Uzun Vadeli Kronik

Bu prosedürün genel amacı, farelerde kalıcı ve uzun süreli kronik pseudomonas aerogen havayolu enfeksiyonu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle seçilen pseudomonas aerogen bakteri suşunun kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bakterilerin agar ve mineral yağı ile 50 °C'de karıştırılarak küçük agar boncukları içine gömülmesi ve ardından karışımın yavaş, sürekli karıştırma altında 4 °C'de soğutulmasıdır.

Ardından, mineral yağ birkaç kez PBS ile yıkanarak uzaklaştırılır ve agar boncuklarından bir alikot homogenize edilip agar plaklarına ekilir. Bakteriyel içeriği belirlemek için son adım, kronik bir pseudomonas aerogen akciğer enfeksiyonu oluşturmak amacıyla, agar boncuk süspansiyonundan birkaç mikrolitrenin farelerin trakeasına enjekte edilmesidir. Nihayetinde, challenge sonrası farklı zaman noktalarında bronkoalveoler lavaj sıvısı ve akciğerler geri kazanılıp agar plaklarına ekilerek, kronik olarak enfekte olan farelerin yüzdesi ve hayatta kalan farelerin hava yollarındaki bakteriyel yük tespit edilebilir. Bu agar boncuk yöntemlerinin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farelerin yüksek bir yüzdesinde stabil, uzun süreli kronik bir enfeksiyona olanak tanıması ve böylece bir aya kadar stabil bir bakteriyel yükün devamlılığını sağlamasıdır.

AGA yöntemi, fare akciğerinde bakterilerin mikro koloniler şeklinde büyümesine olanak tanıyan mikro aerobik koşulları sağlar. Kistik fibrozis hastalarının mukusundaki büyümeye benzer şekilde, bu yöntemler araştırmacıların kistik fibrozis ve diğer solunum yolu hastalıklarının patogenezine ilişkin temel soruları yanıtlamalarına ve kronik akciğer enfeksiyonuna neden olan Pseudomonas aeruginosa'ya karşı yeni tedavileri test etmelerine yardımcı olabilir. Bu yöntemler, Burkholderia cepacia veya Staphylococcus aureus dahil olmak üzere diğer patojenlerle kronik enfeksiyon oluşturmak, farklı patojenlerle ko-enfeksiyon sağlamak veya rekabet deneyleri gerçekleştirmek için de kullanılabilir; bu prosedür Postdoktora araştırmacısı [İsim] ve laboratuvarımdaki doktora öğrencisi Camil Riva tarafından demonstre edilmiştir. Farelere patojen verilmeden üç gün önce, -80 °C stok kültürden bir öze dolu Pseudomonas aeruginosa'yı tryptic soy agar plakasına ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün. Beş mililitre trypt soy broth içerisine inoküle edilmiş ve 37 °C'de, 200 RPM hızındaki çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edilmiş tek bir koloni seçin. Ertesi sabah, bakteriyel gece kültürü küçük bir alikotunu fosfat tamponlu salin içerisinde 1:50 oranında seyreltin. Ardından, 600 nanometre dalga boyunda optik yoğunluğu ölçün.

Ardından, yeni bir tüpe alınan 20 mililitre taze TSB içine bakteriyel süspansiyondan iki OD ekleyerek gece boyu büyütülen bakteri kültürünü seyreltin ve toplam 10 ila 50 OD değerine ulaşılana kadar, sarsıntılı bir inkübatörde 200 RPM'de yaklaşık üç ila dört saat boyunca 37 °C'de log fazına girene kadar inkübe edin. Pseudomonas aeruginosa log fazına ulaştığında, bakteriyel hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.700 ×g'de santrifüj ederek toplayın ve süpernatantı atın. Bundan sonra.

Bakteri peletini bir mililitre steril PBS içerisinde resüspande edin ve tamamen çözünene kadar iyice vorteksleyin. Ardından, bir mililitre bakteri süspansiyonunu 50 °C'ye önceden dengelenmiş dokuz mililitre sıvı TSA ile karıştırın. Bu karışımı 50 °C'ye önceden ısıtılmış ağır mineral yağına ekleyin.

Oda sıcaklığında hemen altı dakika boyunca karıştırın. Karıştırma işlemi yağda görünür bir girdap oluşturmalıdır. Ardından karışımı, minimum hızda 35 dakika karıştırarak dört °C'ye soğutun.

Ardından 20 dakika daha buz üzerinde bekletin. Sonrasında agar boncuklarını 50 mililitrelik falcon tüplerine aktarın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.700 ×g kuvvetinde santrifüjleyin.

