Name: Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Keşfedin, embriyonik ön beyinden endotel hücreleri izolasyonu ve kültürü yöntemiyle serebral anjiyogenez ve nörovasküler etkileşimleri inceleyin. CD31 mikroboncukları ile manyetik ayrıştırma kullanılan bu teknik, saf hücre popülasyonları elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Şizofreni Araştırmaları Ulusal İttifak ve Depresyon (NARSAD) Genç Araştırmacı Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri AV R01NS073635 hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Reaktifler ve Çözümleri hazırlanması <ol><li> 35 mm kültür çanağı Kaplama: Kolajen Tip 1 çözeltisi, 20 mM asetik asit (~ 100 mg protein / şişe) içinde bir sulu çözelti olarak temin edilir. Steril doku kültürü dereceli su kullanarak,% 0.01 &#39;lik bir konsantrasyona kadar çalışma kollajen çözeltisinin uygun bir hacmi ile seyreltilir. 1, oda sıcaklığında (RT) 3-4 saat boyunca kollajen çözeltisinin ml ya da 37 ° C arasında veya bir gece boyunca 2-8 ° C&#39;de kaplayın yemekler Kaplı çanak aşırı çözüm çıkarın ve bir gecede kurumasını bekleyin. Medya eklemeden önce doku kültürü dereceli su veya PBS ile çanak durulayın. Kaplı yemekler bir ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Tam Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) hazırlayın. (, 1 ml/100 ml konsantrasyonu 1x),% 10 FBS ve antibiyotik-antimikotik çözelti ile DMEM (500 mi) Ek. Tam DMEM iki ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Bir kısım DNase I (0.001 mg / ml) ile birlikte DMEM (50 mi) Hazırlama, (D olarak anılacaktırMEM-DNase I). </li><li> Kolajenaz ve dispaz (DMEM-collagenase/dispase olarak anılacaktır) (1 mg / ml) ile birlikte DMEM bir kısım (10 ml) hazırlayın. </li><li> EGF (5 ug) ile takviye edilmiş endotel hücre kültür ortamı (ECCM, 500 mi), hazırlama, ECGS (100 mg) ve antibiyotik-antimikotik çözelti 5 ul. ECCM iki ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Kullanmadan önce tüm medya Prewarm. </li><li> % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ile PBS, pH 7.2 Saflaştırma tamponu hazırlayın. Soğuk tampon Ol (2-8 ° C). </li></ol> 2. Telencephalon Embriyolar Dissekan Kaldırma Laboratuvar hayvanları kullanan tüm deneyler McLean Hastanesi hayvan bakım ve kullanım komiteleri tarafından onaylanan ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelere uygun edilmektedir. <ol><li> Zamanlanmış hamile CD1 fareleri (embriyonik gün 15) kullanın. Vajinal fiş keşif günü embriyonik gün 0 (E0) olarak kabul edilir. CD1 barajlar genellikle büyük ibrelerin üretmek, yani 10-12 embriyos hamile baraj bekleniyor. </li><li> Histerotomi için, Ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile anestezi hamile farelere. Farenin yaklaşık 20-30 g, bir 10 ml / kg Ketamin / Ksilazin anestetik çözeltisi 0,3 ml sunmak ve bu ağrı sağlar ve tehlikeli anestezik intraperitoneal enjeksiyonu sırasında az. Enjeksiyonlar için el kısıtlama kullanın. </li><li> Ayak tutam ile derin anestezi edin. Derin anestezi farelerden embriyolar çıkarın. Hemen anneden uzaklaştırılması üzerine her embriyo başını kesmek. Buz soğukluğunda PBS içinde steril Petri kaplarında embriyonik kafaları yerleştirin. </li><li> 2013 Sürümü: anestezik aşırı doz (130 mg / kg pentobarbital, ip), Hayvanların ötanazi AVMA Yönergeleri ile tutarlıdır ötenazi için bir yöntem ile hemen ötenazi histerektomi izleyin. </li><li> Stereo mikroskop altında, ince mikrotip makas ve ince forseps ile baş beyin kaldırmak. Not: Yüksek kaliteli bir teşrihiyon başarıyla embriyonik beyinden Pial membran kaldırmak için gereklidir. Bu uygulama ile elde edilir. Ince forseps ve mikrotip makas aynı zamanda iyi bir diseksiyon almak için önemli araçlardır. </li><li> Pial zardan soymak için beyin ve mikrotip makas bir tutuş elde etmek için forseps kullanabilir. Mesencephalon ve metencephalon çıkarın ve telencephalon izole. Buz içinde 2 ml