Name: Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, VIGS yöntemiyle bitkilerde konakçı olmayan direnç genlerini nasıl tespit edeceğinizi. GFPuv ifade eden patojenlerle hızlı ve görsel tarama yaparak gen fonksiyonlarını belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje Samuel Roberts Noble Vakfı tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, mükemmel bitki bakımı için Bayan Janie Gallaway ve Colleen Elles'e teşekkür eder; ve sanat eseri için Bayan Katie Brown. Bu protokolün oluşturulmasındaki teknik yardımları için Bayan Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda ve Sn. Isaac Greenhut'a da teşekkür ederiz.

1. Bitki Büyümesi ve Hedef Gen Susturma
<ol>
	<li>
		Bitki büyüme koşulları:
		<ol>
			<li>
				N. benthamiana tohumlarını topraksız saksı karışımı Metro-Mix 350 üzerine ekin ve tohumları bir büyüme odasında çimlendirin. Metro-Mix yerine başka herhangi bir topraklı veya topraksız ortam da kullanılabilir.</li>
			<li>
				Üç haftalık fideleri ayrı saksılara nakledin ve önceki literatürde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi diğer büyüme koşullarıyla birlikte 21±2 ° C'de tutulan bir serada büyütün12. Transplantasyondan iki ila üç gün sonra, bitkiler TRV aşılaması için kullanılabilir.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>
		Büyüyen TRV2 klonları: 
		TRV iki parçalı bir virüstür ve genomu RNA1 ve RNA2'den oluşur. RNA1, RNA'ya bağımlı bir RNA polimerazı ve bir hareket proteininikodlar 20,21. RNA2, subgenomik RNA'lardan bir kaplama proteini (CP) ve iki yapısal olmayan proteini kodlar21. Hem RNA1 hem de RNA2, olgunlaşmış virüs parçacıklarının oluşumu ve yayılması için gereklidir20,21. TRV2 vektöründe cDNA kütüphanesi yapısı önceki literatürdeaçıklanmıştır 22,23. Kısaca, bu çalışmada kullanılan VIGS kütüphanesi, çeşitli biyotik ve abiyotik elisitörlere maruz kalan yaprak dokularından ekstrakte edilen RNA'dan oluşturulmuştur.
		<ol>
			<li>
				TRV2 vektöründe (96 oyuklu bir plaka) cDNA klonlarını içeren Agrobacterium'u (GV2260 suşu) dondurucudan çıkarın. Bunları yavaş yavaş çözün ve kültürler oda sıcaklığına ulaştıktan sonra, bireysel Agrobacterium kültürünü 96 pinli bir çoğaltıcı kullanarak rifampisin (10 μg / ml) ve kanamisin (50 μg / ml) ile Luria-Bertani (LB) agar plakasına aşılayın.</li>
			<li>
				Plakaları iki gün boyunca 28 ° C'de inkübe edin. Genellikle her klon için dört kopya koloni yetiştiririz, böylece iki bitkinin iğneli aşılaması için yeterli Agrobacterium inoculum mevcuttur. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>
		VIGS:
		<ol>
			<li>
				Yukarıda belirtilen antibiyotiklerle LB sıvı ortamda 28 ° C'de TRV1 taşıyan Agrobacterium'u (GV2260) büyütün. Gece boyunca yetiştirilen kültürlerden santrifüjleme yoluyla hücreleri hasat edin, aşılama tamponunda (10 mM MES, pH 5.5; 200 μM asetosiringon) yeniden süspanse edin ve 50 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin.</li>
			<li>
				Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin ve 5 mM MES tamponunda (pH 5.5) yeniden süspanse edin ve iğnesiz bir şırınga kullanarak 3-4 N. benthamiana yapraklarının abaksiyal tarafına aşılayın (OD600 = 0.3). Ayrıntılı aşılama prosedürü önceki literatürde gösterilmiştir24. Daha sonra, TRV1 aşılama yerinde, yaprakları bir kürdan ile delerek ilgili TRV2 kolonilerini aşılayın.</li>
			<li>
				Verimli VIGS12 için güçlü büyüme önemli olduğundan, bitkileri yeterli beslenmeyle koruyun. Aşılamadan yaklaşık iki hafta sonra, hedeflenen genlerin transkriptleri azalmaya başlayacak ve bitkiler, TRV aşılamasından üç hafta sonra patojen aşılaması için hazır hale gelecektir.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

