Name: Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar Drosophila Testisler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin Drosophila testislerinin diseksiyon, fiksasyon ve antikor inkübasyonu ile sitolojik analizini. Bu yöntem spermatogenez evrelerinde hücre yapılarını gözlemlemek ve protein lokalizasyonunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Lee laboratuarda Karen Hales uzman tavsiyesi ile spermetogenez eğitim için kabul edilen bu yöntemlerin kurulması için Michael Anderson teşekkür etmek istiyorum. H. Oda ve Y. Akiyama-Oda cömertçe γ-tubulin-GFP stok sinek sağladı. Bu çalışma LAL (GM074044) bir NIH R01 hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Testisler Diseksiyon <ol><li> CO2 akımı kullanılarak bir şişe ya da viyal sinekleri anestezisi ve bir sinek ped transfer. </li><li> Sıralama küçük bir fırça kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında uçar, ve istenilen genotiplerin Drosophila erkek (deneye bağlı olarak) uygun bir sayı toplamak. (2-5 gün) biraz eski erkek hücrelerin incelenmesi için ideal olan ise (0-2 gün), genç erkekler, spermatogenez önceki aşamalarında (örn. spermatogonium, spermatosit ve erken post-miyoza Spermatidler) boyunca hücrelerin incelenmesi için idealdir spermatogenez son aşamasında (özellikle sperm olgun). </li><li> (Diseksiyon sırasında sıvı içinde yüzen sinekler önlemek için) her sinek gelen kanatları çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Bir silikon kaplı diseksiyon çanak bir damla olarak, fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4) arasında ~ 500 ml eklesiyah bir arka plan. Diğer sulu çözeltiler, başarılı bir şekilde testis diseksiyon 3 için kullanılmıştır. </li><li> Noktası sineğin öne doğru forseps, toraks bunu kavramak ve PBS açılan batırmayın. Diseksiyon mikroskobu ile görüntüleme iken, karın ayrılana kadar posteriora dış genital (ventral karın arka ucunda bulunan koyu kahverengi yapısı) kavramak ve çekin forseps başka bir çift kullanın. Çoğu durumda, testisler, seminal veziküller ve aksesuar bez dış genital ile karın boyunca kaldırılır olacak; değilse, karın içine forseps bir tek bir çift eklemek ve testisler didiklemek. </li><li> PBS damla forseps iki çift (Şekil 2) kullanılarak aksesuar bezi ve dış genital ayırın testisler. Yabani tip testis kolayca sarı renk ile komşu beyaz dokulardan ayırt edilirler. 2. adıma hemen geçin. </li><li> Pharate erkeklerden (i Testisler izole etmek.. E pupa durum içinde kapalı), ek bir adım ilk pupa kasasından kaldırılması sinek içermesidir gerçekleştirilmelidir, bu adım, daha önce başka bir yerde 31 tarif edilmiştir. Adım 1.2 başlayan erişkin testis gibi diseksiyon ile devam edin. </li><li> Larva erkeklerden testisler ayırmak için, Drosophila larva overler 32 izole etmek için bir protokol bir değişiklik yapmak. Kısaca, erkek larva yağ gövdesinin arka üçte gömülü büyük, berrak, oval yapı (larva testis) bir çift varlığı ile dişi larva ayırt edilebilir. Larva testisler izole edilmesi için, kısmen larva yumurtalıkların izolasyonu için tarif edildiği gibi karından testisler ve çevredeki vücut yağ izole etmek için erkek larva açık parasını. Burada tarif edilen protokolün adım 2&#39;ye geçin hemen, testisler, daha sonra hemen önce yumurtalık 32 için tarif edildiği gibi (2.3 ya da 3.14 adım) montaj için yağ vücuttan çıkarılabilir. </li></ol><ol><li> Nazikçe bir kare cam kapak slip PBS 4-5 ml&#39;lik bir damla testisler 2-3 çiftleri yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Çok az sıvı ne zaman ezilmiş hücrelerinin patlamasına neden olacak ise, çok fazla sıvı ezilmiş düzgün yayılmasını hücrelerini engeller: PBS hacmine testisler sayısına oranının ayarlanması gerekebilir unutmayın. İsteğe bağlı: Kullanım silikonlu kapak adım 3.2 &#39;de kayma kapsayacak doku yapışmasını en aza indirmek için kayıyor. </li><li> (Not hazırlanmasında istenen tohum çizgisi hücre tiplerinin varlığını en üst düzeye çıkarmak üzere uygun bir konumda açık her testis gözyaşı forseps bir çift kullanım olup ezilmesini sırasında