Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Buradaki genel amaç, endojen bitkide VIGs elde etmek amacıyla, konak olmayanların direncinde rol oynayan genlerin belirlenmesi için virüsle indüklenen gen susturma metodolojisinin gösterilmesidir. Hedef geni belirleyip, hedef genin bir fragmanını taşıyan tütün tıkırtı virüsü (tobacco rattle virus) konstrüktları ile Nicotiana hamama bitkilerini inoküle edin; yeşil floresan protein eksprese eden konak olmayan patojen kültürlerini hazırlayın ve genleri susturulmuş bitki yapraklarına inoküle edin. Ardından, karanlıkta UV ışığı altında konak olmayan patojenlerin yeşil floresan kolonilerini değerlendirin.

Konukçu olmayan direnci zayıflatan gen susturulmuş bitkileri belirlemek için, virüs vektöründeki ek parçanın dizilemesi yoluyla hedef gen tespit edilir. Genel olarak, VIX aracılı ileri genetik tarama metodolojisi, araştırmacıların bakteriyel patojenlere karşı bitkilerin konukçu olmayan direncinde rol oynayan genleri kolayca tanımlamasına olanak tanır. Kısa bir süre içinde, non-ST direncinden sorumlu genleri belirlemek için virüsle indüklenen gen susturma aracılı ileri genetik ile GFP UV eksprese eden patojenleri birleştirmenin önemini fark ettik.

Daha önce, hiper yanıtla tetiklenen hücre ölümü ve hastalıkla tetiklenen hücre ölümünü puanlayarak zahmetli bir ileri genetik tarama gerçekleştirmiştik. Nicotiana benthamiana tohumlarını topraksız bir saksı karışımına ekin ve tohumları bir yetiştirme odasında çimlendirin. Üç hafta sonra, fideleri ayrı saksılara aktarın ve tütün tıkırtı virüsü (tobacco rattle virus) uygulaması öncesinde en az iki ila üç gün boyunca bir serada büyütün.

İncir vektör inokülasyonu için, cDNA klonlarını içeren agrobacterium dondurulmuş sapları kademeli olarak çözdürün. Steril koşullar altında, münferit agrobacterium kültürlerini Luria Berti agro plaklarına inoküle edin. Plakları 28 °C'de iki güne kadar inkübe edin.

İki bitkinin inokülasyonu için yeterli agrobacterium inokülumu sağlayacak şekilde, her klon için dört tekrarlı koloni büyütün. TRV one'ı Luria berti sıvı besiyerine inoküle edin. Gece boyunca büyütülen kültürleri santrifüj ile hasat edin, bakterileri inokülasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında, 50 RPM hızındaki bir çalkalayıcıda üç saat boyunca inkübe edin.

Santrifüjle hücreler toplandıktan sonra optik yoğunluk ölçülür ve bakteri peletleri beş milimolar pH 5.5 MES tamponunda yeniden süspanse edilir. Ardından, OD 600 değeri 0.3 olan T RV one bakteri kültürü, iğnesiz bir şırınga kullanılarak üç ila dört Nicotiana hamama yaprağının aksi tarafındaki T RV one inokülasyon bölgesine inoküle edilir. Yapraklar, ilgili T RV two kolonilerinin inokulumuyla bir kürdan yardımıyla iki hafta boyunca delinir. Bitkiler, PIG'ler tarafından etkili gen susturulması için güçlü büyüme önemli olduğundan, yeterli besinle düşük sıcaklık altında tutulur.

Örnek olarak, bu deneyde pseudomonas senge PV tomato T one kullanılmıştır. Patojenler, G-F-P-U-V eksprese edebilen bir plazmit taşımalıdır; PGE suşlarını, mililitre başına 10 µg rifampisin ve mililitre başına 50 µg kanamisin ile takviye edilmiş kings be sıvı besiyerinde 28 °C'de 12 saat boyunca büyütün.

Bakteri kültürlerini santrifüjle hasat edin, ardından karanlıkta uzun dalga boylu bir UV lamba kullanarak yeşil floresans varlığını doğrulayın. Steril su ile iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri steril su içerisinde istenen konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve OD 600 değerini ayarlayın. Ardından, ilgili patojenleri hedefin aksiyal tarafına inoküle edin.

