SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sentetik mikrovasküler ağlar kullanılarak yapılan tek bir deneyden hücre parçacık yapışmasının saf bir yapışma haritasını elde etmektir. Bu, ilk önce mikroakışkan cihazın, bu durumda avadon ile ilgilenilen protein ile kaplanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, biyotinile partiküller, yerel kesme hızlarına bağlı olarak avadon kaplı cihaza diferansiyel desenlerle bağlanan fizyolojik kesme hızlarında cihaza enjekte edilir.

Daha sonra, ağdaki saf hız değerlerinin hesaplamalı olarak oluşturulmuş bir veritabanını kullanarak parçacıkların saf bir yapışma haritasını oluşturmak için bağlı parçacıkların sayısı sayılır. Sonuçlar, tek bir deneyden tam bir yapışma haritasının elde edilebileceğini ve bunun da geleneksel paralel plaka akış odalarına kıyasla önemli ölçüde zaman ve reaktif tasarrufu sağladığını göstermektedir. Bu teknolojinin doğrusal akış kanalları gibi mevcut yöntemlere göre birincil avantajı, tek bir deneyden paylaşılan haritalar oluşturabilmemiz ve bunun sonucunda maliyet ve zamandan önemli bir tasarruf sağlamamızdır.

Bu yöntem, ilaç dağıtım araçlarının istenen hedeflere bağlanma yeteneği gibi ilaç dağıtımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, hücreye özgü lezyonu anlamak için paddle plate akış odalarını kullanırken aklımıza geldi. Bununla birlikte, sıvı koşulları altında, bu testin odak noktası, parçacık ve hücre yapışması hakkında temel bilgiler sağlamaktır.

syn vivo platformu, kanser ve CNS iletimi, enfeksiyon ve inflamasyon trombozu ve mikrosirkülasyon disfonksiyonu gibi çeşitli diğer sistemlere uygulanabilir. Mikro akışkan cihaz adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, küçük numune hacimlerine alışıldığından ve kabarcık oluşumunu önlemek için en iyi uygulamalar görsel olarak daha iyi iletildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir araştırma bilimcisi olan Ashley Smith olacak.

SynVivo SMN mikroakışkan cihazı, biri yüzey kaplamasında akış, parçalar ve/veya oturma için hücreler ve diğeri tahlili çalıştırmak için olmak üzere iki paralel port setinden oluşur. Başlamak için, cihazı steril deiyonize su içeren bir Petri kabına daldırın ve kabı bir vakuma yerleştirin. Kurutucu Cihazın kanallarından tüm hava çıkana kadar kurutucunun çalışmasına izin verin.

Bu, cihazı sudan çıkarmadan önce yaklaşık 15 dakika sürmelidir. Cihazın her bir portuna suyla astarlanmış tigon borusunu yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın. Boru yaklaşık bir inç uzunluğunda olmalıdır.

Cihaz artık bir pipet veya şırınga kullanılarak sudan çıkarılabilir. Bir giriş portu borusunun tabanının etrafına bir damla su koyun. Hortumu dikkatlice çıkarın.

Su damlası, havanın cihaza girmesini önleyecektir. Daha sonra, mililitre başına 20 mikrogram konsantrasyonda avadon yüklü bir mililitre şırınga hazırlayın. Şırıngayı 24 gauge paslanmaz çelik iğneye ve boruya bağlayın Clamp bir çene kelepçesi ile kullanılmayan giriş portunu.

Hortumu cihazın giriş portuna yerleştirin. Cihazın tam perfüzyonunu sağlamak için 10 dakika boyunca dakikada bir mikrolitre akış hızında avadon enjekte edin. Akış süresinin sonunda.

Tüm boruları çene kelepçeleri ile kelepçeleyin ve cihazı gece boyunca dört dereceye yerleştirin. Cihazın oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Ardından cihazı, motorlu bir sahne ve yüksek performanslı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin.

Fosfat, tampon, salin veya PBS'de mililitre başına 5 milyon parçacık konsantrasyonunda iki mikron biyotinile edilmiş parçacıktan oluşan bir çözelti hazırlayın. Parçacıkları bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. İkinci bir mililitrelik PBS şırıngası hazırlayın.

Her şırıngayı yalnızca bir şırınga pompasına yükleyin ve ardından bunları bir pipetleyici şırınga kullanarak iğneye ve boruya bağlayın. Giriş portu borusunun tabanının etrafına bir damla su damlatın ve cihazı kaplamak için kullanılan boruyu dikkatlice çıkarın. Biyotinile parçacıklar ve PBS için boruyu giriş portlarının her birine dikkatlice yerleştirin.