slayt üzerine testis parçalanmış bölgeden olacak çok çıkış içeriğinin adım.) spermatogonia ve spermatositlerin için zenginleştirmek için, apikal ucu (seviye 1, Şekil 2B) bitişik testis açın gözyaşı. Spermatositlerin ve Spermatidler zenginleştirmek için, gözyaşı bir pos testis açınseviye 1 (düzey 2, Şekil 2B) biraz bazal ition. , Daha olgun germ hücreleri zenginleştirmek yakın eğrilik (düzey 3, Şekil 2B) nerede başladığını açık testis gözyaşı. </li><li> Yavaşça testisler squash kapak kayma üzerinde bir cam mikroskop lamı yerleştirmek; yalnız kapak kayma ağırlığı düzgün ezilmiş numune elde etmek için yeterli olduğu gibi elle baskı uygulamayın. Hava kabarcıklarını yakalama önlemek için deneyin. İsteğe bağlı: Kullanım poli-L-lizin kaplı mikroskop aşama 3.2 &#39;de kayma doku uyumu geliştirmek için kayar. </li><li> Faz-kontrast mikroskobu ile canlı hücreleri gözlemlemek (ideal hazırlık 15 dakika içinde) hemen hazırlanmasını kullanarak, testislerde floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu ile transgenik Sinekler için, canlı hücreler bu aşamada floresan mikroskobu ile incelenebilir. Alternatif olarak, tespit ve antikor boyama (Protokolü 3) ile devam. </li><li> Yavaşça bir temizlik w kullanarak coverslip altında herhangi bir aşırı sıvı fitilgerm hücreleri, odak net kadar ipe preparasyonun düzleşme izin vermek. </li></ol> 3. Formaldehit Fiksasyon ve Antikor Boyama <ol><li> Yapış (sıvı azot köpüren durana kadar) sıvı azot içinde kısaca batırmak için metal maşa kullanılarak (Protokolü 2) ezilmiş testisler içeren her slayt dondurma. </li><li> Bir jilet kullanarak hemen kapak kayma çıkarın. </li><li> Buz soğukluğundaki% 95 etanol ile dolu önceden soğutulmuş bir cam slayt, raf (spektrofotometrik sınıf, metanol içermeyen) Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 10 dakika boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> % 4 formaldehid, PBS artı% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile dolu bir cam slayt raf Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 7 dakika boyunca oda sıcaklığında saklayın. </li><li> PBS ile dolu bir cam slayt rafa slaytlar aktarmak için metal maşa kullanın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 1x tekrarlayın. (Cam slayt rafa çözüm atarak tüm yıkar gerçekleştirin <em&gt; Örneğin. dışarı dökme) ve taze çözelti ile değiştirerek. </li><li> PBS atın ve hücre zarının geçirgen hale getirilmesi, oda sıcaklığında 30 dakika için PBS-T içinde slaytlar bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın. </li><li> Adım (isteğe bağlı) Bloklama: oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS içinde slaytlar artı% 1 BSA bırakın. </li><li> (Adımları 3.9 ve 3.11 &#39;de eklenmiştir) antikor çözümleri sınırlandırmak için (gözle kolayca görülebilir) ezilmiş doku etrafında slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. Immün yaparken doku her zaman nemli tutulmalıdır. </li><li> Daire içinde dokuya (antikora bağlı olarak 1:50 PBS-T içinde seyreltilmiş 1:400) birincil antikor 30-40 ml ilave edilir. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T artı% 1 BSA içinde birincil antikor seyreltin. (Şekil 4&#39;te sentrozom boyanması için) Anti-gamma-tubulin antikoru 1:100 seyreltilmiştir. Nemli, karanlık odaya (örn.. Kapalı plastik kutu içinde inkübenemli kağıt, oda sıcaklığında 2 saat boyunca havlu) veya gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta ile </li><li> Oda sıcaklığında 3 x 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T içinde iki kez yıkayın ve bir kez PBS (oda sıcaklığında her biri 5 dakika). </li><li> Dokuya fluorofor-konjuge sekonder antikor (PBS içinde 1:400 seyreltilmiş) 30-40 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın. </li><li> 30-40 daire içinde dokuya DAPI çözeltisi (PBS içinde 0.2 mg / ml) ilave edin. </li><li> Yavaşça, hava kabarcığı oluşmaması için dikkat çekici, doku üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. Hava kabarcıkları görünmesi gerekiyorsa, kabarcıkları kapak kayma tarafına kaçmak kadar kabak