What temperature conditions are best for growing C. elegans in the lab?

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending on experimental requirements. Temperature directly affects life cycle speed: at 25 °C, worms complete their life cycle 2.1 times faster than at 16 °C. Faster growth means worms mature quicker, lay more eggs, and consume more food, making temperature selection critical for experimental design.

What do C. elegans eat and how are they fed in the laboratory?

C. elegans are fed OP50, a standardized strain of E. coli used in every worm lab worldwide. In the wild, worms feed on decomposing plant matter, but in the lab they consume OP50 cultured on nematode growth media (NGM) plates or in liquid media. This standardized diet ensures consistent experimental conditions across research facilities.

How do you make and prepare NGM plates for C. elegans culture?

Combine nematode growth media ingredients with deionized water, autoclave for at least 15 minutes, then cool to 55 °C. Add aseptic additives if needed, pipette into Petri plates until 2/3 full, and dry overnight. Inoculate with OP50 E. coli resuspended to 10X concentration, dry overnight, then expose to UV light for sterilization before use.

What is a worm pick and how is it constructed?

A worm pick is a tool made from 30 gauge platinum-iridium wire sealed into a Pasteur pipet tip. The wire is flattened at the end and bent upward to form a scoop, then sanded smooth. The pick allows researchers to individually manipulate and transfer worms under a dissection microscope without damaging them or the agar surface.

How are C. elegans frozen and recovered for long-term storage?

Wash freshly starved larvae in M9 Buffer, transfer to a cryotube, add equal volume of 30% glycerol in M9 Buffer, and store at -80 °C. To recover, thaw at room temperature, pipette onto fresh NGM plates with OP50, and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer animals to new plates and allow one generation of reproduction before scoring phenotypes.

What happens to C. elegans when they experience stress or overcrowding?

When starved or overcrowded, C. elegans enter the dauer stage, a stress-resistant larval stage where worms do not age. This survival mechanism allows populations to persist under adverse conditions until resources become available again, making dauer larvae useful for long-term storage and experimental manipulation.

How is RNA interference used to study gene function in C. elegans?

Researchers prepare plates with E. coli expressing target gene dsRNA, which worms consume. Fourth larval stage worms are transferred to RNAi plates to lay eggs, then progeny are collected at desired developmental stages and scored for phenotypes. This approach silences specific genes to determine their function, leveraging insights from development and reproduction of caenorhabditis elegans for disease research.

C. elegans Bakım

0 görüntüleme10:54 dk

Başarılı deneyler için Caenorhabditis elegans'ın doğru bakımı ve bakımı çok önemlidir.

Çok az alana ihtiyaç duyarlar, barındırılması ucuzdur, doğurganlığı yüksektir ve manipüle edilmesi kolaydır. Ancak etrafta dolaşmaları basit olduğu için, pısırık bilim anlamına gelmez. Aslında, Sydney Brenner C. elegans "Doğanın bilime armağanı" olarak adlandırdı ve 1974'te piyasaya sürülmesinden bu yana solucan bir dizi Nobel ödüllü deneyde yer aldı.

Bu videoda, laboratuvarda C. elegans'ı korumak için temel yöntemleri göstereceğiz: solucanların barındırılması ve beslenmesi, işlenmesi, dondurulması ve çözülmesi.

Vahşi doğada, C. elegans toprakta bulunur ve çürüyen bitki maddeleri ile beslenir. Laboratuvarda, nematodları mümkün olduğunca mutlu tutmak önemlidir ve bu nedenle onları çok özel yöntemler kullanarak barındırır ve besleriz.

C. elegans, deneyin gereksinimlerine bağlı olarak 16, 20 veya 25 °C'de yetiştirilebilir ve katı veya sıvı ortamda yetiştirilebilir. Her iki durumda da, dünyadaki her solucan laboratuvarında nematod kültürü için özel olarak kullanılan standartlaştırılmış bir E. coli türü olan OP50 ile beslenirler.

25 °C'de yetiştirildiğinde, C. elegans yaşam döngülerini 16 °C'de yetiştirildiği zamana göre 2,1 kat daha hızlı tamamlar. Daha hızlı bir yaşam döngüsü, solucanların daha hızlı olgunlaşması, daha fazla yumurta bırakması ve daha fazla yiyecek tüketmesi anlamına gelir. Solucanların açlıktan ölmesine veya çok kalabalık olmasına izin verilirse, dauer aşaması adı verilen bir larva aşamasına girerler. Dauer larvaları strese dayanıklıdır ve yaşlanmaz.

