How does RNA interference work to silence genes in C. elegans?

Double-stranded RNA enters C. elegans cells after ingestion. The enzyme Dicer cleaves dsRNA into short interfering RNA (siRNA), 21-23 nucleotides long. The siRNA associates with the RNA-induced silencing complex (RISC) and binds target mRNA via complementary base pairing, leading to mRNA degradation and gene knockdown.

What is the first step in preparing bacteria for RNAi experiments?

Transform the plasmid encoding your target dsRNA into HT115(DE3) E. coli strain, which lacks RNA polymerase III and contains an IPTG-inducible T7 DNA polymerase gene. Also transform bacteria with an empty plasmid as a control. Spread transformed bacteria on LB agar plates containing tetracycline and carbenicillin, then incubate overnight at 37°C.

Why is worm synchronization important before RNAi treatment?

Synchronizing developmental stages ensures that observed phenotypic differences result from gene knockdown rather than developmental variation. Transfer L4 worms to RNAi plates overnight at 20°C to become young adults, then move them to new plates for 6-8 hours to lay eggs. This produces developmentally synchronized progeny for analysis.

How do researchers use RNAi to perform reverse genetic screens?

Reverse genetic screens knock down known genes from a library and assess phenotypic results to discover gene function. Researchers culture bacteria expressing dsRNA for many C. elegans genes on multi-well plates and feed them to worms. Phenotypic effects reveal normal in vivo gene functions and can be automated for high-throughput analysis of thousands of genes.

What happens during the bacterial culture preparation phase?

Select a single bacterial colony and add it to 1 ml LB broth with 100 μg/ml ampicillin. Incubate overnight at 37°C with agitation. Then add 5 ml fresh LB broth with ampicillin and incubate 4-6 hours at 37°C. This culture is then added to RNAi worm plates and incubated overnight at 37°C to create a bacterial lawn.

What phenotypes can be observed when analyzing RNAi-treated worms?

Compare RNAi knockdown worms with controls and note differences in size, developmental stage, morphology, and localization patterns of fluorescently tagged proteins. Scientists can also assess developmental timing effects, such as genes that delay development when knocked down, or genes involved in organ development and other biological processes.

How is a microscope slide prepared to visualize C. elegans?

Tape two glass slides with labeling tape as spacers. Place a clean slide between them and pipet 150 μl of 4% molten agar onto it. Cover with a perpendicular slide, then gently separate. Add 10 μl sodium azide anesthetic to the agar pad, transfer worms using a platinum wire pick, add a cover slip, and observe under a microscope.

C. elegans'ta RNAi

0 görüntüleme09:51 dk

RNA interferansı veya RNAi, çift zincirli RNA'nın bir organizmaya verilmesiyle gerçekleştirilen ve hedefli gen susturulmasıyla sonuçlanan yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. RNA interferansının Nobel ödüllü keşfi, araştırmacıların fonksiyonunu belirlemek amacıyla herhangi bir C. elegans genini susturabilmesine olanak sağlamıştır. C. elegans'da RNAi'yi, öncelikle solucanların tüketeceği hedef gen dsRNA'sını eksprese eden E. coli içeren plakalar hazırlayarak indükleyebiliriz. Ardından, 4. larval evredeki solucanlar RNAi plakalarına aktarılır ve yumurta bırakmalarına izin verilir. Gelişimin istenen aşamasında yavrular toplanır ve fenotipler açısından değerlendirilir.

RNAi teknolojisi, C. elegans'da ters genetik taramalar, otomatik yüksek kapasiteli taramalar yapmak için ve gelişimsel süreçleri inceleyen bir araç olarak sıklıkla kullanılır. Bu videoda, RNA interferansı kavramını açıklayacak, RNAi tekniğinin C. elegans'ta nasıl kullanılacağını gösterecek ve bilim insanlarının yaygın biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için RNAi'yi bir araç olarak nasıl kullandıklarını tartışacağız.

Öncelikle RNA interferansının nasıl çalıştığını göstererek başlayalım. C. elegans söz konusu olduğunda, solucanlar, susturmak istediğiniz gene komplementer çift sarmallı RNA kodlayan plazmidlerle transforme edilmiş bakterilerle beslenir. Daha önce belirtildiği gibi, C. elegans transforme edilmiş bakterilerle beslenecektir. Şu an için bilinmeyen bir mekanizma aracılığıyla, dsRNA sindirildikten sonra C. elegans dokusuna girer.