bozmadan kapak kayma etrafında dikkatli hareket. </li><li> Bir temizlik kullanabilirsiniz slayt kenarları aşırı DAPI leke silin. </li><li> Net oje kullanarak slayt kapak kayma mühür. </li><li> Bu hazırlık kullanınfloresan mikroskop ile immunosteyn hücreler görüntülemek için sonraki 3-4 saat içinde. (En azından birkaç haftaya kadar) slaytlar uzun süreli saklama için -20 ˚ C&#39;de gliserol tabanlı monte sert DAPI ile medya, ve mağaza slaytlar kullanın </li><li> Seçenek olarak ise, (antijen bağlı olarak) metanol yerine formaldehitle örnekleri saptamak. Adım 3.2 ile tüm protokol tamamladıktan sonra, -20 ° C&#39;de 10 dakika boyunca metanol içinde ezilmiş testislerin slaytlar daldırın ve ileriye adım 3.5 ile devam edin. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Vahşi tip sinekler testisler kolayca nedeniyle sarı renk (aksine komşu beyaz dokular) ile tespit edilebilir, ancak beyaz sinek mutant testisler beyazdır ve bu nedenle zaman zaman gut ile karışabilir. P-elemanları bulunan beyaz mini-gen testislerde pigment birikimini teşvik etmez, çünkü beyaz bir arka planda genellikle çoğu transgenik suşları, aynı zamanda beyaz testisler var. Drosophila testisler renk ile ayırt edilemeyen zaman, diğer kolayca tanınabilir özellikleri çiftler <...

Drosophila testis kök hücrelerin düzenlenmesi, mayoz, ve sperm gelişimi 13-18 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin çalışma için ideal bir model sistem. Spermatosit ve öz değişmesine ait iğ büyük ve sitolojik analiz için bu nedenle uygun olan ve spermatogenez sırasında rahat bir hücre döngüsü kontrol noktası hücre döngüsü genlerdeki mutasyonların çalışma kolaylaştırır. Farklı hücre tipleri testislerin uzunluğu boyunca düzenli ilerleme gözlenebilir, spermatogenez ve herhangi bir bozulma bu genel düzenleme değişikliklere yol açabilir. Drosophila genetik araçlar ile birlikte bu özellikler, spermatogenez 21-23 mutasyonel analiz kolaylaştırmıştır. Drosophila Spermatogenezin evreleri çok iyi tanımlanmıştır. Kistlerinin içinde eşzamanlı geliştirmek Germline hücreleri testis uzunluğu boyunca spermatogenez aşamalarında sırayla ilerleme. Bo sırasındamitoz ve erkek germ hücrelerinin miyoza bölünmeler inci, sitokinez kızı hücreleri (Şekil 1) halka kanallar olarak bilinen sitoplazmik köprülerle bağlı kalmasını eksik böyle oluşur. Testisin apikal uç birincil spermatositlerin 16-hücre kistler oluşturmak için eksik sitokinez dört mitotik bölünmeleri geçmesi spermatogonial hücreleri doğurur germ kök hücrelerin bir nüfus içerir. Premeiotic S aşamasından sonra, birincil spermatosit G2, ~ 90 saat hangi hücresel hacmi artar ~ 25 kat sırasında uzun bir büyüme dönemine giriyoruz. Mayoz I ve sırasıyla ikincil spermatositlerin ve haploid spermatidlerin 64-hücreli kist, 32-hücreli kist oluşumu mayoz II sonuçları yoluyla ilerleme. Olgunlaşmamış, yuvarlak spermatidlere olgun sperm oluşturmak için kapsamlı hücresel yeniden geçmesi. Post-öz değişmesine ait hücreler, uzatma demetleri ve olgun spermatidler özellikle, testis hacminin çok işgal. Tdişi sinek fonksiyonel sperm o başarılı taşıma birkaç eşleştirilmiş yapıların (testisler, seminal kesecikler ve aksesuar bezleri) ve tek bir boşalma yolunun oluşan erkek üreme sistemi, (Şekil 2) farklı parçaları arasındaki koordinasyonu gerektirir. Sperm testislerde içinde üretilen ve çiftleşme 24 kadar seminal keseler içinde saklanır. Aksesuar bezleri seminal sıvıyı üreten salgı hücreleri içerir. Seminal veziküllerin göç sperm seminal keseler ve aksesuar bezleri hem de bağlı olduğu ejakülasyon kanal içerisindeki seminal sıvı ile karıştırılır. Sperm ve seminal sıvı Bu karışım sonuçta kadın erkek karın 25 arka ucunda bulunan ejakülasyon ampul sayesinde sinek vajina içine erkek dışarı pompalanır. Seminal sıvı içinde Proteinler rep spermatekada olarak bilinen uzman organların içinde sperm uzun süreli depolama için gerekli olanDrosophila kadın 26 roductive yolu. Drosophila testislerin izolasyonu ve spermatogenez çeşitli aşamalarında hücreleri görselleştirilmesi için mükemmel yöntemler bilimsel