Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar Drosophila Testisler

Bu prosedürün genel amacı, oph testislerini mikroskopi için incelemek ve hazırlamaktır. Bu, ilk önce erkek sineklerin karnından testis çiftlerinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşama ise testislerin uygun gelişim seviyesinde yırtılması ve testislerin ezilerek içerideki hücrelerin serbest bırakılmasıdır.

Daha sonra, ezilmiş testisler sabitlenir ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarda inkübe edilir. Son adım, dokuyu görüntüleme için bir slayt üzerine monte etmektir. Sonuç olarak, faz kontrastı veya immünofloresan mikroskobu, spermatogenezin çeşitli aşamalarında hücreleri kusurlar ve morfoloji açısından gözlemlemek ve çeşitli proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını gözlemlemek için kullanılır.

Bu yöntem, spermatogenezin ilerlemesi sırasında proteinlerin kritik rollerinin tanımlanması gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. RA'nın testislerinin diseksiyonunun görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü bu prosedüre yeni başlayan bir kişi başlangıçta testisleri sinek karnı içinde bulmakta zorluk çekebilir. Ek olarak, dokunun ezilmesinin en başarılı yolunu kelimelerle tarif etmekten ziyade göstermek daha kolaydır.

Diseksiyona başlamak için, anestezik bir karbondioksit akışı kullanarak bir şişe veya flakon içinde uçar. Daha sonra anestezi uygulanmış sinekleri bir sinek pedine aktarın. İstenen genotipin yaklaşık altı ila sekiz oph erkeğini toplamak için küçük bir boya fırçası kullanarak sinekleri diseksiyon mikroskobu altında sıralayın.

Sonra, forseps ile her sinek kanatlarını çıkarın. Bu, sineklerin sıvı içinde yüzmesini önleyecektir. Diseksiyon sırasında, siyah bir arka plan üzerinde silikon kaplı bir diseksiyon kabına tek bir damlada 500 mikrolitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.

Sonra forsepsleri kanatlı sineklerden birinin ön ucuna doğru işaret edin. Göğüs kafesinden kavrayın ve PBS damlasına daldırın. Ventral karnın arka ucunda bulunan koyu kahverengi yapıyı tanımlayın ve dış genital organı karından ayrılana kadar arkaya doğru kavramak ve çekmek için başka bir forseps kullanın.

Çoğu durumda, testisler, seminal veziküller ve aksesuar bez, dış genital organlarla birlikte karın bölgesinden çıkarılacaktır. Bununla birlikte, değilse, karın içine bir çift forseps yerleştirin ve testisleri çıkarın. İki çift forseps kullanarak testisleri aksesuar bezlerden ve dış genital organlardan ayırın.

Yabani tip testisleri komşu beyaz dokulardan sarı renkleriyle ayırt edin. Numuneyi canlı görüntüleme için hazırlamak için, iki ila üç çift testisi kare bir cam kapak kızağı üzerine dört ila beş mikrolitrelik bir PBS damlasına nazikçe yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Sonra, gözyaşı.

Preparatta istenen germ hattı hücre tiplerinin varlığını en üst düzeye çıkarmak için her testisi bir çift forseps ile uygun bir düz pozisyonda açın. Testislerin içeriği yırtık bölgeden lam üzerine çıkacaktır. Spermatogonia ve spermatositler için zenginleştirme aşaması sırasında, zenginleştirmek için apikal ucuna bitişik testisleri yırtın.

Spermatositler ve spermatidler için, daha olgun germ hattı hücreleri için zenginleştirmek için testisleri hafif bazal bir pozisyonda birinci seviyeye kadar yırtın. Eğriliğin başladığı yere daha yakın olan testisleri yırtın. Bir sonraki adım, kapak kaymasının üzerine nazikçe bir mikroskop lamı yerleştirerek testisleri ezmektir.

Manuel olarak basınç uygulamayın ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin. Canlı hücreleri gözlemlemek için numuneyi hazırlandıktan sonraki 15 dakika içinde kullanın. Faz kontrast mikroskobu ile, germ hücreleri net bir şekilde odaklanana kadar preparatın düzleşmesine izin vermek için bir temizleme mendili kullanarak kapak astarının altındaki fazla sıvıyı nazikçe emin.

Kabak testisleri içeren hazırlanmış slaytları, bir çift metal maşa ile sıvı nitrojenin köpürmesi durana kadar sıvı nitrojene batırarak dondurun. Kapak fişini hemen bir jiletle çıkarın. Daha sonra slaytları metal maşa ile buz gibi soğuk %95 etanol ile doldurulmuş önceden soğutulmuş bir cam slayt rafına aktarın ve numuneyi eksi 20 santigrat derecede 10 dakika saklayın.

