Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Bu prosedürün genel amacı, doku mühendisliği yapılmış bir yama oluşturmak için hücre tabakalarını kullanmaktır. Bu, ilk olarak hücre kültürü yüzeyinin, p nipam olarak da adlandırılan ısıya duyarlı polimer polipropil akrilamid ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre tabakaları oluşturmak için ilgilenilen hücreleri polimer kaplı yüzey üzerinde yüksek yoğunlukta kültürlemektir.

Daha sonra, hücrelerin bir hücre tabakası olarak plakadan ayrılmasına izin veren plaka sıcaklığı düşürülerek tabakalar kaldırılır. Son adım, sağlam hücre tabakalarını implantasyon için bir yapıya yırtmadan hareket ettirmektir. Sonuç olarak, basit ışık mikroskobu, implante edilebilir bir doku mühendisliği materyali oluşturulurken hücre tabakasının manipülasyonu sırasında oluşturulduğunu ve korunduğunu göstermek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, hücreleri hidrojeller gibi matrislere gömecek olan mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu teknikte hücrelerin yan sınırlarının fonksiyonel bir doku olarak oluşturulabilmesi ve korunabilmesidir. Bu yöntemler aynı zamanda doku mühendisliği alanında daha ileri çalışmalara da olanak sağlayabilir. Örneğin, hücreler bu organize durumdayken transplantasyondan sonra ne kadar iyi hayatta kalırlar?

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr.William Turner ve Bayan Snapshot kum do. Bu işleme başlamak için, 2.6 gram P nipam'ı iki mililitre% 60 toluen,% 40 heksan çözeltisi içinde çözün. Daha sonra, karışımı 10 dakika boyunca 60 santigrat dereceye ısıtın ve P nipam eriyene kadar karıştırın.

Daha sonra filtre kağıdını 60 milimetre çapında bir daire şeklinde kesin ve bir buchner hunisine yerleştirin. Çözeltiyi Buchner hunisinden önceden tartılmış bir cam behere süzün. Beheri ve içindekileri gece boyunca bir çan vakumunda tutun.

Daha sonra, kabı p nipam ile tartın. Daha sonra, 50 50 ağırlığında bir çözelti oluşturmak için P nipam'a izopropil alkol ekleyin. Daha sonra doku kültürü plakasının yüzeyine iki mililitre solüsyon yerleştirin ve UV ışığı altında beş dakika boyunca kaplayın.

Daha sonra plakayı hücre kültürü için kullanmadan önce iki mililitre ılık PBS ile iki kez yıkayın. Bu prosedürde, ilk olarak, hücreleri iki mililitre ılık PBS ile yıkayarak sıçan aort düz kas hücrelerini izole edin. Daha sonra, hücrelere üç mililitre tripsin veya başka bir ayrışma çözeltisi ekleyin ve beş dakika inkübe edin.

Daha sonra hücrelere üç mililitre kültür ortamı veya %10 FBS içeren PBS ekleyin. Bundan sonra, hücreleri konik bir tüpte toplayın ve sayın. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 1000 RPM'de döndürün.

Süpernatanı aspire edin ve büyüme ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri içeren ortamı% 100 Birleşme elde edecek bir konsantrasyonda 35 milimetre ısıya duyarlı bir plaka üzerine yerleştirin, daha sonra hücrenin plakaya yapışmasını sağlamak için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Şimdi endotel hücrelerini toplayın ve bunları tek bir hücre çözeltisine dağıtın.

Tek hücre dispersiyonu için bir x tripsin, akupinat veya hücre ayrışma tamponu da kullanılabilir. Daha sonra, tripsin enzimini eşit miktarda soya fasulyesi tripsin inhibitörü veya PBS'de% 10 FBS ile devre dışı bırakın. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

Hücreleri bir hemo sitometre ile sayın ve dört milimetrelik bir yama için yama boyutları için gereken hacmi hesaplayın, bundan sonra 2 milyon endotel hücresi kullanılır, 2 milyon hücre çıkarılır ve bunları 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe yerleştirin. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri konik tüpte bir pelet olarak bırakın. Şimdi yüksek aurin hidrojelini şirket protokolüne uygun olarak hazırlayın.

Yüksek aurin ve sıvı jelatini bire bir oranında karıştırın. Daha sonra, toplam nihai hacmin% 80'ini pelet içeren konik tüpe aktarın, yüksek aurin jelatin karışımındaki endotel hücrelerini yeniden süspanse edin. Daha sonra, askıya alınmış hücreleri lifli matrise aktarın.

Çapraz bağlayıcının toplam nihai hacminin% 20'sini ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu adımda, hücreleri içeren 35 milimetre P nypa ile muamele edilmiş plakayı inkübatörden çıkarın ve bir hücre kültürü başlığına yerleştirin. Oda sıcaklığında, ortamı hücrelerden hızlı bir şekilde aspire edin.

Daha sonra jelatin hala sıcakken plakaya iki mililitre 37 santigrat derece,% 6 normal jelatin ekleyin, metal kafesi jelatinin içine yerleştirin ve normal jelatinin yüzeyinin altına batırın. Daha sonra, jelatinin sertleşmesine izin vererek tüm plakayı beş ila yedi dakika buzun üzerine koyun. Yedi dakika sonra, jelatin kenarlarını plakanın kenarından dikkatlice ayırmak için bir spatula kullanın.

Daha sonra, metal kafesi forseps ile plakadan kaldırın. Hücre tabakasını tabağa aktarın ve lifli matris hidrojel kombinasyonunun üzerine yerleştirin. Doku kültürü plakasına iki mililitre 37 santigrat derece ortam ekleyin ve hücre tabakasının hidrojel yüzeyine yapışmasını sağlamak için gece boyunca inkübe edin.

Bu arada, çözelti ısındıktan sonra metal kafesi çıkarın. Burada, hücreler Pippa kaplı bir yüzey üzerinde kültürlendi ve daha sonra fibröz matrisin yüzeyine bir tabaka halinde hareket ettirildi. Jelatin metal kafes ile aktarılmayan erken denemeler, küçük püskü yamalar ile sonuçlandı.

Bu görüntü, mito izleyiciyi, kırmızıya boyanmış sıçan aort düz kas hücrelerini, kalsiyum ve yeşil floresan insan göbek damarı endotel hücrelerini ve iletilen ışık görüntüsünü birleştiren erken bir yama tasarımı kompozit resmini temsil eder. Ve bu, daha güçlü baz fibröz matris hidrojel kombinasyonu ile birleştirilmiş hücre tabakasının bileşimidir. Bu kompozit görüntü, yamanın altından daha güçlü bir baz fibröz matris yoluyla alındı ve hücre tabakalarının bu kompozit resmi, baz fibröz matris üzerinden çekildi.

Tabakadaki hidrojel kombinasyon hücreleri, hücrelerin demetlenmesi nedeniyle kenarlarda artan floresan gösteren baz fibröz matris hidrojel kombinasyonunu kaplar. Bu, yapının bir iletim görüntüsüdür ve DPI'daki otofloresan doğal lifli baz matrisi burada gösterilmiştir. Bu prosedürü takiben, diğer doku mühendisliği deneyleri, hücre hizalaması ve iletişimin transplantasyon başarısını nasıl etkileyeceği gibi diğer sorulara cevap verebilir.

Bu teknik, doku mühendisliğindeki araştırmacıların birden fazla hücre tipini nakletmenin karmaşık yollarını keşfetmelerine olanak tanır. Solventlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken her zaman uygun maskeler ve kimyasal başlıklar takmak gibi önlemler alınmalıdır.