Mineral yağı dikkatlice uzaklaştırın ve agar boncuk peletini steril PBS ile yıkayın. Üç yıkamadan sonra işlemi altı kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra boncuklar, santrifüj kullanmak yerine yer çekimi ile çöktürülebilir.

Agar boncuklarını 20 ila 30 mililitre PBS içinde aseptik olarak süspanse edin ve boncukların 0,5 mililitresini homojenleştirin. Ardından, homojenleştirilmiş boncukların 100 mikrolitresini 900 mikrolitre steril PBS içinde seyrelterek seri dilüsyon yapın. Boncukları 1:10 oranında, 10⁻⁶'ya kadar altı kez seyreltin.

Ardından, seyreltilmemiş örnekle birlikte seri dilüsyonları TSA plaklarına ekleyin. Örnekleri 10⁻⁶'ya kadar seyreltin ve plakları 37 °C'de inkübe edin. Bir ters ışık mikroskobu kullanarak birkaç farklı alanda boncuk çapını ölçün.

Farelere uygulama yapılmadan önce boncuk çapı 100 ile 200 mikron arasında olmalıdır. Agar boncuk süspansiyonundaki mililitre başına CFU sayısını belirlemek için TSA plaklarındaki koloni oluşturan birim sayısını sayın. Ardından, 50 µL'de 1 ila 2 × 10⁶'lık optimal bir inokuluma ulaşmak için agar boncuklarının hacmini mililitre başına 2 ila 4 × 10⁷ CFU olacak şekilde ayarlayın.

Ketamin ve ksilazin ile önceden anestezi uygulanmış altı ila sekiz haftalık erkek bir fareyi, bir ısıtma pedinin üzerine sırt üstü pozisyonda yerleştirin ve kürkünü %70 etanol ile dezenfekte edin. Deriye dikey bir kesi yaparak trakeayı açığa çıkarın. Ardından, trakeayı örten kasları ayırmak için cımbız kullanın.

Ardından, bir mililitrelik bir şırınga ile 50 µL'ye kadar agar boncuk süspansiyonu çekin. Bundan sonra, trakeayı bir kateterle entübe edin ve agar boncuk süspansiyonu içeren bir mililitrelik şırıngayı katetere bağlayın. Boncukların akciğere implante edilmesini sağlamak için şırınganın pistonunu nazikçe itin.

Ardından insizyonu sütür klipsleri kullanarak kapatın. Bu adımda, ötanize edilmiş fareyi sırt üstü pozisyona getirin ve kürkünü %70 ethanol ile dezenfekte edin.

Ardından, deriye dikey bir kesi yaparak trakeayı ve toraks kafesini açığa çıkarın. Daha sonra, diyaframı keserek akciğerleri açığa çıkarın. Cımbız yardımıyla trakeanın altına bir sütür ipi yerleştirin ve trakeayı bir kateterle entübe edin.

Ardından, kateteri trakeaya sabitlemek için sütür ipliğinin iki ucunu çekin; ipliği trakeanın etrafına dolamayın. Şimdi, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 1 mL hücre kültürü ortamı alın ve şırıngayı katetere bağlayın. Akciğerleri yıkamak için şırınganın pistonunu itin, sıvıyı hemen geri çekin ve 15 mL'lik bir tüpe aktararak saklayın.

Bu adımı toplam üç mililitre besiyeri ile üç kez tekrarlayın ve ardından akciğerlerin toplanması ve analizi için bronkoalveoler lavaj sıvısını buz üzerinde saklayın. Akciğerleri fareden çıkarın. Steril PBS ile durulayın.

Ardından lobları ayırın. İki mililitre steril PBS içeren yuvarlak tabanlı bir tüpe koyun ve buz üzerinde saklayın. Akciğerleri aseptik olarak ve seri şekilde homojenize edin.

Homojenatı PBS ile 1:10 oranında seyreltin. Ardından, seyreltilmemiş örnek de dahil olmak üzere seri dilüsyonları TSA plaklarına ekimleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. BAL sıvısını buzdan çıkarın ve ters ışık optik mikroskobu altında Turk çözeltisi ile 1:2 oranında seyreltin.

Diferansiyel hücre sayımı için bir Bürker hücre sayım odasındaki toplam hücre sayısını belirlemek amacıyla, BAL sıvısını 4 °C'de 8 dakika boyunca 330 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Ardından, süpernatanla uzaklaştırın ve peleti %10 fetal bovine serum içeren hücre kültür ortamında 1 milyon hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Mikroskop lamlarını ve filtreleri, karton filtreler merkeze bakacak şekilde cyto spin üzerindeki uygun yuvalara yerleştirin.