	2. Konak Olmayan Patojen Kültürlerinin Hazırlanması ve Bitki Aşılaması
<ol>
	<li>
		Bu çalışmada kullanılan patojenlerin detayları: 
		Pseudomonas şırınga pv. tabaci, P. syringae pv. domates T1, P. syringae pv. glisin ve Xanthomonas campestris pv. Bu çalışmada Vesicatoria kullanılmıştır. Rifampisin (10 μg/ml), kanamisin (50 μg/ml) ile desteklenmiş King's B (KB) sıvı ortamında P. syringae suşlarını 28 ° C'de 12 saat boyunca büyütün. 16 saat boyunca LB sıvı ortamda vezikatoria. Tüm patojenler, önceki literatürde açıklandığı gibi GFPuv'u eksprese edebilen bir plazmit barındırır19.</li>
	<li>
		Bitki aşılaması için patojen kültürlerinin hazırlanması:
		<ol>
			<li>
				Santrifüjleme ile bakteri hücrelerini toplayın ve karanlıkta uzun dalga boylu UV lambası kullanarak yeşil floresan varlığını doğrulayın. Hücreleri iki kez steril suyla yıkayın ve steril su kullanarak istenen konsantrasyona tekrar süspanse edin.</li>
			<li>
				İlgili patojen(ler)i hedef gen susturulmuş yaprakların (5. ila 8.) abaksiyal tarafına lekeler (yaklaşık 1.5 cm çap) olarak aşılayın. Birkaç konakçı olmayan patojen, hedef gen susturulmuş bitkilerde büyümeleri için aynı anda test edilebilir. Konakçı patojeni aynı anda aşılayın, çünkü bu, planta bakteri büyümesinde görüntüleme için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir. Ayrıca vektör kontrol (TRV::00) bitkilerini aşılayın.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

	3. Bakteriyel Patojenlerin Planta Büyümesinin Gözlenmesi
<ol>
	<li>
		Aşılanmış yaprakları karanlıkta uzun dalga boylu UV ışığına maruz bırakın. Bakteri kolonileri, yaprak yüzeyi tarafından yayılan kırmızı floresan arka planında, yaprağın abaksiyal tarafında yeşil floresan noktalar olarak görülebilir.</li>
	<li>
		Aşılamadan 2 gün sonra (dpi) 5 dpi'ye kadar patojen büyümesini gözlemleyin. Bu zaman aralığında günlük gözlem gereklidir.</li>
	<li>
		İlk ekrandan sonra, susturulması bir veya daha fazla konak olmayan patojenin (patojenlerin) büyümesiyle sonuçlanan klonları kısa listeleyin.</li>
	<li>
		Seçilen klonlar için VIVS'yi tekrarlayın ve gen susturulmuş bitkilerin konakçı olmayan patojenlere tepkisini tekrar test edin. Bu ikinci tarama seviyesi, ilk tarama sırasında elde edilen yanlış pozitifleri ortadan kaldırmak için yapılır.</li>
</ol>

	4. Tehlikeye Atılmış Konakçı Olmayan Direnç için Kısa Listeye Alınan Bitkilerin Onaylanması
<ol>
	<li>
		Ekrandan seçilen cDNA klonlarını yukarıda anlatıldığı gibi sessize alın. Bitkileri ilgili patojen kültürleri ile %0.01 (h/h) Silwet L-77 ile batırarak ve batık bitkileri 3-5 dakika vakuma tabi tutarak tüm bitkiyi konukçu olmayan patojen(ler) ile aşılayın. Aşağıda açıklandığı gibi geleneksel büyüme testi6,18,19 ile bakteri üremesini ölçün.</li>
	<li>
		Aşılamadan 0 saat sonra (hpi), 3 dpi ve 5 dpi'de, bir yaprak zımbası (0,5cm2) kullanarak konakçı olmayan patojen (ler) ile aşılanmış yapraklar için beş biyolojik kopyadan iki yaprak örneği toplayın. Yaprak örneklerini öğütün, seri seyreltin ve özsuyu uygun antibiyotiklerle desteklenmiş KB agar ortamı üzerinde kaplayın ve 28 ° C'de 2 gün inkübe edin. Bir koloni sayacı kullanarak bakteri kolonilerini sayın ve önceki literatür6'da açıklandığı gibi yapraklardaki bakteri üremesini hesaplayın.</li>
	<li>
		Konakçı olmayan patojen(ler)e duyarlı bitkiler, vektör kontrolüne kıyasla daha fazla sayıda patojen büyümesi göstermelidir.</li>
</ol>

