Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Bu prosedürün genel amacı, serebral anjiyogenez ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için embriyonik dört beyinden saf endotel hücre kültürleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle soyulma membranının soyulması ve embriyonik beyinlerden sefalonun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hasat edilen dokunun disosiasyonu, filtrasyonu ve sindirimi yoluyla tek hücreli bir süspansiyon üretmektir.

Üçüncü adım, CD 31 mikroboncukları kullanarak hücrelerin manyetik olarak etiketlenmesidir. Son adımlar ise, CD 31 etiketli hücrelerin manyetik ayrıştırma ile saflaştırılması ve ardından kültürlenmesidir. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi ve anjiyogenez analizleri yoluyla daha ileri çalışmalar için saf paraventriküler endotel hücre popülasyonları elde edilir.

Bu yöntem, hücresel ve moleküler mekanizmalara odaklanan çalışmalara fayda sağlayacaktır. Beyin analizleri için, ventriküler endotel hücre etkileşimlerinin ve nöronal hücre tipleriyle olan etkileşimlerinin aydınlatılmasında bir araç olarak hizmet edebilir. Ayrıca, terapötik analiz görevleri için muazzam bir potansiyel taşımaktadır.

Bu yöntemin gösterilmesi, embriyonik beyinden saf endotelyal hücre popülasyonlarının izole edilmesi ve kültüre edilmesiyle ilgili bazı teknik zorlukları ortadan kaldırmak açısından kritik öneme sahiptir. Bu protokol için, CD1 annelerden alınan E 15 yavruların kafalarını, bir stereoskop altında buz soğukluğundaki PBS içerisinde bulundurun. Beyinleri ince uçlu makas ve ince penset kullanarak çıkarın.

İyi bir diseksiyon kritik öneme sahiptir; bu beceri pratikle ve aletlerin mükemmel durumda olmasıyla kazanılır. Ardından, beyni sıkıca kavramak için pensetleri ve dış zarını soymak için mikro uçlu makasları kullanın. Bu adım prosedürün en zorlayıcı kısmıdır, ancak gerekli beceriler pratik yaptıkça gelişecektir.

Ardından mezensefalonu ve metensefalonu çıkarın. Sefalonu izole edin. Sonra, onu soyulmuş membranlardan arındırılmış bir şekilde, üzerinde 2 mL PBS bulunan ve buz üzerinde tutulan 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.

Tüm pençeleri tek bir kaba toplayın. Pençeleri bir bisturi ucuyla bir veya iki milimetrelik parçalar halinde doğramaya başlayın. Dokuyu, iki mililitre komple DMEM içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Topaklar kaybolana ve sütlü bir süspansiyon elde edilene kadar, bir mililitrelik pipetle tritre ederek dokuyu nazikçe ancak tamamen ayrıştırın. Süspansiyonu 800 ila 1000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın ve yeniden süspanse edin.

Peleti DS bir içeren DMEM içinde süspande edin. Şimdi, hücreleri nazik tritasyon kullanarak tekrar dissosiye edin ve santrifüj adımını tekrarlayın. Ardından, peleti ısıtılmış tamamlayıcı DMEM içinde yeniden süspande edin.

Süspansiyondaki hücreleri 70 mikronluk naylon bir süzgeçten süzün ve süzgeçte tutulan hücre kısımlarını toplayıp, kollajenaz ve dispaz içeren iki mililitre DMEM içerisinde daha fazla sindirin. Birkaç dakika bekleyin ve ardından dokuyu yıkayın. Santrifüjleme ve peletin DMEM ile yeniden süspansiyonu işlemlerini üç kez tekrarlayın; yıkanmış toplam örneği, buz üzerinde tutulan filtrat ile birleştirin.

Ardından, santrifüj kullanarak kombinasyonu tam DMEM ile yıkayın ve resüspansiyon yapın. Şimdi, bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin ve manyetik etiketleme işlemine geçin. Bu protokoldeki hacimler 10 milyon hücreye kadar uygundur; daha fazla hücre sayısı için miktarları orantılı olarak artırın.

Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 300 G'de 10 dakika santrifüj ederek başlayın, süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletine 90 µL soğutulmuş saflaştırma tamponu, ardından 10 µL CD 31 konjuge mikro boncuk ekleyin. Hücreleri 200 µL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve etiketlemenin spesifik kalması için süspansiyonu buzdolabında 15 dakika boyunca (daha uzun süre olmayacak şekilde) inkübe edin. Bir ila iki mL soğutulmuş saflaştırma tamponu ekleyip 300 G'de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL soğutulmuş saflaştırma tamponu içinde yeniden süspanse edin. Şimdi bir MS kolonunu max separatörün manyetik alanına yerleştirin. Ardından, kolonu oda sıcaklığındaki 500 µL saflaştırma tamponu ile yıkayın.

Ardından hücre süspansiyonunu kolona uygulayın. Bu işlem 20 milyon hücreye kadar uygundur. İşaretsiz hücreleri içeren tüm akış sıvısını toplayın ve atın.