Hücre içine girdikten sonra, Dicer enzimi çift sarmallı RNA'yı 21 ile 23 nükleotid uzunluğunda olan kısa interferans RNA'ya veya siRNA'ya parçalar. Ardından, siRNA, "RISC" olarak da bilinen RNA kaynaklı susturma kompleksi ile birleşir ve sarmalı çözülür. Daha sonra, siRNA/RISC kompleksi, komplementer baz eşleşmesi yoluyla hedef mRNA'ya bağlanır. Bu durum mRNA'nın degradasyonuna yol açarak söz konusu genin ekspresyonunu azaltır.

Prosedüre başlamadan önce, ilgili çift zincirli RNA'yı eksprese eden bakterilerin hazırlanması gerekir. Binlerce gen için dsRNA kodlayan plazmitler içeren bakteri kütüphaneleri ticari olarak temin edilebilir. Aksi takdirde, hedef gen dizisinin standart klonlama teknikleri kullanılarak bir plazmite klonlanması gerekir. Plazmit, plazmit içeren bakteri kolonilerini seçmek için kullanılabilecek ampicillin antibiyotiğine karşı direnç geni içerir.

Ardından, ilgili dsRNA'nızı kodlayan plazmidi, çift zincirli RNA'yı eksprese edecek E. coli bakterisinin (DE3) suşuna transform etmek için standart teknikleri kullanın. Ayrıca, kontrol olarak bakterileri boş bir plazmit ile transforme edin. Önemli bir nokta olarak, bu deneylerde kullanılan E. coli suşu, aksi takdirde çift zincirli RNA'yı sindirecek olan RNA polimeraz III'ten yoksundur. Bu bakteri ayrıca, plazmitteki dsRNA'yı transkribe eden T7 DNA polimeraz için IPTG indüklenebilir bir gen içerir. Son olarak, RNA polimeraz III ekspresyonunu sürdürmek ve istenmeyen bakteri büyümesini önlemek için (DE3) bakterileri hem tetrasiklin hem de karbenisilinye dirençlidir.

Transforme edilmiş HT115(DE3) bakterilerini 12,5 μg/ml tetrasiklin ve 25 μg/ml karbenisilin içeren LB agar plaklarına ekin. 37 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi sabah plaklarda bakteri kolonileri oluşacaktır. Ardından, tek bir bakteri kolonisi seçin ve plazmit içeren bakterileri seçmek için bu koloniyi 100 μg/ml ampicillin içeren 1 ml LB besiyerine ekleyin. 37 °C'de ajitasyonla gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, kültüre 100 μg/ml ampicillin içeren 5 ml LB besiyeri ekleyin ve 37 °C'de ek olarak 4-6 saat inkübe edin.

Bakteriler hazır olduğunda, besleme için RNAi solucan plakalarının hazırlanması gerekir. RNAi solucan plakaları şunları içerir: agar, su, karbenisilin, solucan besiyeri karışımı ve plazmiddeki dsRNA'yı transkribe eden bakterilerdeki T7 DNA polimerazı indüklemek için IPTG. RNAi solucan plakalarına 0.5 ml bakteri kültürü ekleyin ve bakteriyel bir çim oluşturmak için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Solucanları RNAi plakalarına eklemeden önce, fenotipte gözlemlenen herhangi bir farkın gelişimsel aşamanın bir artefaktı olmaması için solucanların gelişimsel aşamasını senkronize etmek önemlidir. Gelişimsel aşamaları senkronize etmek için öncelikle platin bir tel döngüyü alevle sterilize edin.

Her bir RNAi plakasına L4 solucanları eklemek için solucan döngüsünü kullanın ve genç yumurta bırakan yetişkinler haline gelmeleri için 20 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, genç yetişkinleri yeni bir RNAi plakasına aktarın ve yumurtaların bırakılacağı 20 °C'de 6-8 saat boyunca inkübe edin. Tüm yetişkinler uzaklaştırıldığında, bu yumurtalar gelişimsel olarak senkronize olacaktır. Son olarak, solucanların analiz için ilgilenilen gelişimsel aşamaya ulaşana kadar RNAi plakalarında büyümesine izin verin.