	5. Eklemenin Sıralanması ve Hedef Genin Tanımlanması
<ol>
	<li>
		attB1 ve attB2 primerlerini kullanarak veya TRV2 vektöründe klonlama bölgesini çevreleyen primerleri kullanarak seçilen klon için koloni PCR gerçekleştirin. PCR ürününü jel üzerinde çalıştırın ve tek bandın amplifikasyonunu kontrol edin.</li>
	<li>
		TRV2 vektöründeki bitki gen eki, klonlama bölgesini çevreleyen attB primerleri veya primerleri kullanılarak dizilenebilir.</li>
	<li>
		Diziyi kullanarak BLAST gerçekleştirin ve gen ayrıntılarını tanımlayın.</li>
	<li>
		Translasyonsuz bölgeler (UTR'ler) ile birlikte tam uzunlukta gen dizisi elde edin.</li>
	<li>
		Dizinin üç farklı bölgesinden 300-400 bp fragmanı seçin ve bunları TRV2 vektörüne klonlayın. Üç VIGS yapısını da kullanarak VIGS'yi bağımsız olarak gerçekleştirin ve üç gen susturulmuş bitkinin hepsinde konakçı olmayan direncin uzlaşmasını onaylayın.</li>
</ol>

<ol><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance+and+nonspecific+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance and nonspecific plant defenses.</a> Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).</li>
<li>Mysore, K. S., Ryu, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance%3A+how+much+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance: how much do we know.</a> Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+nonhost+disease+resistance%3A+can+they+assist+disease+control+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture.</a> The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance+against+bacterial+pathogens%3A+retrospects+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance against bacterial pathogens: retrospects and prospects.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, (2013).</li>
<li>Lu, M., Tang, X., Zhou, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+NHO1+is+required+for+general+resistance+against+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis NHO1 is required for general resistance against Pseudomonas bacteria.</a> The Plant Cell. 13, 437-447 (2001).</li>
<li>Rojas, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolate+oxidase+plays+a+major+role+during+nonhost+resistance+responses+by+modulating+reactive+oxygen+species+mediated+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways.</a> The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).</li>
<li>Daurelio, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+novel+genes+involved+in+nonhost+response+to+bacterial+infection+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco.</a> Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).</li>
<li>Moreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDS1+contributes+to+nonhost+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+against+Erwinia+amylovora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornithine-delta-aminotransferase+and+proline+dehydrogenase+genes+play+a+role+in+non-host+disease+resistance+by+regulating+pyrroline-5-carboxylate+metabolism-induced+hypersensitive+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Ornithine-delta-aminotransferase and proline dehydrogenase genes play a role in non-host disease resistance by regulating pyrroline-5-carboxylate metabolism-induced hypersensitive response.</a> Plant, Cell & Environment. 35, 1329-1343 (2012).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> The Plant Journal. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+for+VIGS+in+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New dimensions for VIGS in plant functional genomics.</a> Trends in Plant Science. 16, 656-665 (2011).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+can+persist+for+more+than+2+years+and+also+be+transmitted+to+progeny+seedlings+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).</li>
<li>Bombarely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+genome+sequence+of+Nicotiana+benthamiana+to+enhance+molecular+plant-microbe+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).</li>
<li>Sharma, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+silencing+of+WIPK+and+SIPK+genes+reduces+resistance+to+a+bacterial+pathogen%2C+but+has+no+effect+on+the+INF1-induced+hypersensitive+response+%28HR%29+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genomics%22%5BJournal%5D)">Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana.</a> Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).</li>
<li>Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+forward+genetics+based+on+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing.</a> Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).</li>
<li>Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPKKK%5Balpha%5D+is+a+positive+regulator+of+cell+death+associated+with+both+plant+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease.</a> EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).</li>
<li>Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -M., Kang, L., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosterols+play+a+key+role+in+plant+innate+immunity+against+bacterial+pathogens+by+regulating+nutrient+efflux+into+the+apoplast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast.</a> Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).</li>
<li>Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+planta+bacterial+infection+at+both+cellular+and+whole-plant+levels+using+the+green+fluorescent+protein+variant+GFPuv%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv.</a> New Phytologist. 174, 212-223 (2007).</li>
<li>Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A. M., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advance%3A+Tobacco+rattle+virus+as+a+vector+for+analysis+of+gene+function+by+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Technical Advance: Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing.</a> The Plant Journal. 25, 237-245 (2001).</li>
<li>MacFarlane, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+tobraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the tobraviruses.</a> Journal of General Virology. 80, 2799-2807 (1999).</li>
<li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+plant+genes+involved+in+Agrobacterium-mediated+plant+transformation+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of plant genes involved in Agrobacterium-mediated plant transformation by virus-induced gene silencing.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 41-52 (2007).</li>
<li>Liu, E., Page, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDNA+libraries+for+virus-induced+gene+silencing+%28VIGS%29+using+tobacco+rattle+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus.</a> Plant Methods. 4, 5(2008).</li>
<li>Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+%28VIGS%29+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> J. Vis. Exp. (28), e1292(2009).</li>
<li>Peart, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligase-associated+protein+SGT1+is+required+for+host+and+nonhost+disease+resistance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+99%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).</li>
<li>Oh, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+Types+I+and+II+nonhost+resistance+using+expression+patterns+of+defense-related+genes+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco.</a> Planta. 223, 1101-1107 (2006).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. RNAi and Plant Gene Function Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSenthil-Kumar%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Kodama, H., Komamine, A. 744, Humana Press. 13-25 (2011).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Bitki bağışıklığı, konakçı olmayan patojenlerin büyümesini sınırlar ve bu nedenle, uzun dalga boylu UV ışığı altında konakçı olmayan patojen ile aşılanmış vektör kontrol bitki yapraklarından çok az yeşil floresan yayılır veya hiç yayılmaz (Şekil 3D). Bununla birlikte, konakçı olmayan dirençte yer alan bir gen susturulduğunda, gen susturulmuş bitkiler, konakçı olmayan patojenin büyümesini destekler ve yeşil floresan görülür (Şekil 3E). Bu, bu yazıda açıklanan yöntemde yer alan temel ilked...