Gerektiğinde, gen susturulmuş yapraklardan yaklaşık 1,5 santimetre çapında diskler kesin. Eş zamanlı olarak, hedef geni susturulmuş bitkilerde çeşitli konak dışı patojenlerin büyümesini test edin; görüntüleme için bir vektör kontrolü de ekleyin. Bakteriyel büyümeyi iki ile beş gün arasında implante edin.

İnoküle edilmiş yaprakları karanlıkta uzun dalga boylu UV ışığa maruz bırakın. Cilt ve göz koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Bakteri kolonilerini, yaprak yüzeyinin yaydığı kırmızı floresan arka planı önünde, yaprağın aksiyal tarafındaki yeşil floresan noktalar şeklinde izleyin.

Pozitif kontrol olarak görev yapan konak patojen tarafından yayılan yeşil floresanışı doğrulayın. İnokülasyondan sonraki ikinci ila beşinci günlere kadar patojen büyümesini günlük olarak gözlemleyin. Susturulması, bir veya daha fazla konak olmayan patojenin büyümesiyle sonuçlanan klonların bir listesini yapın.

İlk taramadaki yanlış pozitifleri temizlemek için seçilen klonlar için VIG'leri tekrarlayın ve gen susturulmuş bitkilerin maliyet dışı patojenlere verdiği yanıtı yeniden test edin. T RV iki vektöründeki A TTB bir ve TB iki primerlerini veya klonlama bölgesini çevreleyen primerleri kullanarak, seçilen klon üzerinde inserti çoğaltmak için koloni PCR'ı uygulayın.

PCR ürününü agaroz jelde yürütün ve tek bandın amplifikasyonunu doğrulayın. Ardından, T RV two vektöründeki bitki geni ekini, ya A TTB primerlerini ya da klonlama bölgesini çevreleyen primerleri kullanarak sekanslayın. Elde edilen sekans ile blast analizi gerçekleştirin ve gen detaylarını belirleyin.

Nicotiana hamana'da tütün tıkırtı virüsü tabanlı vektörler kullanılarak çok sayıda genin susturulmasına yönelik genel bir protokol bu akış şemasında gösterilmektedir. Genleri susturulmuş bitkilerin bazıları, bodur büyüme, sararma ve fotobeyazlama fenotipleri dahil olmak üzere çeşitli fenotipik değişiklikler göstermiştir.

Bu veriler, bitki inokülasyonu öncesinde karanlıkta UV ışığına maruz bırakılan patojenin yeşil floresansını ve inokülasyondan üç gün sonraki büyüme implantlarını göstermektedir; beyaz ışık altında tutulan aynı yaprak kontrol olarak gösterilmiştir. Bu deney, üç konak olmayan bitkide G-F-P-U-V eksprese eden bakterilerin büyümesini izlemektedir.

Bağışıklığa sahip yabani tip, susturulmamış nicotiana hamama bitkilerinde, konukçu olmayan patojenlere karşı duyarlı hale getirilmiş gen susturulmuş bitkinin tanımlama sürecini göstermek için patojenler kullanılmıştır. Bu patojenler büyüme göstermemiştir. Ancak, NB sgt üzerinde en az iki konukçu olmayan patojen büyümüştür.

Tek geni susturulmuş yapraklar. Bakteriyel büyüme üzerine elde edilen kantitatif veriler, non-ST direncinde bozulma olan gen susturulmuş bitkilerin tanımlanma sürecini göstermektedir. Bu figs aracılı ileri genetik yaklaşımını kullanarak, nicotiana hamana içerisinde yaklaşık 5.000 geni susturduk ve yaklaşık bir buçuk yıllık bir süre zarfında non-ST direnci bozulan bitkileri tanımladık.

Örnek olarak, bu tarama ile belirlenen iki gen susturulmuş bitkide konak olmayan patojen büyümesi burada gösterilmiştir. Yüzlerce gen için virüs aracılı gen susturmanın nasıl gerçekleştirileceğini ve ardından konak olmayan direnci incelemek amacıyla, konak olmayan patojenlerin büyümesini in planta gözlemleyerek susturulmuş bitkilerin nasıl değerlendirileceğini aktarmış olmayı umuyoruz. Bu virüs aracılı gen susturma temelli protokol kullanılarak, yaklaşık iki ila üç haftalık bir süre içinde yüzlerce gen susturulabilir ve ardından GFP UV ile işaretlenmiş konak olmayan patojenlerin büyümesi, yaklaşık iki ila beş gün boyunca günde iki ila üç saat içinde değerlendirilebilir.