Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Buradaki genel amaç, endojen bitkinin VIG'lerini elde etmek için konakçı olmayan dirençte yer alan genleri tanımlamak için virüsün neden olduğu gen susturmayı kullanan metodolojiyi göstermektir. Hedef gen, nicotiana hamama bitkilerini tütün çıngırağı virüsü ile inoküle eder, incir yapar, hedef genin bir parçasını taşır, yeşil floresan proteini eksprese eden konak olmayan patojen kültürlerini hazırlar ve susturulmuş gen bitki yaprakları üzerine aşılar. Daha sonra, karanlıkta UV ışığı altında konakçı olmayan patojenin yeşil floresan kolonilerini değerlendirin.

Konakçı olmayan direnci tehlikeye atan gen susturuculu bitkileri tanımlamak için, virüs vektöründeki eki sıralayarak hedef geni tanımlayın. Genel olarak, VIX aracılı ileri genetik taramanın bu metodolojisi, araştırmacıların, bitkilerin bakteriyel patojenlere karşı konakçı olmayan direncinde yer alan genleri kolayca tanımlamasına olanak tanır. Kısa bir süre içinde, ST direnci olmayan sorumlu genleri tanımlamak için virüsün neden olduğu gen susturma aracılı ileri genetik ile GFP UV eksprese eden patojenlerin birleştirilmesinin önemini fark ettik.

Daha önce hiper tepkiye bağlı hücre ölümü ve hastalığa bağlı hücre ölümü için puanlama yaparak sıkıcı bir ileri genetik tarama yaptığımızda. Böylece, topraksız bir saksı karışımındaki nicotiana Ben tohumları, tohumları bir büyüme odasında çimlendirir. Üç hafta sonra, fideleri ayrı saksılara nakledin, tütün çıngırağı virüsünden en az iki ila üç gün önce bir serada büyütün.

İncir vektör aşılaması, cDNA klonlarını içeren agrobacterium'un donmuş saplarını yavaş yavaş çözer. Steril koşullar altında iki vektör intv, bireysel agrobakteri kültürlerini Luria'ya aşılar. Berti agro plakaları, plakaları 28 santigrat derecede iki güne kadar inkübe eder.

Her klon için dört kopya koloni büyütün, böylece iki bitkinin aşılanması için yeterli agrobacterium inoculum mevcut olur. TRV one'ı Luria berti sıvı ortamına aşılayın. Gece boyunca yetiştirilen kültürleri santrifüjleme ile hasat edin, bakterileri aşılamada yeniden süspanse edin, tamponlayın ve oda sıcaklığında 50 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde üç saat inkübe edin.

Hücreleri santrifüjleme ile hasat ettikten sonra, optik yoğunluğu ölçün ve bakteri peletlerini beş milimolar MES tamponu pH 5.5'te yeniden askıya alın, Daha sonra, OD 600 0.3'e sahip bir bakteri kültürünü, T RV bir aşılama bölgesinde iğnesiz bir şırınga kullanarak üç ila dört nicotiana hamama yaprağının eksen tarafına aşılayın. Yaprakları iki hafta boyunca bir kürdan kullanarak iki koloni olan ilgili T RV'nin aşısı ile delin. Bitkileri yeterli beslenme ile düşük sıcaklıkta tutun, çünkü domuzlar tarafından verimli gen susturma için güçlü büyüme önemlidir.

Örnek olarak, bu deneyde pseudomonas senge PV domates T bir kullanılmıştır. Patojenler, G-F-P-U-V'yi eksprese edebilen bir plazmit taşımalı, krallardaki PGE suşlarını büyütmeli, sıvı, orta olmalı, mililitre başına 10 mikrogram ile desteklenmelidir. Mililitre başına 50 mikrogram rifampisin, 12 saat boyunca 28 santigrat derecede misin yapabilir.

Bakteri kültürlerini santrifüjleme ile hasat edin, ardından karanlıkta uzun dalga boylu bir UV lambası kullanarak yeşil floresan varlığını doğrulayın. Steril suda iki yıkamadan sonra, hücreleri istenen steril su konsantrasyonunda tekrar askıya alın ve OD 600'ü ayarlayın. Daha sonra ilgili patojenleri hedefin eksenel tarafına aşılayın.

