Drosophila Larva IHC

Drosophila melanogaster, çok yönlülüğü ve kullanım kolaylığı nedeniyle yaygın olarak incelenen bir model organizmadır.

Drosophila larva preparatları üzerinde gerçekleştirilen immünohistokimya, proteinlerin varlığı, yeri ve birlikte lokalizasyonu hakkında bilgi sağlayabilen paha biçilmez bir yöntemdir.

Bu video, Drosophila larva dokusunun diseksiyonu, fiksasyonu, blokajı ve montajı için gerekli yöntemleri ve uygulama örneklerini kapsayacaktır.

İmmünohistokimya, dokudaki spesifik proteinleri hedeflemek, bağlamak ve nihayetinde görselleştirmek için modifiye edilmiş antikorlar kullanan bir süreçtir.

Drosophila larvasının immünohistokimyası, larva dokusunun hassasiyeti nedeniyle doğruluk ve zamanlama gerektiren uygun diseksiyona dayanır.

Diseksiyon tipik olarak fosfat tamponlu salin veya kısaca "PBS" içinde yapılır.

Ekstraksiyon üzerine organlar geçici olarak larvaların iç pH'ı ile aynı pH'a sahip bir tuzlu su çözeltisi olan PBS'ye yerleştirilir.

Diseksiyondan sonra Drosophila larva IHC'deki bir sonraki adım fiksasyondur.

Fiksasyon, dokunun dokuyu koruyan seyreltilmiş formaldehit bazlı bir çözeltiye yerleştirildiği bir işlemdir.

Bu sabitleme solüsyonu, dokudaki proteinlerin enzimatik parçalanmasını önler.

Fiksasyonu takiben, PBST adı verilen Triton-X içeren PBS kullanılarak immünoboyama işlemi boyunca birkaç yıkama aşaması gerçekleşir.

Triton-X100, yüzey gerilimi kesici görevi gören ve hücreye nüfuz ederek antikorların ve diğer reaktiflerin girmesine izin veren az miktarda deterjan sağlar.

Fiksasyon ve yıkamadan sonra doku blokaj için hazırdır.

Bloke edici çözelti, dokuya bağlanan ve hedefe özgü antikorların aksi takdirde yapışacağı spesifik olmayan bağlanma bölgelerini işgal eden proteinler içerir. Engelleme, yanlış bir pozitif protein sinyalini önlemeye yardımcı olur.

Bloke edildikten sonra doku boyama için hazırlanır.

Boyama, antijen adı verilen bir hedef proteine bağlanan oldukça spesifik "birincil" antikor içerir.

Bir raportör moleküle konjuge edilmiş bir "ikincil" antikor, birincil antikoru bağlar.

Raportör molekül, genellikle doğası gereği floresan olan, görselleştirilebilen lokalize bir sinyal yayar.

Her antikor inkübasyon adımını takiben, spesifik olmayan bir şekilde bağlanmış herhangi bir antikoru çıkarmak için fazla antikor yıkanır.

Boyama işleminden sonra numune monte edilmelidir.

Lekelenmenin sonuçlarını görmek için, dokunun slaytlara dikkatlice monte edilmesi gerekir.

Dokuyu kaplamak için kalın bir reaktif veya montaj ortamı kullanılır.

Numune daha sonra mikroskop altında görüntülenmeye hazırdır.

Artık Drosophila immünohistokimyasının ilkelerini incelediğimize göre, bunun nasıl yapıldığını görmeye hazırız.

Bu videoda, fiksasyonla başlayan Drosophila larva beyninin immünohistokimyasında kullanılan reaktiflere, araçlara ve süreçlere odaklanacağız.

Takip ettiğimiz süreç tüm beyni kullanır ve tüm montaj boyama olarak bilinir.

Diseksiyon prosedürü, deney için kullanılan doku tipine bağlı olarak farklılık gösterse de, IHC'nin ana adımları aynı kalır, bu nedenle fiksasyon adımına geçeceğiz.

Larva beyinlerinin diseksiyonu tamamlandıktan sonra, PBS'yi bir pipetle çıkarın.

