SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sentetik mikrovasküler ağlar kullanarak tek bir deneyden hücre partikül adezyonuna yönelik bir kayma adezyon haritası elde etmektir. Bu, öncelikle mikroakışkan cihazın, bu durumda avadon olan ilgili proteinle kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, biyotinillenmiş partiküller fizyolojik kayma hızlarında cihaza enjekte edilir; bu partiküller, yerel kayma hızlarına bağlı olarak farklı desenlerle avadon kaplı cihaza bağlanır.

Ardından, ağdaki hesaplamalı olarak oluşturulmuş kayma hızı değerleri veri tabanını kullanarak partiküllerin kayma adezyon haritasını oluşturmak için bağlanan partikül sayısı sayılır. Sonuçlar, tek bir deneyden kayma adezyon haritası elde edilebildiğini, bunun da geleneksel paralel plaka akış odalarına kıyasla zaman ve reaktiflerde önemli tasarruflar sağladığını göstermektedir. Bu teknolojinin lineer akış kanalları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek bir deneyden kayma haritaları oluşturabilmemizdir; bu da maliyet ve zamanda önemli bir tasarruf sağlar.

Bu yöntem, ilaç taşıyıcı araçların istenen hedeflere bağlanma yeteneği gibi, ilaç iletimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, hücrelerin partiküler lezyonlarını anlamak için pedal plakalı akış hücreleri kullandığımız sırada ortaya çıktı. Akışkan koşullar altında olsa da bu deneyin odak noktası, partikül ve hücre adezyonu hakkında temel bilgiler sağlamaktır.

Syn vivo platformu; kanser ve MSS iletimi, enfeksiyon ve inflamasyon, tromboz ve mikrosirkülasyon disfonksiyonu gibi çeşitli diğer sistemlere uygulanabilir. Mikroakışkan cihaz adımlarının öğrenilmesinin zor olması, küçük örnek hacimlerine alışma süreci ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için en iyi uygulamaların görsel olarak daha iyi aktarılması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü laboratuvarımızdan araştırma bilimcisi Ashley Smithle gösterecektir.

SynVivo SMN mikroakışkan cihazı, biri yüzey kaplama, fonksiyonel gruplar ve/veya yerleştirilecek hücrelerin akışı için, diğeri ise analizleme işlemi için kullanılan iki set paralel porttan oluşur. Başlamak için cihazı, steril deiyonize su içeren bir Petri kabına tamamen batırın ve kabı vakuma yerleştirin. Cihaz kanallarındaki tüm hava boşalana kadar vakumlama işlemine devam edin.

Cihaz sudan çıkarılmadan önce bu işlemin yaklaşık 15 dakika sürmesi gerekir. Suyla önceden doldurulmuş tigon tüplerini cihazın her bir portuna yerleştirmek için ince uçlu pensler kullanın. Tüplerin uzunluğu yaklaşık bir inç olmalıdır.

Cihaz artık bir pipet veya şırınga kullanılarak sudan çıkarılabilir. Bir giriş portu borusunun tabanının etrafına bir damla su yerleştirin. Boruyu dikkatlice çıkarın.

Su damlası, cihaza hava girişini önleyecektir. Ardından, 20 µg/mL konsantrasyonda avadon yüklü bir mililitrelik bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı 24 gauge paslanmaz çelik bir iğneye ve hortuma bağlayın. Kullanılmayan giriş portunu bir mengeneyle sıkıştırın.

Boruyu cihazın giriş portuna yerleştirin. Cihazın tamamen perfüzyonuna izin vermek için 10 dakika boyunca dakikada bir microliter akış hızında avadon enjekte edin. Akış süresinin sonunda.

Tüm tüpler pencere tipi kelepçelerle sıkıştırın ve cihazı gece boyunca dört derecede bekletin. Cihazın oda sıcaklığına gelmesini sağlayın. Ardından cihazı, motorize sahne ve yüksek performanslı bir kamera ile donatılmış ters bir floresan mikroskobuna yerleştirin.

Fosfat tamponlu salin veya PBS içerisinde, mililitrede 5 milyon partikül konsantrasyonunda, iki mikronluk biotinillenmiş partiküllerden oluşan bir çözelti hazırlayın. Partikülleri bir mililitrelik bir şırıngaya doldurun. PBS içeren ikinci bir mililitrelik bir şırınga daha hazırlayın.

Her bir şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin ve ardından bir pipet şırıngası kullanarak bunları iğneye ve tüplere bağlayın. Giriş portu tüpünün tabanına bir damla su damlatın ve cihazı kaplamak için kullanılan tüpü dikkatlice çıkarın. Biotinize partiküller ve PBS için olan tüpleri dikkatlice her bir giriş portuna yerleştirin.

Ardından, 2,5 µL/dak akış hızıyla biyotinillenmiş partikülleri enjekte etmeye başlayın. Partiküllerin ilk belirtisi göründüğünde mikroskoptaki giriş portunu izleyin. Zamanlayıcıyı başlatın ve akışı üç dakika boyunca sürdürün.