Konakçı olmayan direnç belirli bir patojen 1,2 yarışları karşı tüm bitki türlerinin direncidir. Bu geniş spektrum ve bitkiler 2,3 dayanıklı hastalık direnci verir. Bununla birlikte, özellikle de bakteriyel patojenlere karşı mekanizması, iyi 4 anlaşılmış değildir. Uzlaşma konakçı olmayan direnç ve konakçı olmayan direnç 5-9 sırasında farklı şekilde ifade genlerin tanımlanması için yüksek verimlilik transkript profil daha önce bakteriyel konakçı olmayan direnç diseksiyon için kullanılan iki ana yaklaşım olduğunu mutantlar veya susturulması bitkiler için tarama. Konakçı olmayan direnç birçok gen, gen tanımlama için bir yüksek verimlilik fonksiyonel genomik yaklaşım katılımı ile karmaşık bir mekanizma (lar) 4 tarafından kontrol edildiği için konakçı olmayan direnç mekanizması (ler) daha iyi anlamasını önemlidir. Virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) başarıyla endojen bitki susturmak için kullanılmıştırBirçok bitki türünün 10,11 genlerin. Nicotiana benthamiana VIGS 10,12 ve taslak genom dizisi için en uygun tesislerinden biri şimdi 13 kullanılabilir. Tütün çıngırak virüsü (TRV) tabanlı VIGS yaygın olarak ters genetik aracı olarak kullanılmıştır konakçı olmayan direnç 2,4,14 ilgili genler karakterize etmek. Bu VIGS vektörler ve türevleri Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi (ABRC aracılığıyla mevcuttur <a href="http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html</a> ). VIGS da bitki bağışıklık 15-17, özellikle konakçı olmayan direnç 6,18 katılan genlerin belirlenmesi için ileri genetik aracı olarak kullanılmıştır. Hiperduyarlı cevap (İK)-aracılık ettiği özel bir konakçı olmayan patojene karşı bitkileri kaynaklı hücre ölümü değerlendirilmesi ve hastalığa bağlı hücre ölümü değerlendirmek özellikle TANIMLAMA için kullanılan iki ana tahlillerdirg duyarlı gen bitkiler susturuldu. Ancak, İK hücre ölümü tek tip-II konakçı olmayan patojenlere karşı indüklenir değil, tip I konakçı olmayan patojenler 2 karşı. Bu nedenle, İK deneyleri evrensel özellikle tip-I konakçı olmayan patojenlerin geniş bir karşı, bitkiler tarafından kullanılan konakçı olmayan direnç stratejilerini belirlemek için kullanılamaz. Ayrıca, bir genin susturulması bitki konakçı olmayan direnç kısmi kaybı her zaman hastalık belirtileri 6 ve dolayısıyla hastalık puanlama konakçı olmayan direnç ödün bitkilerin belirlenmesi için kullanılamaz yol açmaz. Aksine, genin susturulması konakçı olmayan bitkilerde patojen büyüme değerlendirilmesi genin susturulması konakçı olmayan bitkilerde direnç kaybı eğitim için daha iyi bir yöntemdir. Geleneksel büyüme deneyi 6,19, genin susturulması konakçı olmayan bitkilerde bakteri üremesi değerlendirmek için hızlı bir yöntem ile karşılaştırıldığında, ileri genetik taraması için gereken zamanı kısaltır. Daha önce bakteri gözlemlemek için bir yöntem raporultraviyole altında çıplak gözle yapraklarda l patojen büyüme (UV) açık yeşil floresan proteininin (GFP) 19 ifade bakteri kullanarak. Bu yazıda biz konakçı olmayan direnci için tehlikeye gen susturulması bitki kolay tanımlama için konakçı olmayan bakteriyel patojenler ifade GFPuv yararlılığını göstermektedir. Bu metodoloji duyarlı bitkilerin belirlenmesi için doğru ve yüksek verimli görüntüleme için müsait.