PBS ile bir 35 mm kültür çanağı için her embriyolardan Pial içermeyen telencephalon aktarın. </li></ol> 3. Hücre İzolasyonu <ol><li> Bir neşter ile 1-2 mm parçalar halinde telencephalon kıyma ve tam DMEM 2 ml ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpüne doku toplamak. </li><li> Kümeleri kaybolur ve sütsü süspansiyon elde edilene kadar, 1 ml&#39;lik bir pipet ile yavaşça ancak iyice doku ayrıştırmaları. </li><li> Santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg&#39;de hücreleri ayrışmış. </li><li> Dikkatli ce ayırmak yavaşça DMEM-DNase I süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarınLLS tekrar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg&#39;de 1 ml pipet ve santrifüj kullanılarak. </li><li> Sıcak tam DMEM&#39;de pelletini. Steril bir 70 um naylon elekle filtre hücreleri. Süzülür hücreleri toplamak ve buz tutmak. </li><li> Meşin üzerinde tutulan hücreye bölümlerini toplamak ve oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca DMEM-collagenase/dispase (2 mi) ile daha da kolaylaştırırlar. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800-1.000 xg santrifüj yoluyla DMEM-DNase I hücreler 3 kez yıkayın. Adım 3.5, toplanan süzülmüş hücrelerle, bu hücreleri havuzda toplayın. Bitmiş DMEM ile bir kez toplam hücrelerin yıkayın. Hücre sayısı ve manyetik etiketleme adımları belirlemek için devam edin. Not: Bu manyetik etiketleme önce, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için önemlidir. </li></ol> 4. Manyetik Etiketleme <ol><li> Bu protokol, 10 7 hücrelerinin manyetik etiketleme göstermektedir. Hücre sayıları 10&#39;dan az 7, aynı reaktif hacmi kullanımı ve hücre sayıları 10&#39;dan büyük 7, tüm reaktif hacimlerini ve toplam birimler büyütmekbuna göre (örneğin 2 x 10 7 toplam hücre için, gösterilen tüm reaktiflerin iki hacmi kullanın). Buz içinde tüm reaktifler ve hücreler tutun. </li><li> Bir hemositometreyle ile hücre sayısını belirlemek. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Aspire tamamen yüzer. </li><li> CD31 mikro, 10 ul ve ardından hücre pelletine arıtma tamponu 90 μl/10 7 hücreleri ekleyin. Üretici tarafından sağlanan mikro-anti-fare CD31 monoklonal antikoru konjuge edilir. </li><li> İyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin. Not: Manyetik etiketleme sırasında yüksek sıcaklıklar ve / veya daha uzun bir enkübasyon süresi spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de arıtma tampon ve santrifüj 1-2 ml/10 7 hücreleri eklenerek hücreler yıkayın. Arıtma tampon 500 ul süpernatan ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın. Manyetik ayırma veya saflaştırma aşamasına geçin. </li></ol> 5. Puaralığında olacak şekilde yapılır <ol><li> MACS Ayırıcı manyetik alan MS sütun yerleştirin. </li><li> Arıtma tampon 500 ul ile sütun durulayın. </li><li> Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. Yüksek bir hücre sayısı sütunu tıkayabilir olarak MS kolona hücrelerin uygun sayıda yükleyin. Dikkat: Her MS sütun daha sütunları kullanmak, daha yüksek bir hücre sayısı için 2 x 10 7 hücre sayısını ağırlayacak. </li><li> Toplayın ve etiketsiz hücreleri içeren flow-through atın. </li><li> Arıtma tampon 500 ul üç kez sütun yıkayın. Yıkama adımları sırasında, kolon rezervuar müteakip arıtma tampon bölüntülerin eklemeden önce boş olduğundan emin olun. </li><li> MACS ayırıcı gelen sütun çıkarın ve 15 ml Falcon tüp üzerine yerleştirin. </li><li> Bir piston MS sütunu ile birlikte temin edilir. Pipet MS kolona ve hemen arıtma tampon 1 ml sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın. </li><li> Plaka celKollajen Tip 1 ile kaplanmış ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;ye ayarlanmış bir kuluçka ECCM hücreleri büyümek bir 35 mm kültür çanak ls. </li><li> Her dört gün orta değiştirin. Çanak konfluent olduğunda, 10-12 gün sonra deney ya da alt-kültür için PVECs kullanın. </li></ol> 6. PV ECS alt kültür <ol><li> ECCM çıkarın ve steril PBS içinde 1-2 ml PVECS olan tek tabaka durulayın. </li><li> Yavaşça hücre tek katmanının karşılamak için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1,5 ml ekleyin. </li><li> Inkübatör tabak dönmek. 