Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği yaması oluşturmak için hücre tabakaları kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle hücre kültürü yüzeyinin p nipam olarak da adlandırılan termo-hassas polimer polipropil akrilamid ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre tabakaları oluşturmak için ilgili hücrelerin polimer kaplı yüzeyde yüksek yoğunlukta kültüre edilmesidir.

Ardından, plaka sıcaklığı düşürülerek tabakalar kaldırılır; bu işlem, hücrelerin plakadan bir hücre tabakası halinde ayrılmasını sağlar. Son adım, bozulmamış hücre tabakalarını yırtmadan implantasyon için bir konstrükte taşımaktır. Nihayetinde, implante edilebilir bir doku mühendisliği materyali oluşturulurken, hücre tabakasının oluşturulduğunu ve manipülasyon sırasında korunduğunu göstermek için basit ışık mikroskobu kullanılabilir.

Bu tekniğin, hücreleri hidrojeller gibi matrislerin içine gömen mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin lateral sınırlarının fonksiyonel bir doku olarak oluşturulabilmesi ve korunabilmesidir. Bu yöntemler aynı zamanda doku mühendisliği alanındaki daha ileri çalışmalara da olanak sağlayabilir. Örneğin, hücreler bu organize durumdayken transplantasyon sonrası ne kadar iyi hayatta kalırlar?

Bu prosedürü, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. William Turner ve Bayan Snapshot sand do uygulamalı olarak göstereceklerdir. Bu prosedüre başlamak için 2,6 gram P nipam'ı %60 toluen ve %40 heksan içeren iki mililitrelik bir çözelti içinde çözün. Ardından, karışımı 60 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve P nipam çözünene kadar karıştırın.

Ardından filtre kağıdını 60 milimetre çapında bir daire şeklinde kesin ve bir büchner hunisine yerleştirin. Çözeltiyi büchner hunisi aracılığıyla önceden tartılmış bir cam behere filtreleyin. Beheri ve içeriğini gece boyunca vakum desikatöründe bekletin.

Ardından, p nipam içeren beheri tartın. Daha sonra, ağırlıkça %50 %50'lik bir çözelti oluşturmak için P nipam'a izopropil alkol ekleyin. Sonra, çözeltiden iki mililitreyi doku kültürü plağının yüzeyine yerleştirin ve UV ışığı altında beş dakika boyunca kaplayın.

Ardından, hücre kültürü için kullanmadan önce plakayı iki mililitre sıcak PBS ile iki kez yıkayın. Bu prosedürde, önce hücreleri iki mililitre sıcak PBS ile yıkayarak sıçan aortik düz kas hücrelerini izole edin. Daha sonra, hücrelere üç mililitre tripsin veya başka bir parçalayıcı disosiyasyon çözeltisi ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Ardından hücrelere %10 FBS içeren üç mililitre kültür medyumu veya PBS ekleyin. Sonrasında hücreleri konik bir tüpe toplayın ve sayımını yapın. Daha sonra hücreleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edin.

Süpernatantı aspire edin ve hücreleri büyüme medyumunda yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri içeren medyumu, %100 konfluansa ulaşacak bir konsantrasyonda 35 milimetrelik termohassas bir plakaya yerleştirin ve hücrelerin plağa adezyonunu sağlamak için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Şimdi endotel hücrelerini toplayın ve bunları tek hücreli bir çözelti haline getirin.

Tek hücreli dağılım için 1x tripsin, Accutase veya hücre ayrıştırma tamponu da kullanılabilir. Ardından, tripsin enzimi eşit miktarda soya fasulyesi tripsin inhibitörü veya PBS içinde %10 FBS ile etkisiz hale getirin. Daha sonra hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe toplayın.

Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve dört milimetrelik bir yama için gerekli hacmi hesaplayın; ardından 2 milyon endotel hücre kullanın, 2 milyon hücreyi çekerek yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca santrifüjleyin ve supernatantı aspire ederek hücrelerin konik tüpte pelet olarak kalmasını sağlayın. Şimdi, şirket protokolüne uygun olarak yüksek aurin hidrojeli hazırlayın.

Yüksek aurin ve sıvı jelatini bire bir oranda karıştırın. Ardından, toplam nihai hacmin %80'ini pellet içeren konik tüpe aktarın ve endotel hücrelerini yüksek aurinli jelatin karışımı içinde yeniden süspande edin. Son olarak, süspande edilen hücreleri fibröz matrise aktarın.

Toplam final hacmin %20'si kadar çapraz bağlayıcı ekleyin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu adımda, hücreleri içeren 35 mm'lik P nypa işlem görmüş plakayı inkübatörden çıkarın ve bir hücre kültürü davlumbazına yerleştirin. Oda sıcaklığında, hücrelerin üzerindeki medyumu hızla aspire edin.

Ardından, jelatin henüz sıcakken plakaya iki mililitre 37 °C, %6 normal jelatin ekleyin, metal kafesi normal jelatinin yüzeyinin altına gelecek şekilde jelatinin içine yerleştirin. Sonrasında, jelatinin sertleşmesi için tüm plakayı beş ila yedi dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Yedi dakika sonra, bir spatula kullanarak jelatin kenarlarını plaka kenarlarından dikkatlice ayırın.

Ardından, metal kafesi pens yardımıyla plakadan kaldırın. Hücre tabakasını kaba aktarın ve lifli matris hidrojel kombinasyonunun üzerine yerleştirin. Doku kültürü plağına iki mililitre 37 °C besiyeri ekleyin ve hücre tabakasının hidrojel yüzeyine yapışmasını sağlamak için gece boyunca inkübe edin.

Bu sırada, çözelti ısındıktan sonra metal kafesi çıkarın. Burada hücreler, Pippa kaplı bir yüzeyde kültüre edilmiş ve ardından bir tabaka halinde lifli matrisin yüzeyine taşınmıştır. Jelatin metal kafes ile transfer edilmeyen ilk denemeler, küçük ve parçalanmış yamalarla sonuçlanmıştır.

Bu görüntü; mito tracker, kırmızı boyalı sıçan aortik düz kas hücreleri, kalsiyum am green floresan insan göbek kordonu ven endotel hücreleri ve iletilmiş ışık görüntüsünü birleştiren erken bir yama tasarım kompozit resmini temsil etmektedir. Bu ise hücre tabakasının daha güçlü baz lifli matriks hidrojel kombinasyonu ile birleştirilmiş halinin kompozitidir. Bu kompozit görüntü, yamanın altından daha güçlü baz lifli matriks aracılığıyla alınmış olup, hücre tabakalarının bu kompozit resmi baz lifli matriks üzerinden alınmıştır.

Tabaka halindeki hidrojel kombinasyon hücreleri, hücrelerin kümelenmesi nedeniyle kenarlarda artan floresans gösteren baz lifli matris hidrojel kombinasyonunu kaplar. Bu, konstrüktün bir transmisyon görüntüsüdür ve DPI'daki otofloresent doğal lifli baz matris burada gösterilmiştir. Bu prosedürün ardından, diğer doku mühendisliği deneyleri, hücre hizalanması ve iletişiminin transplantasyon başarısını nasıl etkilediği gibi diğer sorulara yanıt verebilir.

Bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların birden fazla hücre tipini nakletmenin karmaşık yollarını keşfetmelerine olanak tanır. Solventlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken uygun maskelerin takılması ve kimyasal çeker ocakların kullanılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.