literatürde 3-12 mevcuttur. Biz burada beraberindeki video gösterimi ile bu protokollerin örnekleri sunarak bu bilgi gövdesine ekleyin. Faz-kontrast mikroskopi için canlı testis numunelerin hazırlanması için protokol daha önce tarif edilen yönteme 27 dayanmaktadır. Formaldehit tespit ve testislerde immün için protokol, aynı zamanda, daha önce tarif edilen metodu takip 28 dayanmaktadır. Burada tarif edilen yaklaşımlar, (örneğin, Drosophila spermatogenez sırasında, bir eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motoru dinein rollerini değerlendirmek için) Drosophila spermatogenez birçok çalışmada kullanılmıştır. Temel protokol ek olarak, öneri varyin verilmektedirg diseksiyon spermatogonia spermatositler, ya da olgun sperm için zenginleştirecek şekilde. Bu kistlerin ki testisler işlenmesi için farklı yöntemler bozulmadan kalması ya da tarif edilmektedir gerektiği gibi bozulur ya. Bir model sistem olarak Drosophila testisler kullanılmasının bir avantajı, Drosophila oositler ve embriyolar ile karşılaştırıldığında, antikorlar ve boyalar kolayca testis kendi dağılımı aşağıdaki hücreleri nüfuz edebilir ve daha az sayıda yıkama adımları gereklidir, yani, bu yüzden, protokoller nispeten gerçekleştirilebilir kısa bir süre.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Hassas Aletler</td><td>SYLG184</td><td>Kimax'tan silikon kaplı diseksiyon kabı yapmak için iki parçalı silikon elastomer Petri kabı</td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Şeffaf tırnak koruyucu</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Reaktifi, DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td> ile</tr><tr><td>Fare anti-gama-tubulin antikoru (klon GTU-88)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG & nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>%16 Formaldehit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Kapak fişlerini silikonlamak için üreticinin talimatlarına göre kullanın</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg / ml% 75 etanol içinde; -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes hassas görev silecekleri Fisher</td><td>Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Araştırma Ürünleri International Corp.</td><td>A30075</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Cam Coplin boyama kavanozu, vidalı kapaklı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Tek buzlu mikroskop slaytları</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin kaplı mikroskop</td><td>slaytları Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>İsteğe bağlı (işlenmemiş mikroskop slaytlarını değiştirmek için)</td></tr> <tr><td>Kare kapaklı cam</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Desen 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objektif</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objektif</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spermatogenez sitolojik analizi: canlı ve sabit hazırlıklar<em&gt; drosophila</em&gt; testisler

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster yaygın olarak biyolojik süreçlerin çeşitli aydınlatmak için kullanılmış olan güçlü bir model sistem. Örneğin, kadın ve Drosophila erkek germ hatlarının hem de çalışmaları mevcut mayoz anlayış yanı sıra kök hücre biyolojisi büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Mükemmel protokolleri Drosophila yumurtalık ve testis 3-12 izolasyonu ve görüntüleme için literatürde mevcuttur. Burada, mikroskobik analiz için diseksiyon ve Drosophila testis hazırlanması için yöntemler, eşlik eden bir video gösterimi ile tarif edilmiştir. Yetişkin erkeklerin karından testisler izole edilmesi ve faz kontrast mikroskopisi ile analiz hem de floresan mikroskobu ile analiz için sabitleme testisler ve immünboyama için bir protokol için canlı doku slaytlar hazırlanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu teknikler, d gösteren Drosophila mutantlar karakterizasyonunda uygulanabilirspermatogenezde yanı sıra, proteinlerin hücre içi yerleşimlerin görselleştirme efects.