5-7 dakika içinde, hücreler tabak yüzeyinden ayırır. </li><li> Hücreler müstakil hemen sonra tripsin inhibitörü eşit hacimde ve birkaç kez çiğnemek. </li><li> , Steril bir 15 ml Falcon tüpüne hücreleri aktarın. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpü. </li><li> Süpernatantı ve prewarmed ECCM 1 ml pelletini. </li><li> Kültür, im genişletilmesi için hücreleri tohumyaşlanma ya da başka deneyler. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

PVEC ait daha fazla fizyolojik olarak uygun nörovasküler etkileşimleri ilgili çalışma other doku kaynaklarından erişkin beyin endotel hücreleri ve EC &#39;den ve aynı zamanda tedavi edici potansiyele sahiptir. PVEC hazırlanması için, ölü hücrelerin CD31 mikro, için spesifik olmayan bağlamak olabilir çünkü iyi bir canlılığı elde etmek için hızlı çalışması için diseksiyon ile kritik bir başlangıçtır. Tek hücre süspansiyonu önce manyetik etiketleme aşamasından elde değilse, hücre kümeleri, sütunu yapışmasına neden olacaktı...

Anjiyogenezis, nöron ve nöronal göç merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirme, onarım ve rejenerasyon kritik olaylar. Çeşitli çalışmalar, zarif, endotel hücreleri, çözünebilir faktörleri serbest bırakılması yoluyla ve doğrudan temas ile nöronal proliferasyonu ve tersi uyardığını göstermiştir. Biz meraklı nöronal progenitorlar / nöral kök hücre, embriyonik beyninden izole ise bu çalışmaların çoğunda 1-3, bunlar yetişkin beyin, diğer yetişkin doku kaynakları, veya endotelyal hücre hatları ile endotel hücreleri ile kültürlenmiş olduğu bulundu. Bu kısmen embriyonik beyin endotel hücreleri popülasyonları saf izole edilmesi ve kültür ile ilgili teknik zorluklar nedeniyle olabilir. Ancak, anjiyogenez, nöron oluşumu, ve nöronal migrasyon, normal erişkin beyinde daha embriyonik beyinde daha sağlam büyüklükte emir meydana gelen eşzamanlı olaylardır. Embryoni ait periventriküler damar ağıc ön beyin (telencephalon) bazal ganglia primordiumunun içinde yer alan bir kaptan kaynaklanan ve embriyonik gün 11 (E11) 4,5 ile telencephalon dorsal ventral gelen düzenli bir gradyan şeklinde gelişir. Periventriküler damar ağı damarlarının Bu pleksus kökenleri, anatomik konumu, büyüme modelleri ve gelişim düzenlemesi 4,5 dayalı Pial gemiler farklıdır. Periventriküler anjiyogenez degrade yayılma yönü telencephalic enine nörogenetik degrade eşleşir. Telencephalon içinde, periventriküler anjiyogenez degrade ve göç GABA nöron degrade teğet yanı sıra mekansal 6 çakışıyor. Zamanlama ile ilgili olarak, anjiyojenez gradyan yaklaşık bir gün ile nörogenetik gradyanı ve GABA nöron gradyanı önceden olduğu. Böylece, periventriküler endotel hücreleri mekansal ve zamansal iyi telencephalic nörogenezi desteklemek için kritik ipuçları sağlamak için konumlandırılmış venöronal migrasyon 4,6. Bu nedenle, nöronal soylarının ve / veya nöronlarla kokültürü deneylerde embriyonik periventriküler endotel hücrelerinin kullanımı nörovasküler etkileşimlerin incelenmesinde ve nörodejeneratif hastalık veya iskemik / travmatik beyin hasarı tedavisi için yeni yollar geliştirmek için daha uygun bir modeli sağlayacaktır. Biz, epitel hücre bulaşma sınırlamak için değil, aynı zamanda moleküler ve periventriküler damar ağı 4,6 (Pial EC&#39;ler ayırmak adlandırılır PVECs) endotel hücrelerinden fonksiyonel olarak farklı olan Pial endotel hücreleri ayırmak için değil, sadece Pial membran kaldırma önemini vurgulamaktadır . Burada, biz rutin PVECs zengin ve saf verim elde etmek bizim laboratuvarımızda kullandığımız yöntem tarif. Bu endotel hücreleri, tek bir zaman ayarlı gebe fare izole edilmiş embriyonik forebrains hazırlanır. Onlar ileride kullanmak için başarılı bir şekilde, genişletilmiş alt kültürleri ve aşağı donmuş olabilir.