Kolonu 500 µL saflaştırma tamponu ile üç kez yıkayın. Bir sonraki saflaştırma tamponu alıkotlarını eklemeden önce kolon rezervuarının boş olduğundan her zaman emin olun. Şimdi kolonu max separatörden çıkarın ve 15 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirin.

Kolona bir mililitre saflaştırma tamponu ekleyin ve beraberinde verilen pistonu kolon plakasına sıkıca iterek manyetik olarak işaretlenmiş hücreleri derhal dışarı yıkayın. Dışarı yıkanan hücreleri, Tip 1 kolajen ile önceden kaplanmış 35 milimetrelik bir kültür kabına alın.

Şimdi hücreleri, 37 °C'ye ayarlanmış, %95 oksijen ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde ECCM ile büyütün. Besiyerini her dört günde bir değiştirin. Kültür kabında büyüyen hücreleri her gün mikroskop altında gözlemleyin.

Faz kontrastlı ışık mikroskobu ile görüldüğü üzere, periventriküler endotel hücrelerin veya PVE CS'lerin fenotipik karakterizasyonu birinci günden 12. güne kadar değişiklik gösterir. Birinci günde kaba yapışan hücreler, beş ila sekiz gün arasında hücre bölünmesine özgü morfoloji sergiler. PVE CS'ler, endotel hücreler için tipik olan ve in vivo durumlarına daha yakın olan parke taşı benzeri bir morfolojiden iğ şeklinde bir morfolojiye geçiş yaparlar.

12. güne gelindiğinde, PVEC kültürü tam konfluense ulaşır. Koloniyi genişletmek için p vs kolayca subkültür edilebilir.

Endotel hücre kültürlerinin saflığı, aşağıdaki endotel hücre belirteçleri kullanılarak %100 olarak belirlenmiştir. ISO lectin, von Willbrand faktörü, CD 31 PE, cam-1 ve VE-cadherin. CD1 embriyolarından hazırlanan PV C'lerin yanı sıra endotel hücreleri GFP eksprese eden tie2-GFP embriyolarının yüksek büyütmeli görüntüleri, ortak parke taşı ve iğ şeklinde morfolojilerin yanı sıra bazı kolajen kaplı kültür kaplarında ince uzantılı poligonel morfolojileri göstermeden önce ISO lectin ile işaretlenmiştir. Matrigel yokluğunda pve, CS'ler, in vivo periventriküler vasküler ağın kendine özgü özelliğini andıran kafes yapıları oluşturmuştur.

Bu durum, pve. Cs'nin yüksek anjiyojenik potansiyelini yansıtmaktadır. 20.000 PVE CS'nin matris jel ile kaplanmış kültür kaplarına eklendiği bir anjiyogenez testi gerçekleştirilmiştir. Bu PV Cs'ler 18 saat içinde güçlü tüp oluşumu göstermiştir.

Q-dot nanokristaller ile CD1 embriyolarından izole edilen PV'lerin etiketlenmesi sayesinde; göç, hareketlilik morfolojisi, hücre fonksiyon analizleri ve in vivo deneyleri içeren pve CS'nin uzun süreli çalışması mümkün hale gelmektedir. Bu nanokristaller, canlı hücrelerin sitoplazmasına yoğun ve stabil bir floresan sağlar.

Pve EECS, hücre ışığı plazma membranı gibi hücre izleyicileri ile transfekte edilebilir. Canlı hücre görüntüleme deneylerinde hücre morfolojisinin net görselleştirilmesi için RFP back MAM 2.0 kullanılmıştır. Pve CS birkaç farklı ortamda kültüre edilmiş ve boyama öncesinde faz kontrast mikroskopisi ve ISO selektin ile hücre morfolojisi karşılaştırılmıştır.

ECCM'de büyütülen PV CS iğ şeklinde bir morfoloji sergiledi ve 12. güne kadar konfülent hale geldi; buna karşılık, sıçan beyin endotelyal hücre büyüme ortamında büyütülen pve CS çok uzamış bir morfoloji sergiledi ve 20. güne kadar konfülent hale geldi. Öte yandan, D-M-E-M-F 12 ortamında kültüre edilen PV CS, iğ oluşumu olmaksızın yalnızca yassı ve poligonal morfoloji gösterdi, çok hızlı büyüme sergiledi ve dördüncü güne kadar konfülent hale geldi.

Pve eecs, fenotip ve fonksiyon kaybı olmaksızın ECCM içerisinde üç pasaja kadar büyütülmüştür. Bu nedenle, PVEC kültürü için tercih edilen besiyeri ECCM'dir. Bu işlemde uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde gerçekleştirilirse üç saat içinde tamamlanabilir.

Periventriküler endotel hücrelerinin nöronal öncüllerle birlikte kültürü, yetişkin beyninden veya diğer kaynaklardan elde edilen endotel hücrelerine kıyasla nörojenezi ve nöronal migrasyonu çok daha iyi stimüle edebilir. Bu nedenle, birçok farklı senaryoda nörolojik fonksiyonların geri kazanılmasına yardımcı olmak için değerli olabilirler.