Drosophila erkek üreme organlarının bir şekilde parçalanmış bir çiftin bir örneği, Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. Yetişkin erkek sineğin karın çıkarıldı Deneyler tipik haliyle seminal veziküllerin bir çift (mavi, Şekil 2A &#39;) ile boşalma kanalına (kahverengi, Şekil 2A&#39;) ve yardımcı bezleri bir çift (yeşil, Şekil 2A &#39;) bağlıdırlar . Ekteki somatik doku, ejakülasyon kanal ve aksesuar bezlerinin çoğundan testislerin ayırmak için müstak...

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroskopi için oph testislerini diseke etmek ve hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle erkek sineklerin abdomeninden testis çiftlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, testislerin uygun gelişim seviyesinde yırtılması ve içindeki hücrelerin serbest kalması için testislerin ezilmesidir.Ardından, ezilmiş testisler fikse edilir ve ardından primer ve sekonder antikorlar içerisinde inkübe edilir. Son adım, görüntüleme için dokunun bir lama monte edilmesidir. Nihai olarak, spermatogenezin çeşitli aşamalarındaki hücrelerin defektlerini ve morfolojilerini gözlemlemek ve çeşitli proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını incelemek için faz kontrast veya immünofloresan mikroskopi kullanılır.Bu yöntem, spermatogenezin ilerleyişi sırasında proteinlerin kritik rollerinin belirlenmesi gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. RA testislerinin diseksiyonunun görsel olarak gösterilmesi kritiktir; çünkü bu prosedürde deneyimsiz olan bir kişi, başlangıçta sinek abdomeninde testisleri konumlandırmakta zorluk çekebilir. Ayrıca, dokunun ezilme işleminin en başarılı şekilde nasıl gerçekleştirileceğini kelimelerle tarif etmekten ziyade görsel olarak göstermek daha kolaydır.Diseksiyona başlamak için, sinekleri bir şişe veya flakon içerisinde karbon dioksit akımı kullanarak anesteziye tabi tutun. Ardından, anestezize edilmiş sinekleri bir sinek pedine aktarın. İstenen genotipe sahip yaklaşık altı ila sekiz oph erkeğini toplamak için küçük bir resim fırçası kullanarak sinekleri bir diseksiyon mikroskobu altında ayıklayın.Ardından, her bir sineğin kanatlarını pensle çıkarın. Bu işlem, sineklerin sıvı içinde yüzmesini önleyecektir. Diseksiyon sırasında, siyah arka planlı, silikon kaplı bir diseksiyon kabına tek bir damla halinde 500 µL fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.Ardından penseti kanatları koparılmış sineklerden birinin ön ucuna doğru yönlendirin. Sineği toraks kısmından tutun ve PBS damlasının içine daldırın. Ventral abdomenin arka ucunda yer alan koyu kahverengi yapıyı belirleyin ve başka bir penset kullanarak dış genitaliyayı, abdomenden ayrılana kadar arkaya doğru tutup çekin.Çoğu durumda testisler, seminal veziküller ve aksesuar bezler, dış genital organlarla birlikte abdomenden çıkarılacaktır. Ancak, eğer çıkarılmamışlarsa, abdomene bir pens yerleştirin ve testisleri nazikçe dışarı çıkarın. İki adet pens kullanarak testisleri aksesuar bezlerden ve dış genital organlardan ayırın.Yaban tipi testisleri, sarı renklerinden dolayı komşularındaki beyaz dokulardan ayırt edin. Örneği canlı görüntüleme için hazırlamak üzere, bir pens yardımıyla iki ila üç çift testisi, kare bir lam üzerindeki 4 ila 5 µL PBS damlasının içine nazikçe yerleştirin. Ardından, yırtın.Hazırlıkta istenen germ hattı hücre tiplerinin varlığını maksimize etmek için her bir testisi, uygun bir seviyeden