Katı besiyeri üzerinde muhafaza edildiğinde, C. elegans, nematod büyütme besiyeri veya NGM besiyeri ile hazırlanan agar plakaları üzerinde büyütülür. Tabak yapmadan bir gün önce, sıvı LB ortamını tek bir OP50 E. coli kolonisi ile aşılayın. Ortamı gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak inkübe edin.

Katı ortam yapmak için, bu bileşenlerin uygun miktarlarını ölçün ve bir Erlenmeyer şişesinde deiyonize su ile birleştirin.

En az 15 dakika otoklavladıktan sonra, agarı bir su banyosunda 55 °C'ye soğumaya bırakın. Ortam 55 °C'ye soğuduktan sonra, cam kabı çıplak elle rahatça tutabilmeniz gerekir. Uygun aseptik teknik kullanılarak, bu sırada ilaçlar veya antibiyotikler gibi katkı maddeleri eklenebilir. Karıştırmak için döndürün. Ardından, erimiş NGM'yi 2/3 oranında dolana kadar Petri plakalarına pipetleyin. Yeni yapılan tabakları bir gece tezgahta kurumaya bırakın.

Ertesi sabah OP50'yi 3500 x g'da 10 dakika boyunca peletleyin ve ardından LB ortamındaki bakterileri 10X konsantrasyona yeniden süspanse edin. Şimdi, her tabağa merkezi bir çim pipetleyin. Pipet ucunu NGM'nin yüzeyine dokundurmaktan kaçının ve kültürün plaka duvarlarına temas etmesine izin vermemeye dikkat edin. Plakaları gece boyunca tezgahta kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, sterilize etmek için plakaları UV ışığına maruz bırakın. Artık solucanları kültürlendirirken kullanılmaya hazırlar.

C. elegans, solucan penası olarak bilinen bir araç kullanılarak ayrı ayrı manipüle edilir. Toplama tipik olarak 30 gauge %90 platin ve %10 iridyum telden yapılır, ancak bazı araştırmacılar biraz farklı metal bileşimlerini tercih edebilir. Bir toplama yapmak için, bir Pasteur pipetinin ucunu tercih edilen uzunlukta kırarak başlayın.

Yaklaşık 3 ila 4 cm tel kesin ve 0,5 cm'lik kısmını pipetin ucunun içine yerleştirin. Kabloyu bir Bunsen brülörü üzerinden cama kapatın. Camdan çıkıntı yapan telin uzunluğu yaklaşık 3 ila 3,5 cm'dir ancak bireysel tercihlere göre değişebilir.

Sert bir kenar kullanarak telin ucunu düzleştirin. Ardından düzleştirilmiş kısmı bir kepçe oluşturmak için yukarı doğru bükün. Son olarak, solucana veya agara zarar vermemek için kazmanın kenarlarını zımparalayın.

Solucanları toplamak için, penanın telini bir alev üzerinde sterilize edin. Ardından ucu bir NGM plakasından kalın, yapışkan OP50 E. coli ile kaplayın. Agar yüzeyini delmemeye veya yara izi bırakmamaya dikkat edin.

Bir diseksiyon dürbününden bakarken, solucan penaya yapışana kadar solucanı düzleştirilmiş, yapışkan penanın üzerine hafifçe sürün.

Solucan toplama üzerine geldiğinde, ucu hafifçe tutarak yeni bir plakanın yeni yüzeyine hemen aktarın ve bakteri çimi boyunca kaydırın. Solucan kazmadan sürünmelidir. Solucan pena üzerinde çok uzun süre kalmamalıdır, aksi takdirde kuruyabilir.

C. elegans'ın araştırma için popüler bir model olmasının nedenlerinden biri, kültürlerin herhangi bir olumsuz etki olmaksızın uzun süreler boyunca saklanabilmesidir.

İlk olarak, taze aç larvaları 0.5 ml M9 Tampon kullanarak yıkayın, tüm larva ve yetişkin hayvanları gevşetmek için hafifçe döndürün ve ardından bir mikrosantrifüj veya kriyotüpe aktarın. Daha sonra M9 Tamponuna eşit miktarda %30 gliserol ekleyin. Son olarak, şişeyi yalıtımlı bir kutuya koyun ve -80 °C'de saklayın.