Dengelenmiş slaytları PBS artı %0,1 Triton X 100 veya PBST'de %4 formaldehit ile doldurulmuş bir cam slayt rafına aktarın ve oda sıcaklığında yedi dakika saklayın. Ardından slaytları PBS ile dolu bir rafa aktarın. Slaytları PBS'de oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkayın, solüsyonu rafa atın ve taze PBS solüsyonu ile değiştirin.

Yıkamayı bir kez tekrarlayın. PBS'yi atın ve hücre zarlarına nüfuz etmek için slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST'ye daldırın. Daha sonra slaytları PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın Oda sıcaklığında, antikor solüsyonlarını sınırlamak ve immüno-boyama yaparken dokuyu her zaman nemli tutmak için slayt üzerindeki kabak dokusunun etrafına hidrofobik bir bariyer kalemle bir daire çizin.

Daha sonra daire içindeki dokuya PBST'de seyreltilmiş 30 ila 40 mikrolitre primer antikor ekleyin. Slaytı nemli ve karanlık bir odada, oda sıcaklığında iki saat veya primer antikorda inkübasyonu takiben gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın.

Daha sonra 30 ila 40 mikrolitre bir zemin, PBS'de seyreltilmiş dört konjuge ikincil antikor dokuya ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin. Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra daire içindeki dokuya 30 ila 40 mikrolitre dappy solüsyonu ekleyin.

Hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için ekstra özen göstererek, dokunun üzerine nazikçe bir cam örtü yerleştirin. Hava kabarcıkları ortaya çıkarsa, kabarcıklar kapağın kenarlarından çıkana kadar numuneyi tahrip etmeden kapak kızağını dikkatlice hareket ettirin. Bir temizleme mendili ile sürgünün kenarlarından fazla lekeyi kaydırın.

Ardından, üç ila dört saat içinde bir floresan mikroskobu kullanarak oje görünümü immün leke hücrelerini kullanarak kapak fişini kapatın. Bu karikatür, drosophila Testisleri içindeki çeşitli hücre olgunlaşma seviyelerinin yerini göstermektedir. Birinci seviye, spermatogenezin erken aşamalarında olan daha genç hücreleri içerir ve üçüncü seviye daha olgun sperm hücreleri içerir.

İkinci seviye, karışık bir miyotik ve post miyotik germ hattı hücresi popülasyonu içerir. Karşılık gelen bir faz kontrast görüntüsü, testisler birinci seviyede yırtıldığında spermatogoni ve erken ve geç primer spermatositlerin salınımını gösterir. Sarı ok ayrıca, eksik sitokinezden birbirine bağlı iki veya daha fazla hücrenin füzyonuna işaret eder.

Burada gösterilen ezme prosedürünün bir artefaktı, testisler ikinci seviyede yırtıldığında yuvarlak spermatidler, uzayan spermatidler ve olgun sperm dahil olmak üzere geç primer spermatositlerin ve post miyotik hücrelerin salınımını gösteren karşılık gelen bir faz kontrast görüntüsüdür. Kabak testislerinin faz kontrast görüntülemesi, bol turdaki kusurları kolayca tanımlamak için de kullanılabilir. Bir fazlı hafif çekirdeğe sahip spermatidler, burada kabaca eşit büyüklükte bir faz koyu tek mitokondriyal agregaya bağlı olarak vahşi tip spermatidler gösterilmektedir.

Buna karşılık, Aun testislerinden elde edilen spermatidler, başarısız sitokinez ve kromozom ayrımındaki hataların bir sonucu olarak çok sayıda küçük çekirdek ve bir büyük mitokondriyal agregat içerir. Burada gösterilen gri tonlamalı görüntüler, mikrotübülleri, DNA'yı ve sentrozomları renkli olarak tanımlayan reaktiflerle boyanmış bir kabak testisi preparatından alınmıştır. Birleştirilen görüntüler, bölünen bir spermatosit, geniş yuvarlak spermatid alanı ve bir olgun sperm demeti göstermektedir Faz kontrastı için örneklerin hazırlanmasına hakim olduktan sonra, mikroskopi 20 ila 30 dakika içinde yapılabilir.

İmmünofloresan mikroskobu için numunelerin hazırlanması, uygun şekilde yapılırsa altı saat içinde yapılabilir. Ek olarak Mikroskopi için oph testislerinin işlenmesine ek olarak, disseke testisler alternatif olarak proteinlerin biyokimyasal analizi için kullanılabilir.