JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila

Full Text

10,518 Views

09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Drosophila melanogaster larvaları besleme devresi besleme hızındaki değişimler stomatogastric sinir devresi değişiklikler ile korelasyon sağlayan bir basit ama güçlü bir model oluşturuyor. Bu devre, ağız kanca projeksiyonlar hem de foregut göndermek merkezi serotonerjik nöronların oluşmaktadır.

Transcript

Bu prosedürün genel amacı, davranışsal çıktıları nöral mimarideki değişikliklerle ilişkilendirmek için Drosophila model sistemini kullanmaktır. Bu, ilk olarak larvaları toplamak için yetişkin drosophila'nın popülasyon kafeslerinin kurulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, ikinci ve üçüncü instar larvalarının lokomotor yeteneklerini değerlendirmektir.

Üçüncü adım, ağız kancalarının uzamasını ve geri çekilmesini gözlemleyerek larvaların beslenme davranışını değerlendirmektir. Son adım, immünohistokimyasal teknikler kullanılarak geç üçüncü instar larvalarından kanıtlanmış ventriküler örneklerin diseke edilmesi ve hazırlanmasıdır. Sonuç olarak, sonuçlar, gelişim sırasında nöral mimarideki sapmaların, davranışsal tahliller ve immünofloresan mikroskobunun birlikte kullanılması yoluyla davranışsal değişikliklerle nasıl ilişkili olduğunu gösterebilir.

Bu tekniğin sonuçları, nörolojik hastalıkların ilerlemesini daha iyi anlamayı sağlayan nöral mimarinin gelişiminin daha iyi anlaşılmasına doğru uzanır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda bir yüksek lisans öğrencisi prag bot olacaktır. Drosophila popülasyon kafeslerini 12 saatlik açık karanlık bir döngüde 25 santigrat derecede tutun.

Kontrol ve deney grupları aynı aydınlatma koşullarına maruz kaldığı sürece, bu teknik standart bir laboratuvar ortamında gerçekleştirilebilir. Yerleşik popülasyonları kullanarak, dişilerin gece boyunca elma suyuna yumurta bırakmasına izin vererek larvaları toplayın. Agar tabakları sabahları tabağı değiştirir ve toplanan tabağın ortasına küçük bir parça maya koyar.

Maya, yumurtadan çıkan larvaları çekecek, yumurtaların 25 santigrat derecede 24 saat boyunca gelişmesine izin verecek ve ertesi gün ilk instar larvalarını macundan toplayacaktır. Metal bir spatula kullanarak larvaları taze elma suyuna veya üzüm suyu tabağına aktarın. İkinci ve erken üçüncü Instar larvalarını toplamak için tahliller yapılana kadar larvaları beslemek için ek maya macunu eklenebilir, bu da ilk instarın 40 ila 48 saat yaşlanmasına izin verir.

Bu zaman dilimi boyunca, besleme oranlarının toplanması sabittir. Geç üçüncü instar larvaları larvaları şişelerde yükseltir. Geç üçüncü instar larvalarının meyve suyu plakalarında yetiştirilmesi, somatik mide sistemindeki ağrı birikimi nedeniyle zararlı olabilir.

Bir larva yaşı, bu yapıda belirgin değişiklikler olduğu için ağız kancası morfolojisi ile doğrulanabilir. Her larva küfüyle, meyve suyu plakasını suyla nazikçe ve yoğun bir şekilde yıkayarak ve larvaları bir ağ filtreye dökerek geç ikinci ve erken üçüncü instar larvalarını toplayın, ardından davranış analizine devam edin. 100 milimetrelik bir doku kültürü kabında% 2'lik bir substrat üzerine tek bir ikinci sondan üçüncü instar larvaya yerleştirin ve larvaların tam olarak bir dakika boyunca 30 saniye boyunca alışmasına izin verin.

Bir karşı çetele kullanarak, substrat üzerindeki her bir arkadan öne hareket, hayvanın vücudunun dörtte üçünde meydana gelen her kasılma puanı. Larvalar yan yana sallandığında, ancak aslında pozisyon değiştirmediğinde, bu hareketler puanlanmaz. Bazen tam bir önden arkaya kasılma, ileri hareket gibi geriye doğru bir hareket oluşturur.

Geriye doğru hareket de puanlanır. Toplamda en fazla 10 hayvan test edildikten sonra tahlil plakasını değiştirin. Deney koşulu başına en az 20 kayıt yapın.

Lokomotor testinde kullanılan her larvayı künt inox kullanarak besleme testinde puanlayın. Beş numara, cımbız. Bir larvayı lokomotor agri plakasından, beş mililitre homojen bir maya çözeltisi ile kaplanmış ağrı dolu bir plakanın merkezine dikkatlice aktarın.