<table><tbody><tr><td>96 kuyulu U-alt plakalar</td><td>Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>96 pinli çoğaltıcı paslanmaz çelik</td><td>Nalge Nunc International (Naperville, IL, ABD)</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Yoğunluklu UV Kontrol Lambaları, Model B-100ap</td><td>Thomas scientific (İsveçli, NJ, ABD)</td><td>6283K50</td><td>Üretici Kimliği 95-0127-01 </td></tr><tr><td>Stuart SC6 koloni sayacı</td><td>Bibby Scientific Limited, Staffordshire, Birleşik Krallık</td><td>SC6PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Topraksız saksı karışımı, Metro-Mix 350</td><td>SUNGRO Bahçe Bitkileri Dağıtımı, Inc., (Bellevue, WA, ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerler: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTÄAGAAAGCTGGGT)</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, ABD)</td><td>Özel sentezlenmiş</td><td></td></tr><tr><td>MES, Monohidrat </td><td>VWR uluslararası (Radnor, PA, ABD)</td> <td>CAS No. 145224-94-8</td><td></td></tr><tr><td>Asetosiringon (Dimetoksi-4'-hidroksiasetofenon) </td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ABD)</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77)</td><td>Lehle Tohumları (Round Rock, TX, ABD)</td><td>VIS-30</td><td></td></tr></tbody></table>

genler belirlenmesi için vigs-aracılığı ile İleri genetik tarama konakçı olmayan direnç ilgilendim

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Bakteriyel patojenlere karşı bitkilerin konakçı olmayan hastalık direnci karmaşık bir savunma yollar ile kontrol edilir. Bu mekanizmanın anlaşılması patojenlerin geniş bir karşı dayanıklı hastalığa dirençli bitkilerin geliştirilmesi için önemlidir. Virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) tabanlı ileri genetik tarama konakçı olmayan direnç aktarmanın bitki savunma genlerin belirlenmesi için yararlı bir yaklaşımdır. Tütün çıngırak virüsü (TRV) tabanlı VIGS vektör bugüne kadar en verimli VIGS vektör ve verimli bir şekilde kullanılmaktadır Nicotiana benthamiana endojen hedef genlerin susturmak için. Bu yazıda, N. bir cDNA kütüphanesi tek tek klonların susturmak için bir ileri genetik tarama yaklaşımı göstermek benthamiana ve konakçı olmayan patojenlere karşı tehlikeye konakçı olmayan direnç için gen susturulması bitkilerin yanıt değerlendirilmesi, Pseudomonas syringae pv. domates T1, P. syringae pv. glycInea ve X campestris pv. vesicatoria. Bu bakteriyel patojenler ifade GFPuv proteine ​​tasarlanmıştır ve susturuldu hedef gen konakçı olmayan direnç aktarmanın söz konusu ise kendi yeşil Florasanl koloniler konakçı olmayan patojen aşılanmış bitkilerde UV ışık altında çıplak gözle görülebilir. Bu konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturulması bitkilerin güvenilir ve daha hızlı kimlik kolaylaştırır. Bundan başka, umut verici bir aday gen bilgi TRV vektör bitki geni uç sıralanmasıyla bilinebilir. Burada konakçı olmayan direnç ile ilgili genleri tanımlamak için VIGS-aracılı ileri genetik yüksek verimlilik yeteneği göstermektedir. Yaklaşık, 100 cDNAs ayrı ayrı sonra bir hafta içinde incelenebilir yaklaşık iki üç hafta ve birkaç konakçı olmayan bakteriyel patojenler karşı konakçı olmayan direnç önemleri de susturulabilir. Bu yazıda, bu tarama ile ilgili ayrıntılı adımlar numaralandırmak. VIGS-aracılı ileri genetik Screening yaklaşım, konakçı olmayan direnç katılan genlerin belirlenmesi için değil, aynı zamanda, çeşitli bitki türlerinde çeşitli biyotik ve abiyotik stres tolerans kazandıran genler incelemek için sadece uzatılabilir.