Sabitleyici ekleyin ve özel protokolünüze göre inkübe edin, beyinler için 23 dakika kullanın.

Sabitlemeyi takiben, numuneleri PBST'de dört kez yıkayın.

Numuneleri en az 30 dakika oda sıcaklığında bloke edici çözelti içinde inkübe edin.

Uygun dilüsyonları kullanarak, gece boyunca 4 °C'de primer antikor çözeltisinde inkübe edin.

Kuluçka döneminden sonra beyinleri PBST'de oda sıcaklığında bir pipet ucu ile dört kez yıkayın.

Floroforların ağartılmasını önlemek için numuneleri gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de ikincil antikorda inkübe edin.

Yine, PBST'de beyinleri dört kez yıkayın.

Beyinleri bir saat boyunca montaj ortamında dengeleyin.

Dengelemeden sonra, ucu kesilmiş bir p200 pipeti kullanarak beyinleri bir slayta aktarın.

Ezilmesini önlemek için numunenin etrafına ara parçalar yerleştirin.

Numunelerin üzerine bir lamel yerleştirin.

Kayma kenarlarını oje ile kapatın. Larva beyinleri artık immünohistokimya ile görüntülenmeye hazırdır

Drosophila beyinlerinin immünohistokimyasını ele aldığımıza göre, IHC prosedürlerini uygulamanın bazı alternatif yollarını inceleyelim.

Drosophila larvasını görüntülemeye hazırlamak için alternatif diseksiyon ve fiksasyon teknikleri kullanılabilir.

Bu deneyde, araştırmacılar hücrelerin belirli şekilleri nasıl oluşturduğunu öğrenmek istiyorlar.

Bunu, larva trakeal terminal hücrelerinin morfolojilerini izleyerek yaparlar.

Araştırmacılar, GFP'yi ifade eden mutant bir sinek hattından yararlanıyorlar.

GFP ifadesi, bir su banyosunda ısıya maruz kalmasıyla indüklenir

Larvalar floresan ile diseksiyon mikroskobu altında seçilir.

Floresan yayan sinekler, GFP'nin başarılı aktivasyonunu gösterir.

Bu sinekler, ısı ile alternatif bir fiksasyon şekline tabi tutulur; Diseksiyona gerek yoktur.

İzlemeye yardımcı olmak için yazılım kullanıldıktan sonra, trakeal dalların ve lümenin hücresel morfolojileri tanımlanır.

Drosophila yumurtalık, kök hücrelerin hücresel ortamlarıyla nasıl etkileşime girdiğini anlamak için mükemmel bir modeldir.

Drosophila yumurtalıklarının IHC'si, Drosophila dişilerini erkeklerde görülen testislere karşı yumurtalıkların varlığına göre tanımlayarak başlar.

Toplanan dişi larvalar, yumurtalıkları barındıran yağ gövdesi olarak bilinen bir yapı elde etmek için dikkatlice incelendikleri ayrı kuyucuklara aktarılır.

Yağ cisimleri sabitlenir ve boyanır ve daha sonra - dokuyu slaytlara yerleştirdikten sonra - yumurtalıklar yağ vücut dokusundan ayrılır. Slaytları monte ettikten ve görselleştirdikten sonra, floresan boyama, larva yumurtalığındaki somatik hücrelerin ve ilkel germ hücrelerinin yerini ortaya çıkarır.

Drosophila larvalarının immünohistokimyası, pupa ve ergin IHC ile birçok paralelliğe sahiptir.

Örneğin, araştırmacılar IHC'yi Drosophila retinalarına farklı gelişim aşamalarında bakmak için kullanabilirler: larva, pupa ve yetişkin, böylece pupa, larva ve yetişkin immünohistokimya prosedürleri arasındaki farkı gösterebilirler.

Sonuçlar, Drosophila retinalarının gelişiminin çeşitli aşamalarını göstermektedir.

Drosophila larvasının immünohistokimyası, çok sayıda uygulama ve varyasyona sahip bir araçtır. Bu videoda diseksiyon, fiksasyon, boyama ve montaj dahil olmak üzere larvaların immün boyama prosedürlerini ele aldık. İzlediğiniz için teşekkürler!