What temperature conditions are best for growing C. elegans in the lab?

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending on experimental requirements. Temperature directly affects life cycle speed: at 25 °C, worms complete their life cycle 2.1 times faster than at 16 °C. Faster growth means worms mature quicker, lay more eggs, and consume more food, making temperature selection critical for experimental design.

What do C. elegans eat and how are they fed in the laboratory?

C. elegans are fed OP50, a standardized strain of E. coli used in every worm lab worldwide. In the wild, worms feed on decomposing plant matter, but in the lab they consume OP50 cultured on nematode growth media (NGM) plates or in liquid media. This standardized diet ensures consistent experimental conditions across research facilities.

How do you make and prepare NGM plates for C. elegans culture?

Combine nematode growth media ingredients with deionized water, autoclave for at least 15 minutes, then cool to 55 °C. Add aseptic additives if needed, pipette into Petri plates until 2/3 full, and dry overnight. Inoculate with OP50 E. coli resuspended to 10X concentration, dry overnight, then expose to UV light for sterilization before use.

What is a worm pick and how is it constructed?

A worm pick is a tool made from 30 gauge platinum-iridium wire sealed into a Pasteur pipet tip. The wire is flattened at the end and bent upward to form a scoop, then sanded smooth. The pick allows researchers to individually manipulate and transfer worms under a dissection microscope without damaging them or the agar surface.

How are C. elegans frozen and recovered for long-term storage?

Wash freshly starved larvae in M9 Buffer, transfer to a cryotube, add equal volume of 30% glycerol in M9 Buffer, and store at -80 °C. To recover, thaw at room temperature, pipette onto fresh NGM plates with OP50, and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer animals to new plates and allow one generation of reproduction before scoring phenotypes.

What happens to C. elegans when they experience stress or overcrowding?

When starved or overcrowded, C. elegans enter the dauer stage, a stress-resistant larval stage where worms do not age. This survival mechanism allows populations to persist under adverse conditions until resources become available again, making dauer larvae useful for long-term storage and experimental manipulation.

How is RNA interference used to study gene function in C. elegans?

Researchers prepare plates with E. coli expressing target gene dsRNA, which worms consume. Fourth larval stage worms are transferred to RNAi plates to lay eggs, then progeny are collected at desired developmental stages and scored for phenotypes. This approach silences specific genes to determine their function, leveraging insights from development and reproduction of caenorhabditis elegans for disease research.

C. elegans Bakımı

0 görüntüleme10:54 dk

Caenorhabditis elegans'ın doğru bakımı ve sürdürülmesi, başarılı deneyler için esastır.

Çok az alana ihtiyaç duyarlar, barındırılmaları ucuzdur, yüksek doğurganlığa sahiptirler ve manipülasyonları kolaydır. Ancak, bakımlarının basit olması, yapılan bilimin basit olduğu anlamına gelmez. Hatta Sydney Brenner, C. elegans'ı ünlü bir şekilde "doğanın bilime hediyesi" olarak adlandırmıştır ve 1974'teki tanıtımından bu yana bu solucan, birçok Nobel ödüllü deneyde yer almıştır.

Bu videoda, barındırma ve besleme, taşıma ile solucanların dondurulması ve çözdürülmesi dahil olmak üzere, C. elegans'ın laboratuvarda sürdürülmesine yönelik temel yöntemleri göstereceğiz.

Doğada C. elegans, toprakta bulunur ve ayrışan bitki maddeleriyle beslenir. Laboratuvarda, nematodları mümkün olduğunca sağlıklı tutmak önemlidir, bu nedenle onları çok spesifik yöntemler kullanarak barındırır ve besleriz.

C. elegans, deneyin gereksinimlerine bağlı olarak 16, 20 veya 25 °C'de yetiştirilebilir ve hem katı hem de sıvı besiyerlerinde büyütülebilir. Her iki durumda da, dünyadaki tüm solucan laboratuvarlarında nematod kültürü için özel olarak kullanılan standart bir E. coli suşu olan OP50 ile beslenirler.

25 °C'de yetiştirildiklerinde, C. elegans yaşam döngülerini 16 °C'de yetiştirildikleri zamana göre 2,1 kat daha hızlı tamamlarlar. Daha hızlı bir yaşam döngüsü, solucanların daha hızlı olgunlaşması, daha fazla yumurta bırakması ve daha fazla besin tüketmesi anlamına gelir. Solucanların aç kalmasına izin verilirse veya çok sıkışık hale gelirlerse, dauer evresi adı verilen bir larva evresine girerler. Dauer larvaları strese dayanıklıdır ve yaşlanmazlar.