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kollajen, sıçan kuyruğundan elde edilen Tip 1 solüsyonu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Kalite Biyolojikler</td><td>114057-131&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MS sütunu</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>CD31 mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>MACS çoklu stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 & mikro; m</td><td>BD Biyobilim</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiyotik ve antimikotik solüsyon</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kollajenaz / Dispas</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Kültür kabı</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tüpü&nbsp;</td><td>BD Biyobilim</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tüp</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ECCM kiti</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>Kiti, Endotel hücre büyüme takviyesi, EGF ve Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)</td> içerirBD <td>Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Sınıf Su Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>% 0.25 Tripsin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biyobilim</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight Plazma Membranı-RFP, BacMam 2.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biyotinile İzolektin B4 antikoru</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Von Willebrand faktörü</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI Vektör Laboratuvarları ile VECTASHIELD Sert Montaj Ortamı</td><td></td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Butler Schein Hayvan Sağlığı Temini</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Lloyd Laboratuvarları</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>İnce mikro uçlu makas</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

embriyonik ön beyin gelen endotel hücreleri İzolasyon ve kültürü

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embriyonik beyin endotel hücreleri anjiyogenez ve nörovasküler gelişim ve etkileşim çalışmasında önemli bir araç olarak hizmet edebilir. Embriyonik ön beyin, PIAL ve periventriküler iki damar ağları, mekansal farklı ve farklı kökenleri ve büyüme desenler var. Pial ve periventriküler damar ağlarından endotel hücreleri benzersiz gen ekspresyon profillerini ve işlevleri vardır. Burada embriyonik ön beyin (telencephalon) periventriküler damar ağı (PVECs) endotel hücrelerinin saf popülasyonlarının izolasyonu, kültür ve doğrulama için bir adım adım protokol mevcut. Bu yaklaşımda, embriyonik gün 15 farenin elde pial membran yoksun telencephalon, doğrandı kolajenaz / dispaz ile sindirilir ve tek bir hücre süspansiyonu içine mekanik olarak dağıtılabilir. PVECs güçlü bir manyetik kullanılarak mikro, konjüge anti-CD-31/PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanılarak hücre süspansiyonundan saflaştınlırayırma yöntemi. Bunlar birbirine karıştırılmış ve bundan başka, alt-kültürlenmiş olana kadar saflaştırılmış hücreler, endotelyal hücre kültür ortamı içinde 1 kollajen kaplı kültür tabakları üzerinde kültürlenmiştir. Faz-kontrast ışık mikroskobu ve floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir gibi PVECs, bu protokol sergi parkelerde ve iğ biçimli fenotipleri ile elde. PVEC kültürlerin saflığı endotel hücre belirleyicileri ile kurulmuştur. Bizim ellerde, bu yöntem güvenilir ve tutarlı PVECs saf popülasyonları verir. Bu protokol, ön beyin anjiyojenezde içine mekanik bakış açısı kazanıyor PVEC etkileşimleri ve nöronal hücre tipleri ile çapraz görüşmeleri anlayış ve terapötik anjiyogenez için muazzam bir potansiyele sahiptir hedefleyen çalışmaları yararlanacaktır.