bir penset yardımıyla açın. Testislerin içeriği, yırtılan bölgeden lam üzerine çıkacaktır. Spermatogonia ve spermatositleri zenginleştirmek için yapılan ezme aşamasında, zenginleştirme sağlamak amacıyla testisleri apikal ucuna yakın bölgeden yırtarak açın.Spermatositler ve spermatidler için, daha olgun germ hücrelerini zenginleştirmek amacıyla testisleri birinci seviyenin biraz bazalinde kalan bir konumdan yırtarak açın. Testisleri, kavisin başladığı yere daha yakın bir noktadan yırtarak açın. Bir sonraki adım, bir mikroskop lamini lamelli üzerine nazikçe yerleştirerek testisleri ezmektir.Manuel olarak basınç uygulamayın ve hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Canlı hücreleri gözlemlemek için örneği hazırladıktan sonra 15 dakika içinde kullanın. Faz kontrast mikroskobu altında, germ hücreleri net bir şekilde odağa gelene kadar preparatın düzleşmesini sağlamak için, lamın altındaki fazla sıvıyı bir temizleme beziyle nazikçe emdirin.Ezilmiş testis içeren hazırlanan lamları, sıvı azotun kabarcık çıkarması durana kadar metal bir pens yardımıyla içine daldırarak hızlı dondurun. Lamelini hemen bir jiletle çıkarın. Ardından lamları metal penslerle, buz gibi 95% etanol ile doldurulmuş önceden soğutulmuş bir cam lam rafına aktarın ve örneği -20 °C'de 10 dakika boyunca saklayın.Dengelenmiş lamları, PBS içinde %4 formaldehit artı %0,1 Triton X 100 veya PBST ile doldurulmuş bir cam lam rafına aktarın ve oda sıcaklığında yedi dakika bekletin. Ardından lamları PBS ile doldurulmuş bir rafa aktarın. Raftaki çözeltiyi boşaltıp taze PBS çözeltisiyle değiştirerek, lamları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayın.Yıkama işlemini bir kez tekrarlayın. PBS'yi boşaltın ve hücre membranlarını permeabilize etmek için lamları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST içinde bekletin. Ardından lamları oda sıcaklığında beşer dakikalık üç kez PBS ile yıkayın; antikor çözeltilerini sınırlandırmak ve immün boyama işlemi sırasında dokunun her zaman nemli kalmasını sağlamak için lam üzerindeki ezilmiş dokunun etrafını hidrofobik bariyer kalemiyle bir daire içine alın.Ardından, daire içindeki dokuya PBST ile seyreltilmiş 30 ila 40 µL primer antikor ekleyin. Primer antikor inkübasyonunun ardından, lamı nemli ve karanlık bir bölmede oda sıcaklığında iki saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Lamları oda sıcaklığında, beşer dakikalık aralıklarla üç kez PBS ile yıkayın.Ardından, PBS içinde seyreltilmiş 30 ila 40 µL florokrom konjuge ikincil antikoru dokuya ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir ila iki saat inkübe edin. Sonrasında, lamları oda sıcaklığında PBS ile beşer dakikalık üç yıkama işlemine tabi tutun. Ardından, dağlama solüsyonundan 30 ila 40 µL'yi daire içerisindeki dokuya ekleyin.Hava kabarcığı kalmamasına ekstra özen göstererek, dokunun üzerine nazikçe bir lamelya yerleştirin. Hava kabarcıkları oluşursa, kabarcıklar lamelyanın kenarlarından çıkana kadar numuneye zarar vermeden lamelyayı dikkatlice hareket ettirin. Lamın kenarlarındaki fazla sıvıyı temizleme mendili ile emdirerek temizleyin.Ardından, lamel kapatma camını oje kullanarak mühürleyin ve üç ila dört saat içinde floresan mikroskop yardımıyla immün boyanmış hücreleri inceleyin. Bu çizim, Drosophila testislerinde çeşitli hücre olgunlaşma seviyelerinin konumunu göstermektedir. Birinci seviye, spermatogenezin erken aşamalarında olan daha genç hücreleri, üçüncü seviye ise daha olgun sperm hücrelerini içerir.