Katı besiyerinde tutulduklarında, C. elegans nematod büyüme besiyeri veya NGM besiyeri ile hazırlanan agar plaklarında yetiştirilir. Plakaları hazırlamadan bir gün önce, sıvı LB besiyerini tek bir OP50 E. coli kolonisi ile inoküle edin. Besiyerini 37 °C'de gece boyunca çalkalayarak inkübe edin.

Katı besiyeri hazırlamak için, bu bileşenlerin uygun miktarlarını bir Erlenmeyer balonunda deiyonize su ile ölçün ve birleştirin.

En az 15 dakika otoklavladıktan sonra, agarın bir su banyosunda 55 °C'ye soğumasını bekleyin. Besiyeri 55 °C'ye soğuduğunda, cam kabı çıplak ellerle rahatça tutabiliyor olmalısınız. Uygun aseptik teknik kullanarak, ilaçlar veya antibiyotikler gibi katkı maddeleri bu aşamada eklenebilir. Karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın. Ardından, erimiş NGM'yi Petri plakaları 2/3 oranında dolana kadar pipetleyin. Yeni hazırlanan plakaların tezgah üzerinde gece boyunca kurumasına izin verin.

Ertesi sabah OP50'yi 3500 x g'de 10 dakika boyunca pelletleyin ve ardından bakterileri LB besiyerinde 10X konsantrasyona yeniden süspande edin. Şimdi, her plağın merkezine bir kültür alanı (lawn) pipetleyin. Pipet ucunun NGM yüzeyine değmesinden kaçının ve kültürün plak duvarlarına değmemesine dikkat edin. Plakaları gece boyunca tezgahta kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, plakaları sterilize etmek için UV ışığına maruz bırakın. Artık solucan kültürü için kullanılmaya hazırdırlar.

C. elegans bireyleri, solucan iğnesi (worm pick) olarak bilinen bir araçla tek tek manipüle edilir. İğne tipik olarak 30 gauge %90 platin ve %10 iridyum telden yapılır, ancak bazı araştırmacılar biraz daha farklı metal bileşimlerini tercih edebilir. Bir iğne yapmak için, önce bir Pasteur pipetinin ucunu tercih edilen uzunlukta kırarak başlayın.

Yaklaşık 3 ila 4 cm tel kesin ve telin 0,5 cm'lik kısmını pipet ucunun içine yerleştirin. Teli bir Bunsen beki üzerinde cama sabitlemek için ısıtarak mühürleyin. Camdan dışarı çıkan telin uzunluğu yaklaşık 3 ila 3,5 cm'dir ancak kişisel tercihlere göre değişebilir.

Telin ucunu sert bir kenar kullanarak düzleştirin. Ardından, düzleştirilen kısmı yukarı doğru bükerek bir kepçe formu oluşturun. Son olarak, solucana veya agara zarar vermeyi önlemek için iğnenin kenarlarını zımparalayın.

Solucanları toplamak için iğne telini alevde sterilize edin. Ardından ucu, bir NGM plakasındaki yoğun ve yapışkan OP50 E. coli ile kaplayın. Agar yüzeyini delmemeye veya çizmemeye dikkat edin.

Bir diseksiyon mikroskobuyla bakarken, solucan iğneye yapışana kadar onu hafifçe düzleştirilmiş, yapışkan iğnenin üzerine alın.

Solucan iğneye geçtiğinde, ucu yeni bir plakanın yüzeyine hafifçe değdirip bakteri çimi üzerinde kaydırarak hemen transfer edin. Solucan iğneden sürünerek ayrılmalıdır. Solucan iğne üzerinde çok uzun süre kalmamalıdır, aksi takdirde kuruyabilir.

C. elegans'in popüler bir araştırma modeli olmasının nedenlerinden biri, kültürlerin herhangi bir olumsuz etki olmaksızın uzun süreler boyunca saklanabilmesidir.

Öncelikle, taze aç bırakılmış larvaları 0.5 ml M9 Tamponu kullanarak yıkayın, tüm larva ve yetişkin hayvanları serbest bırakmak için nazikçe çalkalayın ve ardından bir mikrosantrifüj tüpüne veya kriyotüpe aktarın. Daha sonra, M9 Tamponu içinde eşit miktarda %30 gliserol ekleyin. Son olarak, tüpü yalıtımlı bir kutuya yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.

