Pankreas Nöroplastisite benzetme:

Aşağıdaki deneyin genel amacı, periferik nöronların farklı pankreas mikroortamlarına karşı gösterdiği reaktif değişiklikleri incelemektir. Bu, öncelikle normal insan pankreasından ve hastalıklı pankreas dokusundan tüm doku lizatlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, yeni doğmuş sıçanlardan DRG hücreleri izole edilir ve bu hücreler daha sonra izole edilen doku lizatları ile işleme tabi tutulur.

Ardından, 48 saatlik inkübasyonun ardından hücreler, sonraki çift immünofloresan boyama işlemi için fikse edilir. Sonuçlar, farklı doku ekstraktlarında kültüre edilen nöronların nörit yoğunluğu dallanma paternleri ve glial yoğunlukları arasındaki farkları göstermektedir. Bu yöntem, farklı GİS hastalıklarında nöroplastik değişikliklerin moleküler medyatörlerin rolü gibi nörogastroenteroloji alanı çalışmalarını kolaylaştırmaya yardımcı olabilir.

Bu yöntem, pankreas hastalıklarının farklı nörotrofik özellikleri hakkında bilgi sağlayabilse de, kanserler veya tüm gastrointestinal sistemin inflamatuar durumları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemi kullanma fikri ilk olarak, pediatric sistemdeki Ong hastalığı gibi nöropatik hastalıklar alanında çalışan araştırmacılarla iş birliklerimize başladığımızda ortaya çıktı ve bu yöntemi insan pankreas dokusunu homogenize etmek amacıyla kendi çalışmalarımıza uyguladık. Beş x beş x beş milimetrelik pankreas dokusu küplerini -80 °C'den doğrudan sıvı azota aktarın.

Ardından, dondurulmuş blokları önce metal bir disosiasyon bilyesi içerebilen homojenizasyon tüplerine yerleştirin ve ardından doku homojenizatörüne koyup, disosiasyonun hemen ardından dokunun çözülmesine izin vermeden homojenize edin. Katı toz benzeri homojenatı 300 ila 500 µL buz gibi soğuk 0.1 XPBS içinde yeniden süspanse edin. Herhangi bir lizis tamponu kullanmayın, çünkü bu durum.

Nöronları parçalayın ve ardından homojenizeyi 4 °C'de, 21.130 ×g'de en az 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Doku ekstraktını içeren berrak süpernatantı toplayın; insan pankreas hücre hatlarından hücre hattı süpernatantı toplamak için hücreleri normal büyüme ortamında en az %70 ila %80 konfluense kadar kültüre edin.

Hücreler hazır olduğunda, onları hücre kültürü kalitesinde PBS ile en az üç kez yıkayın ve 48 saate kadar serumsuz ortamda kültüre edin. Ardından, doku homojenatının veya hücre hattı süpernatanlarının protein konsantrasyonunu Bradford protein analizi ile ölçün. Sonrasında, doku ekstraktlarını ve hücre hattı süpernatanlarını, nöronal ortamdaki ekstrakt veya süpernatan nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde alikotlayın.

Ve bunları -80 °C'de saklayın. Dekapite edilmiş P2 ile P12 arası yeni doğmuş sıçan kullanarak cildi kesin ve vertebral kolonu açığa çıkarın. Ardından, spinal kordu açığa çıkarmak için anterior laminektomi gerçekleştirin.

Ardından, dorsal kök ganglionlarını veya DRG'leri açığa çıkarın ve alın. DRG'yi, Gentamycin ve metronidazol içeren buz gibi soğuk MEM içerisine yerleştirin. Kaudal DRG'lerden başlayarak üst servikal DRG'lere doğru ilerleyerek DRG'leri toplamaya devam edin.

İşlem tamamlandığında, 24 kuyucuklu bir plaka için yeterli olacak şekilde 52 DRG toplanır. Ardından, DRG'leri köklerinden ve sinirlerinden ayırmak için mikro makas kullanın. Daha sonra geri kalan tüm periferik ve merkezi projeksiyonları kesin.

DRG'lerin toplanmasının ardından, bunları kolajenaz tip iki içeren HBSS içerisinde 37 °C'de 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, DRG'leri çapı giderek azalan şırıngalar yardımıyla trite edin.

Aşırı tri'nin nöronları yok edebileceğine ancak glia üzerinde daha az yıkıcı olduğuna dikkat edin. DRG'leri içeren ortam bulanıklaştığında, süspansiyonu 93.9 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından ortamı uzaklaştırın ve yeniden süspanse edin.