Her bir örnekten 150 µL'lik miktarları sitosin kuyucuklarına pipetleyin ve sitosantrifüj cihazında 300 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından hücre yayması gözlemlenmeli ve yayma boyandıktan sonra mikroskop altında diferansiyel sayım yapılmalıdır. Bu şekil, PAO1 referans suşu ve RP 73 ile yapılan Pseudomonas aeruginosa kronik enfeksiyonunun zaman seyrini göstermektedir.

Her bir zaman noktası için klinik suş. Histogramlar; kırmızı ile bakteremi tarafından tetiklenen ölüm oranını, gri ile sağkalımı veya beyaz ile enfeksiyondan kurtulan hayvanların yüzdesini ve yeşil ile kronik enfeksiyon oluşturabilenlerin yüzdesini temsil etmektedir. Pseudomonas aerogen RP 73 klinik suşu, PA oh one laboratuvar suşuna kıyasla kronik enfeksiyon oluşturmada daha etkilidir.

Hayatta kalan fareler belirtilen zaman noktalarında ötanize edilmiş ve akciğerler toplanmış, homojenize edilmiş ve bakteriyel yükü belirlemek için TSA plaklarında kültüre edilmiştir. Fare akciğerlerindeki P oh one ve RP 73 suşlarının büyüme eğrileri, enfeksiyondan üç gün sonraki bakteri miktarının P oh one için RP 73'e kıyasla daha yüksek olduğunu göstermektedir. Ardından, kronik enfeksiyonun yerleştiği yedinci günden itibaren, her iki suş için de bakteriyel yük akciğer başına 10⁴ ile 10⁵ CFU arasında stabilize olmuştur; RP 73 klinik suşu ile yedi günlük kronik enfeksiyondan sonra, BAL sıvısındaki inflamatuar hücre göçü değerlendirilmiştir.

RP 73 enfekte farelerde toplam lökosit sayısı, enfekte olmayan farelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. En fazla temsil edilen hücreler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kronik enfeksiyona verdiği belirgin yanıtı gösteren nötrofillerdir. Aşağıdaki kutuda, sitospin sonrası bir lam üzerindeki noktada görülen nötrofiller ve bir makrofaj oklarla belirtilmiştir.

Burada, rp. 73 klinik suşu ile yedi günlük kronik enfeksiyon sonrası fare akciğerlerinin histolojik kesitlerinde hematoksilin ve eozin boyaması gösterilmektedir; oklarla işaret edilen boncuklar bronş lümeninde ve bakteriyel hücrelerin mikro kolonileri gözlemlenebilir. Enfekte bölgelerde, bronşlar ve pulmoner parankim yoğun inflamatuar hücre göçü ile karakterizedir.

Enfekte olmamış bir farenin havayolları inflamatuar hücrelerden arınmışken, BES'in çapı ve nihai konsantrasyonu çok önemli ayrıntılardır. İyi bir sonuç elde etmek için, boncuk boyutunun soğutma aşamasındaki karıştırma hızından etkilendiğini ve başlangıçtaki bakteri miktarının boncukların nihai dilüsyonunu etkileyebileceğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, farelerde düşük mortalite ve yüksek kronik enfeksiyon oranıyla seyreden uygun bir pseudomona suşunun seçilmesi, kullanılan fare sayısını minimize edecektir.

Farelerin enfekte edilmesinin ardından bakteri sayımı gerçekleştirilir. Ayrıca, bakteriyel enfeksiyona karşı ülser yanıtını incelemek amacıyla; toplam ve diferansiyel hücre sayımı şeklinde inflamatuar yanıt, bronşiyal VIR düzeyi, sıvı sitokin analizi, meloperoksidaz analizi ve histolojik analizler yapılabilir. Pseudomonas gibi fırsatçı patojenlerle çalışmanın riskli olabileceğini unutmayın; eldiven giymek, bakterileri biyogüvenlik kabini altında işlemek ve steril teknikler kullanmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Uygun hayvan modellerinin geliştirilmesi, yeni antibakteriyel ve anti-inflamatuar moleküllerin preklinik testlerinin yapılmasına olanak sağlamıştır. Bu, kistik fibrozis veya diğer solunum yolu hastalıklarından etkilenen hastalarda akciğer enfeksiyonuna yönelik gelecekteki terapötik müdahaleler için önemli bir adımdır.