Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar

Bu prosedürün genel amacı, mikroskopi için oph testislerini diseke etmek ve hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle erkek sineklerin abdomeninden testis çiftlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, testislerin uygun gelişim seviyesinde yırtılması ve içindeki hücrelerin serbest kalması için testislerin ezilmesidir.

Ardından, ezilmiş testisler fikse edilir ve ardından primer ve sekonder antikorlar içerisinde inkübe edilir. Son adım, görüntüleme için dokunun bir lama monte edilmesidir. Nihai olarak, spermatogenezin çeşitli aşamalarındaki hücrelerin defektlerini ve morfolojilerini gözlemlemek ve çeşitli proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını incelemek için faz kontrast veya immünofloresan mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, spermatogenezin ilerleyişi sırasında proteinlerin kritik rollerinin belirlenmesi gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. RA testislerinin diseksiyonunun görsel olarak gösterilmesi kritiktir; çünkü bu prosedürde deneyimsiz olan bir kişi, başlangıçta sinek abdomeninde testisleri konumlandırmakta zorluk çekebilir. Ayrıca, dokunun ezilme işleminin en başarılı şekilde nasıl gerçekleştirileceğini kelimelerle tarif etmekten ziyade görsel olarak göstermek daha kolaydır.

Diseksiyona başlamak için, sinekleri bir şişe veya flakon içerisinde karbon dioksit akımı kullanarak anesteziye tabi tutun. Ardından, anestezize edilmiş sinekleri bir sinek pedine aktarın. İstenen genotipe sahip yaklaşık altı ila sekiz oph erkeğini toplamak için küçük bir resim fırçası kullanarak sinekleri bir diseksiyon mikroskobu altında ayıklayın.

Ardından, her bir sineğin kanatlarını pensle çıkarın. Bu işlem, sineklerin sıvı içinde yüzmesini önleyecektir. Diseksiyon sırasında, siyah arka planlı, silikon kaplı bir diseksiyon kabına tek bir damla halinde 500 µL fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.

Ardından penseti kanatları koparılmış sineklerden birinin ön ucuna doğru yönlendirin. Sineği toraks kısmından tutun ve PBS damlasının içine daldırın. Ventral abdomenin arka ucunda yer alan koyu kahverengi yapıyı belirleyin ve başka bir penset kullanarak dış genitaliyayı, abdomenden ayrılana kadar arkaya doğru tutup çekin.

Çoğu durumda testisler, seminal veziküller ve aksesuar bezler, dış genital organlarla birlikte abdomenden çıkarılacaktır. Ancak, eğer çıkarılmamışlarsa, abdomene bir pens yerleştirin ve testisleri nazikçe dışarı çıkarın. İki adet pens kullanarak testisleri aksesuar bezlerden ve dış genital organlardan ayırın.

Yaban tipi testisleri, sarı renklerinden dolayı komşularındaki beyaz dokulardan ayırt edin. Örneği canlı görüntüleme için hazırlamak üzere, bir pens yardımıyla iki ila üç çift testisi, kare bir lam üzerindeki 4 ila 5 µL PBS damlasının içine nazikçe yerleştirin. Ardından, yırtın.

Hazırlıkta istenen germ hattı hücre tiplerinin varlığını maksimize etmek için her bir testisi, uygun bir seviyeden bir penset yardımıyla açın. Testislerin içeriği, yırtılan bölgeden lam üzerine çıkacaktır. Spermatogonia ve spermatositleri zenginleştirmek için yapılan ezme aşamasında, zenginleştirme sağlamak amacıyla testisleri apikal ucuna yakın bölgeden yırtarak açın.

Spermatositler ve spermatidler için, daha olgun germ hücrelerini zenginleştirmek amacıyla testisleri birinci seviyenin biraz bazalinde kalan bir konumdan yırtarak açın. Testisleri, kavisin başladığı yere daha yakın bir noktadan yırtarak açın. Bir sonraki adım, bir mikroskop lamini lamelli üzerine nazikçe yerleştirerek testisleri ezmektir.

Manuel olarak basınç uygulamayın ve hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Canlı hücreleri gözlemlemek için örneği hazırladıktan sonra 15 dakika içinde kullanın. Faz kontrast mikroskobu altında, germ hücreleri net bir şekilde odağa gelene kadar preparatın düzleşmesini sağlamak için, lamın altındaki fazla sıvıyı bir temizleme beziyle nazikçe emdirin.

Ezilmiş testis içeren hazırlanan lamları, sıvı azotun kabarcık çıkarması durana kadar metal bir pens yardımıyla içine daldırarak hızlı dondurun. Lamelini hemen bir jiletle çıkarın. Ardından lamları metal penslerle, buz gibi 95% etanol ile doldurulmuş önceden soğutulmuş bir cam lam rafına aktarın ve örneği -20 °C'de 10 dakika boyunca saklayın.