Üç dakikanın sonunda, eş zamanlı olarak 2,5 µL/dakika akış hızıyla PBS akışını başlatırken biyotinillenmiş partiküllerin akışını durdurun. Bağlanmamış partikülleri yıkamak için PBS'nin cihaz içerisinde üç dakika boyunca akmasına izin verin. Görüntüleme işlemine başlamak için, görüntüleme yazılımındaki geniş alan tarama (scan large image) fonksiyonunu kullanarak tüm cihazın görüntüsünü alın; ardından sırasıyla cihazdaki çatallanmaları numaralandırın ve kanalların çapının iki katı büyüklüğünde dairesel bir ilgi alanı (area of interest) oluşturun.

Bu durumda, kanal çapı 100 mikron olduğu için ilgi alanının çapını 200 mikron olarak ayarlayın. Her bir ilgi alanındaki partikül sayısını bir hesap tablosuna aktarmak için görüntüleme yazılımındaki otomatik sayım fonksiyonunu kullanın. Benzer şekilde, cihazın tamamındaki partikül sayısını aktarmak için otomatik sayım özelliğini kullanın.

CFD simülasyonları çalıştırılır ve sonuçlar daha sonraki analizler için bir veri tabanında saklanır. Sonuçlarda yer alan bilgiler; duvar kayma hızlarını, hız parçacık akısını ve cihaza yapışma durumunu içerir. Buradaki bilgiler, tanımlanmış bir parçacık konsantrasyonu girdisi verildiğinde, her bir ilgi alanında yapışan parçacık sayısını belirlemek için kullanılır.

Bir kayma adezyon haritası oluşturmak için, son adım olarak metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde adezyon yüzdesini hesaplayın. Ağların her çatallanmasındaki kayma hızı ve adezyon yüzdesi değerlerini kullanarak kayma adezyon haritasını çizin. Bu görüntü, iki mikronluk biyotinlenmiş partiküllerin bağlanmasının ardından tipik bir avidan kaplı syn vivo SMN cihazını göstermektedir.

Parçacıkların ağdaki çatallanmaların yakınında öncelikli olarak yapıştığına dikkat edin. Syn vivo SMN ağındaki numaralandırılmış çatallanmalar burada görülebilir. Bu görüntü, cihazın CFD modeli tarafından oluşturulan örnek duvar kayma haritasıdır.

Kayma hızı, cihazda in vivo mikrovaskülatürde gözlemlendiği gibi 250 s⁻¹ ile 15 s⁻¹ arasında değişmektedir. Doğrusal mikroakışkan kanallar her akış hızı için sabit bir kayma hızı sağladığından, bu değişken kayma hızlarının aynı anda elde edilemeyeceği unutulmamalıdır. Ağın her bir çatallanmasındaki kayma hızı değerlerini gösteren grafik, kayma hızı modellerinin doğrusal akış kanallarının aksine karmaşık olduğunu ve basit bir analitik ilişkiyle elde edilemeyeceğini ortaya koymaktadır.

Ayrıca, ağda aynı kayma kutusuna giren çok sayıda çatallanma mevcuttur. Bu durum, gösterilen verilerin istatistiksel güvenini artırmaktadır. Burada, deneysel ağın dallarında ve çatallanmalarında parçacık akılarını hesaplamak için kullanılan, ağdaki parçacık akılarına ilişkin CFD analizinin örnek sonuçları yer almaktadır.

Tek bir syn vivo SMN deneyinden hesaplanan makaslama yapışma haritası, lineer kanal deneylerinden elde edilen makaslama yapışma haritalarında gözlemlenen ters ilişkiyi takip eder. Ancak, bir SynVivo testi kullanıldığında, tek bir deney bu makaslama haritasının oluşturulmasına olanak tanırken, lineer kanallardan birden fazla deneysel çalışma elde edilir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir deneyden ortak yapışma oluşturmak için SynVivo SMN cihazlarının nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu deneyi gerçekleştirirken, geliştirme aşamasından sonra SynVivo SMN mikroakışkan cihaza hava kabarcığı girmemesine dikkat etmek önemlidir. Bu teknik, enflamasyon alanındaki araştırmacıların tek bir deneyde farklı kayma hızlarında lökosit-endotel etkileşimini incelemelerinin yolunu açmıştır. Yeni nesil cihazlarla araştırmacılar, şu an için mümkün olmayan bir durum olan lökosit yuvarlanması, adezyonu ve migrasyonunu tek bir analizde inceleyebileceklerdir.

Bu prosedürün ardından; akışın hücre-hücre, hücre-ilaç ve ilaç taşıyıcısı adezyonu üzerindeki fizyolojik etkisi gibi soruları araştırmak amacıyla ilaçların, ilaç taşıyıcı araçlarının ve hücrelerin adezyonunu inceleyen diğer yöntemler uygulanabilir.