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlar çoğunlukla neden oldu. Anlama CF patogenez ve yeni tedavilerin daha da geliştirilmesi CF karakteristik özellikleri ile hayvan modelinde güveniyor. Genetik CFTR geni değiştirilmiş çeşitli fareler, üretildi, ancak CF gibi akciğer hastalığı ve KF hastalarında görülen birçok diğer organ anormallikleri özetlemek için bu türlerin yeteneği sınırlamalar yaygın olarak 2 belgelenmiştir. Enfeksiyon gelişimi CF hayvan modelinde önemli sorunlardan biridir. Edebiyat clErken fareler, ağar, agaroz, alginat ya da yosun 3-5 gibi bir hareketsiz kılma maddesini içine gömülü bakteri ile aşılanır yalnızca bir aydan fazla süren bir kronik enfeksiyon elde edilebileceğini göstermektedir. Bu hareketsizleştirici maddeler, bakteriler Benzer CF hastalarında 6&#39;nın mukus büyümesine, mikrokoloniler şeklinde büyümeye izin mikroaerobik / anaerobik şartları sağlar. Kronik enfeksiyon Bu model hava yolu enflamasyonu ve hasara neden 7 akciğerlerde bakterilerin sürekli olmasına yol açmaktadır. Ancak, kullanılan yöntem, bakteri suşu ve akciğer aşılandı dozuna bağlı olarak, farklı zaman noktalarında akciğerlerde geri kronik enfekte edilmiş farelerin yüzdesi ve bakteri yükü önemli ölçüde farklı olabilir. Özellikle, uzun süreli kronik enfeksiyon için ana zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi belirten that bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir. P. seçerek CF bir koleksiyon aeruginosa RP73 klinik suş başarıyla C57Bl/6NCrl farelerde bir ay için istikrarlı bir bakteri yüküne kadar düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve kronik enfeksiyon yüksek oranda elde 8 ayırır. Bu kağıt P. gömmek için metodoloji detayları Agar boncuk aeruginosa, biz, trakea içine aşılanmasıyla fareleri enfekte akciğerlerde bakteri yükü ve sitokinler ölçülen, BAL sıvısı toplanır ve histolojik muayene gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol patogenez 8,9 tarihinde temelde önemli soruları ele P. karşı yeni tedaviler test araştırmacılarına yardımcı olacaktır aeruginosa kronik enfeksiyon 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Triptik Soya Suyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granül</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Ağır mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-Ketamin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Şırınga 25 G 5/8 inç&nbsp; 0,5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>Kateter 22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forseps - 0,5 mm Uçlar Kavisli</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Makas, İris, 11 cm, düz</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Sütür klipsleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Sütür iplik</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Komple proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Okuma 102 Burker tek kullanımlık hazne</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk çözeltisi</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ sitohuni</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky boyama seti</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hekzadesiltrimetilamonyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu ÇED/RIA plakası</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3 ',5,5'- Tetrametilbenzidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>%10 Nötr tamponlu formalin</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoksilen olmayan Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin plus alkollü çözelti</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>Shaking inkübatörü</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Sitosantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Maliyetli Isıtma Yastığı</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizasyon probu</td><td>Ystral</td><td>2366925(küçük)</td><td></td></tr><tr><td>Ters optik mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera (mikroskop)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Döner mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

uzun vadeli kronik<em&gt; pseudomonas aeruginosa</emfarelerde&gt; havayolu enfeksiyon

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Modelin kendisi ile ilgili endişeleri bir dizi olmasına rağmen, kronik solunum yolu enfeksiyonu fare modeli, kistik fibrozis (CF) araştırma önemli bir varlıktır. Yalnızca çok az sayıda rapor in vivo olarak uzun vadeli kronik enfeksiyon odaklı iken inflamasyon ve enfeksiyonun erken aşamaları yaygın olarak Pseudomonas aeruginosa agar-boncuk fare modeli kullanarak çalışılmıştır. Uzun süreli kronik enfeksiyon için temel zorluk P. tarafından düşük bakteriyel yük olmaya devam aeruginosa ve bakteri hücreleri giderek ev sahibi tarafından temizlenir belirten mücadeleden sonra enfekte olmuş fareler hafta düşük yüzdesi. Bu çalışma, farede etkili, uzun vadeli kronik enfeksiyon elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, P. katıştırma dayanır C57Bl/6NCrl farelerde trakea içi damlatma ardından in vitro agar-tanelerinde aeruginosa klinik suşları. Bilateral akciğer enfeksiyonu sev ile ilişkilikilo kaybı, ölüm, kronik enfeksiyon ve inflamatuar yanıt dahil eral ölçülebilir okuma-çıkışları. P. Bu nispeten daha düşük mortalite, daha ağır lezyonlar, ve daha yüksek kronik enfeksiyona neden beri aeruginosa RP73 klinik suşu PAO1 referans laboratuvar suşu tercih edildi. P. aeruginosa kolonizasyonu üç aydan fazla akciğer devam edebilir. Murin akciğer patolojisi ilerlemiş kronik akciğer hastalığı olan hastalarda CF benzediği. Bu fare modeli en yakın insan hastalığın seyrini taklit eden ve patojenez çalışmalarında ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.