Günde 1-12 dan PVECs fenotipik karakterizasyonu faz kontrast mikroskopisi ile (Şekil 2) ile gösterilir. Hücre bölünmesi (Şekil 2A) 1. gün gösteri morfolojisi karakteristik çanak bağlı hücreler. 5-8 gün arasında, taş taş PVECs geçiş endotel hücreleri ve (Şekil 2B ve 2C) ile in vivo duruma daha yakındır için tipik şekilli morfolojiye mili için. 12. günde kültür tarafından PVEC tam izdiham (Şekil 2B) elde edilir. PVECs koloni <str...

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Bu prosedürün genel amacı, serebral anjiyogenez ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için embriyonik dört beyinden saf endotel hücre kültürleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle soyulma membranının soyulması ve embriyonik beyinlerden sefalonun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hasat edilen dokunun disosiasyonu, filtrasyonu ve sindirimi yoluyla tek hücreli bir süspansiyon üretmektir.Üçüncü adım, CD 31 mikroboncukları kullanarak hücrelerin manyetik olarak etiketlenmesidir. Son adımlar ise, CD 31 etiketli hücrelerin manyetik ayrıştırma ile saflaştırılması ve ardından kültürlenmesidir. Nihayetinde, immünofloresan mikroskopi ve anjiyogenez analizleri yoluyla daha ileri çalışmalar için saf paraventriküler endotel hücre popülasyonları elde edilir.Bu yöntem, hücresel ve moleküler mekanizmalara odaklanan çalışmalara fayda sağlayacaktır. Beyin analizleri için, ventriküler endotel hücre etkileşimlerinin ve nöronal hücre tipleriyle olan etkileşimlerinin aydınlatılmasında bir araç olarak hizmet edebilir. Ayrıca, terapötik analiz görevleri için muazzam bir potansiyel taşımaktadır.Bu yöntemin gösterilmesi, embriyonik beyinden saf endotelyal hücre popülasyonlarının izole edilmesi ve kültüre edilmesiyle ilgili bazı teknik zorlukları ortadan kaldırmak açısından kritik öneme sahiptir. Bu protokol için, CD1 annelerden alınan E 15 yavruların kafalarını, bir stereoskop altında buz soğukluğundaki PBS içerisinde bulundurun. Beyinleri ince uçlu makas ve ince penset kullanarak çıkarın.İyi bir diseksiyon kritik öneme sahiptir; bu beceri pratikle ve aletlerin mükemmel durumda olmasıyla kazanılır. Ardından, beyni sıkıca kavramak için pensetleri ve dış zarını soymak için mikro uçlu makasları kullanın. Bu adım prosedürün en zorlayıcı kısmıdır, ancak gerekli beceriler pratik yaptıkça gelişecektir.Ardından mezensefalonu ve metensefalonu çıkarın. Sefalonu izole edin. Sonra, onu soyulmuş membranlardan arındırılmış bir şekilde, üzerinde 2 mL PBS bulunan ve buz üzerinde tutulan 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.Tüm pençeleri tek bir kaba toplayın. Pençeleri bir bisturi ucuyla bir veya iki milimetrelik parçalar halinde doğramaya başlayın. Dokuyu, iki mililitre komple DMEM içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Topaklar kaybolana ve sütlü bir süspansiyon elde edilene kadar, bir mililitrelik pipetle tritre ederek dokuyu nazikçe ancak tamamen ayrıştırın. Süspansiyonu 800 ila 1000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın ve yeniden süspanse edin.Peleti DS bir içeren DMEM içinde süspande edin. Şimdi, hücreleri nazik tritasyon kullanarak tekrar dissosiye edin ve santrifüj adımını tekrarlayın. Ardından, peleti ısıtılmış tamamlayıcı DMEM içinde yeniden süspande edin.Süspansiyondaki hücreleri 70 mikronluk naylon bir süzgeçten süzün ve süzgeçte tutulan hücre kısımlarını toplayıp, kollajenaz ve dispaz içeren iki