Solucanları görüntülemek için %4'lük agar ped içeren bir lam hazırlanmalıdır. Öncelikle, agar pedinin tekdüze bir kalınlıkta olmasını sağlayacak ara boşluklar oluşturmak için 2 cam lamı etiketleme bandıyla bantlayın. İki ara boşluğun arasına temiz bir cam lam yerleştirin ve lam üzerine yaklaşık 150 μl %4'lük eritilmiş agar pipetleyin. Eritilmiş agarı, ara boşluklara dik olacak şekilde ek bir lamla hızla kapatın. Lamları nazikçe ayırdığınızda agar ped lamlardan birine yapışmış olacaktır.

Ardından, hayvanları immobilize etmek için agar pedine sodyum azide gibi 10 μl'lik bir anestetik ekleyin. Platin tel bir pens kullanarak solucanları anestetik içeren agar pede aktarın ve üzerine bir kapatma camı ekleyin. Son olarak, solucanları mikroskop altında gözlemleyin. RNAi gen susturmasına maruz kalmış solucanları kontrollerle karşılaştırın; boyut, gelişim aşaması, morfoloji, floresan işaretli proteinlerin lokalizasyon modelleri ve diğer potansiyel fenotiplerdeki farklılıkları not edin.

RNA interferansının en değerli uygulamalarından biri, ters genetik taramaların kolayca gerçekleştirilebilme yeteneğidir. Ters genetik tarama, bilinen bir gen koleksiyonunu susturarak (knockdown) ve fenotipik sonucu değerlendirerek gen fonksiyonunu keşfetmeye yönelik bir yaklaşımdır. Örneğin araştırmacılar, C. elegans genomundaki neredeyse tüm genler için dsRNA eksprese eden bir bakteri kütüphanesi kullanabilirler. Bu bakteriler çok kuyucuklu plakalarda kültüre edilir ve solucanlara yedirilir. Ardından, birçok genin RNAi susturulmasının fenotipik etkileri değerlendirilerek, normal in vivo gen fonksiyonları hakkında bilgi edinilebilir.

Otomatik genetik taramalar, son derece yüksek kapasiteli bir ters genetik tarama türüdür. Otomatik genetik taramalarda, binlerce bakteri klonunun robotik olarak yönetilmesi ve kantitatif analizler için özelleşmiş cihazların kullanılması sayesinde, tüm C. elegans genomu çok kolay bir şekilde susturulabilir.

Örneğin, antimikrobiyal peptid geni nlp 29 için transgenik floresan raporlayıcı eksprese eden solucanlar, bakteriyel besleme yoluyla binlerce genin RNAi susturulmasına tabi tutulur. Aynı zamanda solucanlar mantar sporlarına maruz bırakılır. Ardından, mantara karşı verilen antimikrobiyal peptid yanıtı değerlendirilebilir.

C. elegans gelişimi sıklıkla RNAi kullanılarak incelenmektedir. Bilim insanları, ilgilenilen herhangi bir geni (veya gen grubunu) susturmak ve bu genin gelişim sırasındaki süreçleri ve/veya gelişimsel zamanlamayı tam olarak nasıl etkilediğini değerlendirmek için RNA interferansını kullanabilirler. Örneğin, RNAi susturma işlemi, susturulduğunda gelişimi geciktiren genleri veya organ gelişiminde rol oynayan genleri ortaya çıkarabilir.

JOVE'nin C. elegans'ta RNA interferansına giriş videosunu izlediniz. RNA interferansının nasıl çalıştığını ve bakteriyel besleme yoluyla C. elegans'ta RNA interferansının nasıl kullanılacağını gözden geçirdik. RNA interferansı, otomatik yüksek kapasiteli taramalar da dahil olmak üzere ters genetik taramalar için değerli bir araçtır ve ayrıca gelişimi incelemek için faydalı bir yöntemdir. İzlediğiniz için teşekkürler!

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA interferansı (RNAi), çift zincirli RNA'nın bir organizmaya eksojen olarak verilmesiyle hedef genin susturulmasının sağlandığı yaygın olarak kullan…

Browse More Videos

RNA nterferans

Gen Susturma

Ters Genetik Tarama

Bakteriyel Besleme

Solucan Senkronizasyonu