Daha sonra biyotinile partikülleri dakikada 2,5 mikrolitre akış hızında enjekte etmeye başlayın. Parçacıkların ilk belirtisinde mikroskop üzerindeki giriş portunu izleyin. Zamanlayıcıyı başlatın ve üç dakika boyunca akışa devam edin.

Üç dakikanın sonunda, dakikada 2,5 mikrolitrelik bir akış hızında PBS akışını başlatırken aynı anda biyotinile partiküllerin akışını durdurun. Bağlanmamış parçacıkları yıkamak için PBS'nin cihazda üç dakika boyunca akmasına izin verin. Edinime başlamak için, tüm cihazın görüntüsünü elde etmek için görüntüleme yazılımındaki büyük görüntüyü tara işlevini kullanın, ardından sırayla cihazdaki çatallanmaları numaralandırın ve kanalların çapının iki katı olan dairesel bir ilgi alanı oluşturun.

Bu durumda, kanal çapı 100 mikron olduğu için ilgilenilen alan çapını 200 mikron olarak ayarlayın. İlgilenilen her alandaki parçacık sayısını bir elektronik tabloya aktarmak için görüntüleme yazılımındaki otomatik sayım işlevini kullanın. Aynı şekilde, tüm cihazdaki parçacık sayısını dışa aktarmak için otomatik hesap özelliğini kullanın.

CFD simülasyonları çalıştırılır ve sonuçlar daha fazla analiz için bir veritabanında saklanır. Sonuçlarda yer alan bilgiler, duvar kesme hızlarını, hız parçacık akısını ve cihaza yapışmayı içerir. Buradaki bilgiler, bir parçacık konsantrasyonunun tanımlanmış bir girdisi verildiğinde, her bir ilgi alanına yapışan parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılır.

Bir kayma yapışma haritası oluşturmak için, son adım olarak metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yapışma yüzdesini hesaplayın. Ağların her çatallanmasındaki saf oranı ve yapışma yüzdesi değerlerini kullanarak saf yapışma haritasını çizin. Bu görüntü, iki mikron biyotinile partikülün bağlanmasını takiben tipik bir avidan kaplı syn vivo SMN cihazını göstermektedir.

Parçacıkların tercihen ağdaki çatallanmaların yakınına yapıştığına dikkat edin. Syn vivo SMN ağındaki numaralandırılmış çatallanmalar burada görülebilir. Bu görüntü, cihazın CFD modeli tarafından oluşturulan örnek duvar kesme haritasıdır.

Kesme hızı, mikro damar sisteminde in vivo olarak gözlemlendiği gibi 250 ters saniye ile 15 ters saniye arasında değişen cihaz içinde değişir. Bu değişen kesme hızlarının, her akış hızı için sabit bir kesme hızı sağladıkları için doğrusal mikroakışkan kanallarda aynı anda elde edilemeyeceğini unutmayın. Ağın çatallanmalarının her birindeki kesme hızı değerlerinin burada gösterilen grafiği, kesme hızı modellerinin karmaşık olduğunu ve doğrusal akış kanallarının aksine basit bir analitik ilişki ile elde edilemeyeceğini ortaya koymaktadır.

Ayrıca, ağda aynı çöp kutusuna düşen birden fazla çatallanma mevcuttur. Gösterilen verilerin istatistiksel güvenilirliğine katkıda bulunmak. Deney ağının dallarındaki ve çatallanmalarındaki parçacık akışlarını hesaplamak için kullanılan ağdaki parçacık akıları için CFD analizinin örnek sonuçları aşağıda verilmiştir.

Tek bir syn vivo SMN deneyinden hesaplanan saf yapışma haritası, doğrusal kanal deneylerinden elde edilen saf yapışma haritalarından gözlemlenen ters ilişkiyi takip eder. Bununla birlikte, bir SynVivo tahlili kullanılarak, tek bir deney bu saf haritanın oluşturulmasına izin verirken, doğrusal kanallardan birden fazla deney çalışması elde edilir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir deneyden paylaşılan yapışmayı oluşturmak için SynVivo SMN cihazlarının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu deneyi gerçekleştirirken, geliştirildikten sonra SynVivo SMN mikroakışkan cihazına kabarcıklar sokmamayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, inflamasyon alanındaki araştırmacıların tek bir deneyde lökosit endotel etkileşimini farklı oranlarda incelemelerinin yolunu açtı. Yeni nesil cihazlarda, araştırmacılar lökosit yuvarlanma yapışmasını ve göçünü tek bir tahlilde inceleyebilirler, bu şu anda mümkün olmayan bir şeydir.

Bu prosedürü takiben, akışın hücre hücresi üzerindeki fizyolojik etkisi, hücre ilacı ve ilaç aracı yapışması gibi soruları araştırmak için ilaçların, ilaç taşıyıcı araçların ve hücrelerin yapışmasını araştıran diğer yöntemler uygulanabilir.