Solucanları geri kazanmak için, tüpü -80 °C dondurucudan çıkarın ve içerik tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözülmeye bırakın. Sıvıyı, OP50 çimlenmesi olan taze bir NGM plakasına pipetle aktarın ve 20 °C'de inkübe edin. 2-3 gün sonra, 10-15 hayvanı yeni bir plakaya aktarın ve bir nesil boyunca üremelerine izin verin. Soyundan gelenleri toplayın ve doğru fenotipler açısından değerlendirin.

C. elegans'in laboratuvarda nasıl muhafaza edildiğini gördüğümüze göre, besleme, barındırma ve taşıma koşullarının deneyler için nasıl modifiye edildiğine bir göz atalım.

RNA interferansının Nobel ödüllü keşfi, araştırmacıların herhangi bir C. elegans geninin işlevini belirlemek amacıyla onu susturmasına olanak sağlamıştır.

C. elegans'te RNAi'yi, öncelikle solucanların yiyeceği ve hedef gen dsRNA'sını eksprese eden E. coli içeren plakalar hazırlayarak indükleyebiliriz.

Ardından, 4. larval evredeki solucanlar RNAi plakalarına aktarılır ve yumurta bırakmalarına izin verilir. Gelişimin istenen evresinde progeniler toplanır ve fenotipler açısından değerlendirilir. Genomumuzun yaklaşık yarısını solucanla paylaştığımız için elde edilen bulguların çoğu insan hastalıkları için uygulanabilirdir.

Hızlı yaşam döngüsü nedeniyle C. elegans, yaşlanma modeli olarak özellikle uygundur.

Öncelikle, yetişkin hermafroditlerin NGM plakalarına yumurta bırakmasına izin verilerek zamanla senkronize edilmiş bir C. elegans popülasyonu oluşturulur. Solucanlar 6-8 hr boyunca yumurta bırakır ve ardından uzaklaştırılır.

Solucanlar istenen evreye geldiğinde, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ampicillin ve üremeyi önlemek için FUDR içeren yeni NGM plakalarına aktarılırlar.

Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar yetişkin solucanlar her 2-3 günde bir gözlemlenir. Ölü solucanlar plakadan uzaklaştırılır ve canlı ile ölü solucan sayıları kaydedilir.

Yaşam süresinin genetik veya çevresel etkiler bağlamında analiz edilmesi, yaşlanma süreci hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Lazerler kullanılarak, sinir hücrelerinin nasıl rejenerasyon gösterdiğini incelemek amacıyla, canlı C. elegans'lerde aksotomiler veya tekil aksonların kesilmesi işlemleri gerçekleştirilebilir.

Ancak solucanlar hiç hareketsiz kalmadıkları için, mikroboncuklar içeren bir solüsyon içindeki %10'luk agaroz pedlerin üzerine yerleştirilirler. Üzerine bir lamelle kapatıcı cam konulur. Mikroboncuklar, ped-kapak camı etkileşiminin sürtünme katsayısını artırarak solucanı etkili bir şekilde olduğu yere sabitler.

Lam artık aksotomilerin gerçekleştirilmesi için hazırdır. Nöronlar görüş alanına getirilir ve mikroskopta merkezlenir. Ardından ayak pedalı kullanılarak lazer ateşlenir. Optimum lazer gücü, komşu yapılara zarar vermeden nöronu kesecektir. Hayvan başına mümkün olduğunca çok akson kesilir.

Ardından agaroz ped dikkatlice lamdan çıkarılır ve solucanların 20 °C'deki ekimli bir NGM plakasında iyileşmelerine izin verilir. Aksotomiden 8-48 hr sonra, nöronlar rejenerasyon değerlendirmesi için hazırlanabilir. Kesiğin distal kısmında nöron bir güdük oluşturur. Ancak proksimal kısımda nöron, uzamış nöritler oluşturarak rejenerasyon gösterir.

JoVE'nin temel Ceanorhabditis elegans bakımıyla ilgili anlatımını izlediniz. Bu videoda şunları gözden geçirdik: C. elegans'ın barındırılması ve beslenmesi, manipülasyonu, nematodların dondurulması ve geri kazanımı.

Ayrıca C. elegans'ı bu kadar güçlü bir araştırma aracı haline getiren bazı uygulamalara kısa bir göz attık. C. elegans birçok açıdan memelilerden farklı olsa da, benzer genetik yapıları, bakım kolaylıkları ve basit manipülasyon imkanları, onları memeli biyolojisini ve hastalıklarını anlama yolunda önemli bir model haline getirmektedir. İzlediğiniz için teşekkürler!

Ceanorhabditis elegans, çeşitli gelişimsel, genetik, moleküler ve hatta fiziksel fenomenleri incelemek için model bir organizma olarak büyük bir başar…