Dengelenmiş lamları, PBS içinde %4 formaldehit artı %0,1 Triton X 100 veya PBST ile doldurulmuş bir cam lam rafına aktarın ve oda sıcaklığında yedi dakika bekletin. Ardından lamları PBS ile doldurulmuş bir rafa aktarın. Raftaki çözeltiyi boşaltıp taze PBS çözeltisiyle değiştirerek, lamları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.

Yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. PBS'yi boşaltın ve hücre membranlarını permeabilize etmek için lamları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST içinde bekletin. Ardından lamları oda sıcaklığında beşer dakikalık üç kez PBS ile yıkayın; antikor çözeltilerini sınırlandırmak ve immün boyama işlemi sırasında dokunun her zaman nemli kalmasını sağlamak için lam üzerindeki ezilmiş dokunun etrafını hidrofobik bariyer kalemiyle bir daire içine alın.

Ardından, daire içindeki dokuya PBST ile seyreltilmiş 30 ila 40 µL primer antikor ekleyin. Primer antikor inkübasyonunun ardından, lamı nemli ve karanlık bir bölmede oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Lamları oda sıcaklığında, beşer dakikalık aralıklarla üç kez PBS ile yıkayın.

Ardından, PBS içinde seyreltilmiş 30 ila 40 µL florokrom konjuge ikincil antikoru dokuya ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir ila iki saat inkübe edin. Sonrasında, lamları oda sıcaklığında PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Ardından, dağlama solüsyonundan 30 ila 40 µL'yi daire içerisindeki dokuya ekleyin.

Hava kabarcığı kalmamasına ekstra özen göstererek, dokunun üzerine nazikçe bir lamelya yerleştirin. Hava kabarcıkları oluşursa, kabarcıklar lamelyanın kenarlarından çıkana kadar numuneye zarar vermeden lamelyayı dikkatlice hareket ettirin. Lamın kenarlarındaki fazla sıvıyı temizleme mendili ile emdirerek temizleyin.

Ardından, lamel kapatma camını oje kullanarak mühürleyin ve üç ila dört saat içinde floresan mikroskop yardımıyla immün boyanmış hücreleri inceleyin. Bu çizim, Drosophila testislerinde çeşitli hücre olgunlaşma seviyelerinin konumunu göstermektedir. Birinci seviye, spermatogenezin erken aşamalarında olan daha genç hücreleri, üçüncü seviye ise daha olgun sperm hücrelerini içerir.

İkinci seviye, miyotik ve post-miyotik germ hattı hücrelerinden oluşan karma bir popülasyon içerir. İlgili faz kontrast görüntüsü, testis birinci seviyeden yırtıldığında spermatogonyumların, erken ve geç primer spermatositlerin salındığını göstermektedir. Sarı ok ayrıca, eksik sitokinez nedeniyle birbirine bağlı iki veya daha fazla hücrenin füzyonuna işaret etmektedir.

Burada gösterilen ezme prosedürünün bir sonucu olarak, testislerin ikinci seviyede yırtıldığına dair, geç primair spermatositlerin ve yuvarlak spermatidleri, uzayan spermatidleri ve olgun sperm hücrelerini içeren miyotik sonrası hücrelerin salınımını gösteren karşılık gelen bir faz kontrast görüntüsü yer almaktadır. Ezme yöntemiyle hazırlanan testislerin faz kontrast görüntülemesi, bol miktardaki yuvarlak spermatidlerdeki defektleri kolayca tanımlamak için de kullanılabilir. Burada, tek bir faz-açık çekirdeğe sahip vahşi tip spermatidlerin, yaklaşık olarak aynı boyuttaki faz-koyu tek bir mitokondriyal agregata tutunmuş hali gösterilmektedir.

Buna karşılık, Aun testislerinden elde edilen spermatidler, sitokinez hatası ve kromozom ayrılmasındaki hatalar sonucunda birden fazla küçük çekirdek ve tek bir büyük mitokondriyal agregat içerir. Burada gösterilen gri tonlamalı görüntüler, mikrotübülleri, DNA'yı ve sentrozomları renkli olarak belirleyen reaktiflerle boyanmış ezme testis preparatlarından alınmıştır. Birleştirilmiş görüntüler; bölünen bir spermatosit, geniş bir yuvarlak spermatid alanı ve olgun sperm demetini göstermektedir. Numunelerin faz kontrast mikroskopisi için hazırlanması konusunda uzmanlaşıldığında, işlem 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir.

İmmünofloresan mikroskopi için örnek hazırlama, doğru şekilde gerçekleştirildiğinde altı saatte tamamlanabilir. Mikroskopi için oph testislerinin işlenmesine ek olarak, diseke edilen testisler alternatif olarak proteinlerin biyokimyasal analizi için de kullanılabilir.