Gen susturulmuş yapraklar gerekirse yaklaşık 1,5 santimetre çapında çevreler oluşturur. Aynı anda birkaç konakçı olmayan patojeni hedef gendeki büyümeleri için test edin, susturulmuş bitkiler ayrıca görüntüleme için bir vektör kontrolü içerir. İki ila beş gün arasında bir bakteri üremesi implante edin.

Aşılanmış yaprakları karanlıkta uzun dalga boylu UV ışığına maruz bırakın. Cilt ve göz koruması kullandığınızdan emin olun. Bakteri kolonilerini, yaprak yüzeyi tarafından yayılan kırmızı floresan arka planında, yaprağın eksenel tarafında yeşil floresan lekeler olarak izleyin.

Pozitif kontrol görevi gören konakçı patojen tarafından yayılan yeşil floresansı doğrulayın. Aşılamadan iki ila beş gün sonra günlük olarak patojen büyümesini gözlemleyin. Susturma, bir veya daha fazla konakçı olmayan patojenin büyümesine neden olan klonların bir listesini yapın.

Yanlış pozitifleri ilk ekrandan kaldırmak için. Seçilen klonlar için VIG'leri tekrarlayın ve yine, gen susturuculu bitkilerin maliyet dışı patojenlere tepkisini test edin. Klonlama bölgesini boşaltan T RV iki vektör veya primerde A TTB bir ve bir TB iki primer kullanarak eki yükseltmek için seçilen klon üzerinde koloni PCR kullanın.

PCR ürününü bir aros jeli üzerinde çalıştırın ve tek bandın amplifikasyonunu doğrulayın. Daha sonra, klonlama bölgesini çevreleyen A TTB primerlerini veya primerleri kullanarak T RV iki vektöründe bitki gen ekini sıralayın. Diziyi kullanarak patlatma yapın ve gen ayrıntılarını tanımlayın.

Nikotiana içindeki tütün çıngırak virüsü bazlı incirleri kullanarak çok sayıda geni susturmak için genelleştirilmiş bir protokol. Hamana bu akış şemasında gösterilmiştir. Gen susturulmuş bitkilerin bazıları, bodur büyüme, sararma ve foto ağartma fenotipleri dahil olmak üzere çeşitli fenotipik değişiklikler gösterdi.

Bu veriler, bitki aşılamasından önce karanlıkta UV ışığına maruz kalan patojenin yeşil floresansını ve aşılamadan üç gün sonra büyüme implantlarını gösterir, beyaz ışık altında maruz kalan aynı yaprak kontrol olarak gösterilir. Bu deney, plandaki G-F-P-U-V eksprese eden bakterilerin büyümesini izler. Ev sahibi olmayan üç kişi.

Patojenler, bağışıklığı olan yabani tip nons susturuculu nicotiana hamama bitkilerinde konak olmayan patojenlere duyarlı gen susturulmuş bitkinin tanımlanması sürecini göstermek için kullanılmıştır. Bu patojenler büyümedi. Bununla birlikte, en az iki konakçı olmayan patojen NB sgt.One

geni susturulmuş yapraklarda büyüdü. Bakteri üremesine ilişkin nicel veriler, ST olmayan direnç için tehlikeye atılan gen susturulmuş bitkileri belirleme sürecini göstermektedir. Bu incir aracılı ileri genetik yaklaşımı kullanarak, nicotiana hamana'da yaklaşık 5.000 geni susturduk ve yaklaşık bir buçuk yıllık bir süre boyunca ST olmayan direnci tehlikeye atan bitkileri belirledik.

Örnek olarak, bu ekrandan tanımlanan iki gen susturuculu bitkide konak olmayan patojen üremesi burada gösterilmiştir. Yüzlerce gen için virüs kaynaklı gen susturma işleminin nasıl yapılacağını anlatmış olmayı ve ardından maliyetsiz direnci incelemek için plana maliyet dışı patojenlerin büyümesini gözlemleyerek susturulmuş bitkileri değerlendirmeyi umuyoruz. Bu virüsün neden olduğu geni, susturma aracılı protokolü kullanarak, yaklaşık iki ila üç haftalık bir süre içinde yüzlerce geni susturabilir ve daha sonra GFP UV ile etiketlenmiş at olmayan patojenlerin büyümesini günde yaklaşık iki ila üç saat içinde değerlendirebilir, yaklaşık iki ila beş gün sürer.