mililitre DMEM içerisinde daha fazla sindirin. Birkaç dakika bekleyin ve ardından dokuyu yıkayın. Santrifüjleme ve peletin DMEM ile yeniden süspansiyonu işlemlerini üç kez tekrarlayın; yıkanmış toplam örneği, buz üzerinde tutulan filtrat ile birleştirin.Ardından, santrifüj kullanarak kombinasyonu tam DMEM ile yıkayın ve resüspansiyon yapın. Şimdi, bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin ve manyetik etiketleme işlemine geçin. Bu protokoldeki hacimler 10 milyon hücreye kadar uygundur; daha fazla hücre sayısı için miktarları orantılı olarak artırın.Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 300 G'de 10 dakika santrifüj ederek başlayın, süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletine 90 µL soğutulmuş saflaştırma tamponu, ardından 10 µL CD 31 konjuge mikro boncuk ekleyin. Hücreleri 200 µL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve etiketlemenin spesifik kalması için süspansiyonu buzdolabında 15 dakika boyunca (daha uzun süre olmayacak şekilde) inkübe edin. Bir ila iki mL soğutulmuş saflaştırma tamponu ekleyip 300 G'de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 500 µL soğutulmuş saflaştırma tamponu içinde yeniden süspanse edin. Şimdi bir MS kolonunu max separatörün manyetik alanına yerleştirin. Ardından, kolonu oda sıcaklığındaki 500 µL saflaştırma tamponu ile yıkayın.Ardından hücre süspansiyonunu kolona uygulayın. Bu işlem 20 milyon hücreye kadar uygundur. İşaretsiz hücreleri içeren tüm akış sıvısını toplayın ve atın.Kolonu 500 µL saflaştırma tamponu ile üç kez yıkayın. Bir sonraki saflaştırma tamponu alıkotlarını eklemeden önce kolon rezervuarının boş olduğundan her zaman emin olun. Şimdi kolonu max separatörden çıkarın ve 15 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirin.Kolona bir mililitre saflaştırma tamponu ekleyin ve beraberinde verilen pistonu kolon plakasına sıkıca iterek manyetik olarak işaretlenmiş hücreleri derhal dışarı yıkayın. Dışarı yıkanan hücreleri, Tip 1 kolajen ile önceden kaplanmış 35 milimetrelik bir kültür kabına alın.Şimdi hücreleri, 37 °C'ye ayarlanmış, %95 oksijen ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde ECCM ile büyütün. Besiyerini her dört günde bir değiştirin. Kültür kabında büyüyen hücreleri her gün mikroskop altında gözlemleyin.Faz kontrastlı ışık mikroskobu ile görüldüğü üzere, periventriküler endotel hücrelerin veya PVE CS'lerin fenotipik karakterizasyonu birinci günden 12. güne kadar değişiklik gösterir. Birinci günde kaba yapışan hücreler, beş ila sekiz gün arasında hücre bölünmesine özgü morfoloji sergiler. PVE CS'ler, endotel hücreler için tipik olan ve in vivo durumlarına daha yakın olan parke taşı benzeri bir morfolojiden iğ şeklinde bir morfolojiye geçiş yaparlar.12. güne gelindiğinde, PVEC kültürü tam konfluense ulaşır. Koloniyi genişletmek için p vs kolayca subkültür edilebilir.Endotel hücre kültürlerinin saflığı, aşağıdaki endotel hücre belirteçleri kullanılarak %100 olarak belirlenmiştir. ISO lectin, von Willbrand faktörü, CD 31 PE, cam-1 ve VE-cadherin. CD1 embriyolarından hazırlanan PV C'lerin yanı sıra endotel hücreleri GFP eksprese eden tie2-GFP embriyolarının yüksek büyütmeli görüntüleri, ortak parke taşı ve iğ şeklinde morfolojilerin yanı sıra bazı kolajen kaplı kültür kaplarında ince uzantılı poligonel morfolojileri göstermeden önce ISO lectin ile işaretlenmiştir. Matrigel yokluğunda pve, CS'ler, in vivo periventriküler vasküler ağın kendine özgü özelliğini andıran kafes yapıları oluşturmuştur.Bu durum, pve. Cs'nin yüksek anjiyojenik potansiyelini yansıtmaktadır. 