Bu çalışmanın temel amacı, konukçu dışı dirençleri zayıflatılmış, genleri susturulmuş N. benthamiana bitkilerinin kolay ve doğru bir şekilde tanımlanması için bir yöntem göstermektir. Bu metodolojide dört ana adım bulunmaktadır. İlk adım, TRV-VIGS kullanarak çok sayıda genin tek tek susturulmasıdır. Şekil 1'de gösterilen protokolü kullanarak yaklaşık 1,5 yıllık bir süre içinde yaklaşık 5.000 geni susturduk6,18. Genleri susturulmuş bazı bitkiler; bodur büyüme, sararma ve foto-ağarma ...

Virüsün neden olduğu gen susturma, bitkilerin konakçı olmayan direncinde yer alan genleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturuculu bitkilerin tanımlanmasında GFPuv eksprese eden bakteriyel patojenlerin kullanımını gösteriyoruz. Bu yaklaşım kolay, hızlıdır ve büyük ölçekli taramayı kolaylaştırır ve diğer çeşitli bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için benzer bir protokol uygulanabilir.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Buradaki genel amaç, endojen bitkide VIGs elde etmek amacıyla, konak olmayanların direncinde rol oynayan genlerin belirlenmesi için virüsle indüklenen gen susturma metodolojisinin gösterilmesidir. Hedef geni belirleyip, hedef genin bir fragmanını taşıyan tütün tıkırtı virüsü (tobacco rattle virus) konstrüktları ile Nicotiana hamama bitkilerini inoküle edin; yeşil floresan protein eksprese eden konak olmayan patojen kültürlerini hazırlayın ve genleri susturulmuş bitki yapraklarına inoküle edin. Ardından, karanlıkta UV ışığı altında konak olmayan patojenlerin yeşil floresan kolonilerini değerlendirin.Konukçu olmayan direnci zayıflatan gen susturulmuş bitkileri belirlemek için, virüs vektöründeki ek parçanın dizilemesi yoluyla hedef gen tespit edilir. Genel olarak, VIX aracılı ileri genetik tarama metodolojisi, araştırmacıların bakteriyel patojenlere karşı bitkilerin konukçu olmayan direncinde rol oynayan genleri kolayca tanımlamasına olanak tanır. Kısa bir süre içinde, non-ST direncinden sorumlu genleri belirlemek için virüsle indüklenen gen susturma aracılı ileri genetik ile GFP UV eksprese eden patojenleri birleştirmenin önemini fark ettik.Daha önce, hiper yanıtla tetiklenen hücre

vigs-mediated-forward-genetics-screening-for-identification-genes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Knock-down gen ekspresyonu için bir virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) yöntemi...

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Insersiyonel mutajenez, fonksiyonel genomik elementleri tanımlamak için ileri genetikte önemli bir araçtır. Burada, lentivirüs tabanlı bir ekleme mutajenez hücre kütüphanesi içindeki lentivirüs entegrasyon bölgelerini tespit etmek için bir yöntem olan İşlevsel Öğeler ve Transkriptler için Yerleştirme Tabanlı Ekranı (InSET) açıklıyoruz.

Bir İnsersiyonel Mutajenez Hücre Kütüphanesinde İşlevsel Olarak İlgili Lentivirus Entegrasyon Bölgelerinin Tanımlanması

Viral enfeksiyon katılan Roman konakçı faktörleri fonksiyonu RNAi tarama hücre tabanlı genom zarara tespit edilebilir.

RNAi Tarama için ilgilendim Ana Faktörler Vaccinia Virüs Enfeksiyonu Drosophila Hücre

Öğrenin, VIGS yöntemiyle bitkilerde konakçı olmayan direnç genlerini nasıl tespit edeceğinizi. GFPuv ifade eden patojenlerle hızlı ve görsel tarama yaparak gen fonksiyonlarını belirleyin.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Daha fazla video keşfet