Solucanları kurtarmak için, tüpü -80 dondurucudan çıkarın ve içindekiler tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözülmeye bırakın. Sıvıyı OP50 çimli taze bir NGM plakasına pipetleyin ve 20 °C'de inkübe edin. 2-3 gün sonra 10-15 hayvanı yeni bir tabağa aktarın ve bir nesil boyunca üremelerine izin verin. Dölleri toplayın ve doğru fenotipler için puan alın.

C. elegans'ın laboratuvarda nasıl korunduğunu gördüğümüze göre, deneyler için besleme, barınma ve taşıma koşullarının nasıl değiştirildiğine bir göz atalım.

Nobel ödüllü RNA girişiminin keşfi, araştırmacıların işlevini belirlemek için herhangi bir C. elegans genini susturmalarına izin verdi.

C. elegans'da RNAi'yi önce solucanların yiyeceği hedef gen dsRNA'yı eksprese eden E. coli ile plakalar hazırlayarak indükleyebiliriz.

Daha sonra 4. larva dönemi solucanları RNAi plakalarına aktarılır ve yumurtlamalarına izin verilir. İstenilen gelişim aşamasında, döller toplanır ve fenotipler için puanlanır. Genomumuzun yaklaşık yarısını solucanla paylaştığımız için, toplanan içgörülerin çoğu insan hastalıklarına uygulanabilir.

Hızlı yaşam döngüsü nedeniyle, C. elegans özellikle yaşlanma modeli olarak çok uygundur.

İlk olarak, yetişkin hermafroditlerin NGM plakalarına yumurta bırakmasına izin verilerek, zamanla senkronize edilmiş bir C. elegans popülasyonu oluşturulur. Solucanlar 6-8 saat yumurta bırakır ve sonra çıkarılır.

Solucanlar istenen aşamaya geldiklerinde bakteri kontaminasyonunu önlemek için ampisilin ve üremeyi önlemek için FUDR içeren yeni NGM plakalarına aktarılırlar.

Bu noktadan itibaren, tüm solucanlar ölene kadar her 2-3 günde bir yetişkin solucanlar gözlenir. Ölü solucanlar plakadan çıkarılır ve canlı ve ölü solucanların sayısı kaydedilir.

Yaşam süresini genetik veya çevresel hakaretler bağlamında analiz etmek, yaşlanma sürecine ilişkin önemli bilgiler sağlayabilir.

Lazerler kullanarak, sinir hücrelerinin nasıl yenilendiğini incelemek için canlı C. elegans'da aksotomiler veya tek tek aksonların kesilmesi mümkündür.

Ancak, solucanlar asla hareketsiz kalmadıkları için, mikro boncuk çözeltisinde% 10 agaroz pedlerine yerleştirilirler. Üstüne bir kapak fişi yerleştirilir. Mikro boncuklar, ped-lamel etkileşiminin sürtünme katsayısını artırarak solucanı yerinde etkili bir şekilde dondurur.

Slayt artık aksotomi yapmak için hazırlanmıştır. Nöronlar görüş alanına getirilir ve mikroskopta ortalanır. Lazer daha sonra ayak pedalı kullanılarak ateşlenir. Optimum lazer gücü, bitişik yapılara zarar vermeden nöronu kesecektir. Hayvan başına mümkün olduğu kadar çok akson kesilir.

Agaroz pedi daha sonra slayttan dikkatlice çıkarılır ve solucanların 20 ° C'de tohumlanmış bir NGM plakası üzerinde iyileşmesine izin verilir. Aksotomiden 8-48 saat sonra, nöronlar rejenerasyon için skor almaya hazırlanabilir. Kesiğin distal kısmında, nöron bir güdük oluşturur. Bununla birlikte, proksimal kısımda nöron, uzamış nöritler oluşturarak yeniden üretilir.

Az önce JoVE'nin temel Ceanorhabditis elegans bakımını üstlenmesini izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: C. elegans'ın barındırılması ve beslenmesi, bunların işlenmesi ve nematodların dondurulması ve geri kazanılması.

Ayrıca C. elegans bu kadar güçlü bir araştırma aracı yapan bazı uygulamalar hakkında kısa bir tur attık. C. elegans birçok yönden memelilere benzemese de, benzer genetik yapıları, bakım kolaylıkları ve basit manipülasyonları onları memeli biyolojisini ve hastalıklarını anlama arayışında önemli bir model haline getirmektedir. İzlediğiniz için teşekkürler!

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ceanorhabditis elegans, çeşitli gelişimsel, genetik, moleküler ve hatta fiziksel olayları incelemek için model bir organizma olarak büyük başarı ile k…