Hücreleri kültür için hazırlamak amacıyla nörobazal medyuma süspande edin. Toplam nöron ve glia sayısını tahmin etmek için bir hemositometre kullanın. Ardından hücreleri 13 milimetrelik önceden kaplanmış lameller üzerine ekimleyin.

24 kuyucuklu bir plaka kullanıldığında, kullanılan kaplama deneysel amaçlara bağlıdır. Ardından, kuyucuklar neuro basal besiyeri ile doldurulur ve hücrelerin kuyucuklara tutunması için gece boyunca beklenir. Ertesi gün, doku ekstraktı eklenmiş besiyeri veya hücre hattı süpernatı eklenmiş besiyeri çözdürülür.

Ardından, DRG'lerden ekim ortamını aspire edin ve isteğe bağlı olarak PBS ile çok nazik bir yıkama işlemi gerçekleştirin. Daha sonra, 100 µg/mL konsantrasyon elde edecek şekilde, doku ekstraktı eklenmiş ortamı veya hücre hattı süpernatı eklenmiş ortamı hücrelerin üzerine yavaşça pipetleyin. Şimdi hücrelerin, doku ekstraktı veya hücre hattı süpernatı içeren ortamda 37 °C'de 48 saat boyunca büyümesini bekleyin.

Besiyerini aspire edin ve immün boyama için %4 paraformaldehit ile tespit edin. Çift immünofloresan boyama için morfolojik geometri amacıyla nöron spesifik ve glia spesifik markörler kullanın. 200 x büyütme kullanarak nörit yoğunluğunu ölçmek için CCD kamera ile donatılmış ve otomatik yazılımla kombine edilmiş ters ışık mikroskobu kullanın.

50 x 50 mikronluk bir ızgara üst üste bindirerek ve kesişen liflerde ölçülen kare başına lif yoğunluğunu sayarak nöronal kültürlerin nörit yoğunluğunu ölçün. Bu analizi, her lam üzerindeki dört ila beş temsili fotomikrografta, en yoğun büyümenin olduğu dört farklı bölge için tekrarlayın. Her lamdan rastgele seçilen 30 münferit nörondan nöritleri ve perisoma işaretleyerek, nörit uzamasındaki nöron başına ortalama dal sayısı, ortalama dal uzunluğu ve perisoma boyutunu ölçün; normal pankreas doku özütü ile kültüre edilmiş DRG nöronları burada gösterilmiştir.

Buna karşılık, kronik pankreatit veya pankreas kanseri doku ekstraktları ile kültüre edilen DRG nöronları, gösterilen daha yüksek bir nörit yoğunluğu sergiler. Burada, çeşitli insan pankreas dokusu ekstraktları ile kültüre edilen miyenterik pleksus nöronları yer almaktadır.

Kronik pankreatit veya pankreas kanseri ekstraktlarında büyütülen miyenterik pleksus nöronları, normal pankreas ekstraktlarında büyütülenlere göre daha uzun nöronlar oluşturur ve daha karmaşık bir dallanma paterni sergiler. DRG nöronları pankreas kanseri hücrelerinden elde edilen süpernatant ile kültüre edildiğinde, doku ekstraktlarında gözlemlenene benzer şekilde nöron yoğunluğunda bir artış da gözlemlenmiştir. Ancak bu artış, nörotropin veya sinir büyüme faktörü gibi seçili nörotrofik faktörler tüketildiğinde veya bloke edildiğinde geri döndürülebilir niteliktedir.

Ggl hücreleri aynı zamanda farklı pankreas doku ekstraktlarına, kronik pankreatit veya pankreas kanseri ekstraktlarına farklı tepkiler verir; doku, DRG kaynaklı glial kültürlerde glial büyümeyi ve glial hücre sayılarını artırmıştır. Bu etki, kronik pankreatit ekstraktlarına kıyasla pankreas kanseri ile daha belirgin olsa da, teknik bir kez kavrandığında ve geliştirilmesinden sonra uygun şekilde yürütülürse dört ila beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu yöntem, nörogastroenteroloji alanındaki araştırmacıların, inflamatuar ve malign GİS bozuklukları da dahil olmak üzere farklı GİS hastalıklarındaki nöroplastisite mekanizmalarını araştırmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, pankreatik nöroplastisiteyi incelemek için periferik nöronların nasıl izole edileceği ve bu sistemin GİS bozukluklarındaki diğer nöral değişiklikler ve diğer nöroplastisite analizleri için nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.