20.000 PVE CS'nin matris jel ile kaplanmış kültür kaplarına eklendiği bir anjiyogenez testi gerçekleştirilmiştir. Bu PV Cs'ler 18 saat içinde güçlü tüp oluşumu göstermiştir.Q-dot nanokristaller ile CD1 embriyolarından izole edilen PV'lerin etiketlenmesi sayesinde; göç, hareketlilik morfolojisi, hücre fonksiyon analizleri ve in vivo deneyleri içeren pve CS'nin uzun süreli çalışması mümkün hale gelmektedir. Bu nanokristaller, canlı hücrelerin sitoplazmasına yoğun ve stabil bir floresan sağlar.Pve EECS, hücre ışığı plazma membranı gibi hücre izleyicileri ile transfekte edilebilir. Canlı hücre görüntüleme deneylerinde hücre morfolojisinin net görselleştirilmesi için RFP back MAM 2.0 kullanılmıştır. Pve CS birkaç farklı ortamda kültüre edilmiş ve boyama öncesinde faz kontrast mikroskopisi ve ISO selektin ile hücre morfolojisi karşılaştırılmıştır.ECCM'de büyütülen PV CS iğ şeklinde bir morfoloji sergiledi ve 12. güne kadar konfülent hale geldi; buna karşılık, sıçan beyin endotelyal hücre büyüme ortamında büyütülen pve CS çok uzamış bir morfoloji sergiledi ve 20. güne kadar konfülent hale geldi. Öte yandan, D-M-E-M-F 12 ortamında kültüre edilen PV CS, iğ oluşumu olmaksızın yalnızca yassı ve poligonal morfoloji gösterdi, çok hızlı büyüme sergiledi ve dördüncü güne kadar konfülent hale geldi.Pve eecs, fenotip ve fonksiyon kaybı olmaksızın ECCM içerisinde üç pasaja kadar büyütülmüştür. Bu nedenle, PVEC kültürü için tercih edilen besiyeri ECCM'dir. Bu işlemde uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde gerçekleştirilirse üç saat içinde tamamlanabilir.Periventriküler endotel hücrelerinin nöronal öncüllerle birlikte kültürü, yetişkin beyninden veya diğer kaynaklardan elde edilen endotel hücrelerine kıyasla nörojenezi ve nöronal migrasyonu çok daha iyi stimüle edebilir. Bu nedenle, birçok farklı senaryoda nörolojik fonksiyonların geri kazanılmasına yardımcı olmak için değerli olabilirler.

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu video, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve enzimatik sindirim yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak bir sıçan beyninden mikro damarların izolasyonunu sunar. İzole edilen mikro damarlar, endotel hücre kolonileri elde etmek için kollajen ve fibronektin matrisi ile önceden kaplanmış bir kültür şişesinde kültürlenebilir.

Sıçan Beyin Mikrodamarlarından Endotel Hücre Kültürü: Sıçan Beyninin Mikro Damarlarından Endotel Hücrelerini İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin beyin endotel hücrelerine farklılaşmasını indüklemek için bir protokolü göstermektedir.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Endotel Hücrelerinin Üretilmesi

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Genetik olarak tasarlanmış fare modellerinden primer tümöre özgü endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir bir yöntem bildiriyoruz.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Keşfedin, embriyonik ön beyinden endotel hücreleri izolasyonu ve kültürü yöntemiyle serebral anjiyogenez ve nörovasküler etkileşimleri inceleyin. CD31 mikroboncukları ile manyetik ayrıştırma kullanılan bu teknik, saf hücre popülasyonları elde etmeyi sağlar.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Daha fazla video keşfet