Protokol P., doğru yapıldığında aeruginosa agar-boncuk 100-200 arasında mikron ölçmek ve bir slayt üzerinde agar-boncuk süspansiyon küçük bir hacim pipetleyerek bir ters ışık mikroskobu ile görülebilir. Şekil 1 &#39;de ayrıntılı olarak gösterildiği gibi tek bakteri hücreleri, agar boncuk olarak görebilir. P. seçimi agar-boncuk hazırlanmasında kullanılan aeruginosa ırk kritiktir. Şekil 2 ve Tablo 1 verileri...

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Bu prosedürün genel amacı, farelerde kalıcı ve uzun süreli kronik pseudomonas aerogen havayolu enfeksiyonu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle seçilen pseudomonas aerogen bakteri suşunun kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bakterilerin agar ve mineral yağı ile 50 °C'de karıştırılarak küçük agar boncukları içine gömülmesi ve ardından karışımın yavaş, sürekli karıştırma altında 4 °C'de soğutulmasıdır.Ardından, mineral yağ birkaç kez PBS ile yıkanarak uzaklaştırılır ve agar boncuklarından bir alikot homogenize edilip agar plaklarına ekilir. Bakteriyel içeriği belirlemek için son adım, kronik bir pseudomonas aerogen akciğer enfeksiyonu oluşturmak amacıyla, agar boncuk süspansiyonundan birkaç mikrolitrenin farelerin trakeasına enjekte edilmesidir. Nihayetinde, challenge sonrası farklı zaman noktalarında bronkoalveoler lavaj sıvısı ve akciğerler geri kazanılıp agar plaklarına ekilerek, kronik olarak enfekte olan farelerin yüzdesi ve hayatta kalan farelerin hava yollarındaki bakteriyel yük tespit edilebilir. Bu agar boncuk yöntemlerinin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farelerin yüksek bir yüzdesinde stabil, uzun süreli kronik bir enfeksiyona olanak tanıması ve böylece

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kalıcı kronik bakteriyel enfekte fare modelinin...

Kronik Salmonella Infected Fare Modeli

Kaynak: de Vries, C. R. , et.al. Kronik Pseudomonas aeruginosa yara enfeksiyonunun gecikmiş aşılama modeli. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, parlak bir film pansı ile kaplı iki tam kalınlıkta dorsal deri yarası taşıyan bir fareye parlayan Pseudomonas aeruginosa'nın gecikmeli aşılanmasını gösteriyor. Bu, biyofilm oluşumunu ve kronik enfeksiyonun oluşmasını kolaylaştırır. Düzenli biyolüminesans izleme, bakteri yükünün nicelendirilmesini ve enfeksiyon ilerlemesinin zamanla izlenmesini sağlar.

Kronik Pseudomonas aeruginosa cilt yarası enfeksiyonunun fare modeli geliştirilmesi 

Pseudomonas aeruginosa bakterisinin intratrakeal enjeksiyonu ile bir fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu model pnömoni sırasında akciğer hasarını taklit eder ve klinik olarak önemlidir.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Bu çalışmada art arda fareler için ozon yüksek konsantrasyonda açarak yeni bir kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hayvan modeli başarılı nesil açıklar.

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı manken tekrarlanan ozon maruz farelerde nesil

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

İmmün yetersiz farelerde kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için gecikmiş bir aşılama protokolünü tanımladık.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Bu el yazması, farelerde enfeksiyöz bir pnömoni modelinin oluşturulmasını ve bakteri yetiştirme ve intratrakeal damlatma yöntemleri ile birlikte yaralanma çözünürlüğünün ilgili karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bağışıklık ortamını değerlendirmek için yüksek boyutlu akış sitometrisi kullanan yeni bir yaklaşım da açıklanmaktadır.

Pnömoni Çözünürlüğünü Değerlendirmek için Deneysel Model

Fareler genellikle Mycobacterium abscessus enfeksiyonlarına karşı dirençlidir, bu da akciğer enfeksiyonlarına karşı çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin keşfedilmesini ve geliştirilmesini zorlaştırır. Burada, immünokompetan farelerde sürekli enfeksiyon sağladığı gösterilen bir aşı hazırlama ve intratrakeal enfeksiyon yöntemini açıklıyoruz.

İmmünkompetan Fareleri İntratrakeal Olarak Aşılamak için Agar Boncuğu Gömülü Mycobacterium abscessus'un Hazırlanması

Burada, Klebsiella pneumoniae'nin burun içi instasyonu yoluyla fare sepsis immünosupresyon modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz ve modeli çeşitli göstergelerle doğruluyoruz.

Bakterilerin Burun İçinden İnstasyonu Yoluyla Fare Sepsisiyle İmmünosupresyon Modelinin Oluşturulması

Öğrenin, farelerde kronik Pseudomonas aeruginosa solunum yolu enfeksiyonu oluşturmak için agar boncuk yöntemini. Bu teknik, bakteri yükünü bir aya kadar stabil tutarak kronik enfeksiyon araştırmalarını kolaylaştırır.

Uzun Vadeli Kronik

Daha fazla video keşfet