İkinci seviye, miyotik ve post-miyotik germ hattı hücrelerinden oluşan karma bir popülasyon içerir. İlgili faz kontrast görüntüsü, testis birinci seviyeden yırtıldığında spermatogonyumların, erken ve geç primer spermatositlerin salındığını göstermektedir. Sarı ok ayrıca, eksik sitokinez nedeniyle birbirine bağlı iki veya daha fazla hücrenin füzyonuna işaret etmektedir.Burada gösterilen ezme prosedürünün bir sonucu olarak, testislerin ikinci seviyede yırtıldığına dair, geç primair spermatositlerin ve yuvarlak spermatidleri, uzayan spermatidleri ve olgun sperm hücrelerini içeren miyotik sonrası hücrelerin salınımını gösteren karşılık gelen bir faz kontrast görüntüsü yer almaktadır. Ezme yöntemiyle hazırlanan testislerin faz kontrast görüntülemesi, bol miktardaki yuvarlak spermatidlerdeki defektleri kolayca tanımlamak için de kullanılabilir. Burada, tek bir faz-açık çekirdeğe sahip vahşi tip spermatidlerin, yaklaşık olarak aynı boyuttaki faz-koyu tek bir mitokondriyal agregata tutunmuş hali gösterilmektedir.Buna karşılık, Aun testislerinden elde edilen spermatidler, sitokinez hatası ve kromozom ayrılmasındaki hatalar sonucunda birden fazla küçük çekirdek ve tek bir büyük mitokondriyal agregat içerir. Burada gösterilen gri tonlamalı görüntüler, mikrotübülleri, DNA'yı ve sentrozomları renkli olarak belirleyen reaktiflerle boyanmış ezme testis preparatlarından alınmıştır. Birleştirilmiş görüntüler; bölünen bir spermatosit, geniş bir yuvarlak spermatid alanı ve olgun sperm demetini göstermektedir. Numunelerin faz kontrast mikroskopisi için hazırlanması konusunda uzmanlaşıldığında, işlem 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir.İmmünofloresan mikroskopi için örnek hazırlama, doğru şekilde gerçekleştirildiğinde altı saatte tamamlanabilir. Mikroskopi için oph testislerinin işlenmesine ek olarak, diseke edilen testisler alternatif olarak proteinlerin biyokimyasal analizi için de kullanılabilir.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila spermatogenez sırasında centrosomal proteinlerin Görüntüleme sentrozom biyoloji için önemli bir yeni proteinleri tespit etmek yanı sıra, bu işlem bilinen oyuncu belirli bir işlevi aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, Drosophila melanogaster pupalarından elde edilen sağlam testislerin ve germ hattı kistlerinin diseksiyonunu ve kültivasyonunu tanımlar. Bu yöntem, spermatogenezin ex vivo mikroskobik olarak gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca, inhibitörlerin pupa testislerde germ hücresi gelişiminin belirli aşamaları üzerindeki etkisinin farmakolojik bir analizini tarif ediyoruz.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Bu tübül squash teknik hızla hücresel bütünlüğünü koruyarak fare spermatocytes geliştirme saytolojik özellikleri değerlendirmek için hedeftir. Bu yöntem tüm aşamalarında spermatogenez çalışma için izin verir ve diğer biyokimyasal ve moleküler biyolojik yaklaşımlar için fare mayoz çalışmanın yanında kolayca uygulanabilir.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Öğrenin Drosophila testislerinin diseksiyon, fiksasyon ve antikor inkübasyonu ile sitolojik analizini. Bu yöntem spermatogenez evrelerinde hücre yapılarını gözlemlemek ve protein lokalizasyonunu incelemek için kullanılır.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar

Daha fazla video keşfet