Maya çözeltisinde, larvalar büyük ölçüde yerinde kalacaktır ve yem beslemesi, sefalon faringeal scle haklarının uzaması ve geri çekilmesi olarak görülen ağız kancası kasılmalarının oranı ile doğrudan ilişkilidir Larvaların 30 saniye boyunca alışmasına izin verin ve ardından bir dakika boyunca, bir sayaç kullanarak ağız kancası kasılmalarının sayısını kaydedin. PBS'de taze hazırlanmış% 4 EM dereceli formaldehiti üç kuyulu bir spot cama yükleyerek başlayın. Daha sonra dolaşan üçüncü bir instar larvasını PBS ile bir diseksiyon kabına aktarın.

Bir forsep ile arka ucu tutun ve diğer ile arka ucu hareketsiz tutarken ağız kancalarını tutun. Bağırsaklara erişmek için ağız kancalarını nazikçe çekin. Tükürük bezleri, beyin, yağ gövdesi vb. gibi ilişkili dokuları çıkarın.

Daha sonra her bir bağırsağı formaldehit fiksasyonunu içeren üç kuyulu tabağa aktarın. Bağırsakları opak bir doku kültürü kutusunda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Fiksasyon solüsyonunu çıkarmadan önceki ertesi gün, mide secasını çıkarın ve orta bağırsağı kanıtlanmış ventriküllerin yakınına klipsleyin, böylece projeksiyonlar engel olmadan net bir şekilde görülebilir.

Şimdi, fiksatifi bir XPBT ile değiştirin ve dokuların hafif sallanma ile 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Bu PBT yıkamayı altı kez yapın. Ardından, nöral mimariyi etkilemeden serotonin sinyalini artıracak serotonin ekleyin.

Daha sonra bağırsakları sallanmadan dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Bir saat sonra, birincil antikoru çıkarmak için bağırsakları PBT ile altı kez iyice yıkayın. Daha sonra bağırsakları gece boyunca anti serotonin birincil antikoru ile dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, altı PPT yıkamasını tekrarlayın ve 90 dakika boyunca dört santigrat derecede ikincil antikor inkübasyonunu takip edin. Bir ila 400 Alexa kat 5 68 keçi anti-US veya bir ila 400 anti tavşan IgG kullanın. PBT yıkama rejimini kullanarak ikincil antikoru çıkarın ve ardından bağırsakları dört milimolar sodyum karbonat içinde 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

Bağırsaklar daha sonra tampon olarak 20 milimolar sodyum karbonat ile %4 N propil gallat içine monte edilebilir ve analiz için 400 x büyütmede floresan altında görüntülenebilir. Kanıtlanmış ventriküllerin arka ucunda görüntü çekmekten kaçının çünkü bu lifler sıkıca demetlenmiştir. Orta bağırsaktaki daha fazla arka lif daha dallıdır çünkü dokuya girdiklerinde fasiküle olurlar.

Nörit lifleri, neuro lucita ve neuro Explorer gibi ticari yazılımlar kullanılarak, manuel olarak çalıştırılarak veya ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımlar kullanılarak ölçülebilir. Net olmayan basit nerit izleyici görüntüleri, lif ve varisleri ayırt etmeyi zorlaştıracaktır ve lif mimarisi arka plandan net bir şekilde ayırt edilebiliyorsa kullanılmamalıdır. Ve nerit uzunluğu boyunca bireysel varisler tanımlanabilirse, hazırlık analiz için uygundur.

Ayrıca, lifin geri kalanından bireysel varisler tespit edilebiliyorsa, bu, analiz için kaliteli bir görüntünün başka bir göstergesidir. Beyinden çıkıntı yapan aksonal lifler, nüks sinirine demetlenir ve ayrıldıkları ve innerve oldukları kanıtlanmış ventriküle ulaşana kadar analiz için uygun değildir. Buharatik mide sistemi Odak aralığı dışındakiler hariç tüm lifleri analiz edin.

Bazı durumlarda, lifler birden fazla odak düzlemi arasında kıvrılır, beyinden kanıtlanmış ventriküllere kadar bireysel lif projeksiyonlarını izler ve varisleri ve dalları sayar, ardından birim uzunluk başına büyük varislerin sıklığını hesaplar. Serotonerjik beslenme devresini incelemek, belirli faktörlerin sinir sistemi gelişimi üzerindeki etkisini analiz etmek için etkilidir. Besleme hızını ölçerek, besleme devresinin aksonal mimarisini fonksiyonel çıkışı ile bağlamak mümkündür.

Lokomotor test, kontrol ve mutant genotipler arasındaki lokomotor yanıtlarda bir fark göstermez. Mutasyonlar sadece besleme devresini etkiliyorsa, mutant elipsoid cisim açılır. EBO üç, merkezi kompleksin elipsoid gövdesinde yapısal bir kusura sahiptir.

Vahşi tip ebeveyn suşu. CSWU, EO üç'ün hareketin etkilenmezken depresif beslenmeye yol açtığını ortaya koydu. EO üç mutantındaki gelişimsel kusurlar, bağırsağın ürat mimarisini etkiledi.

Bu larvalar, ürat uzunluğu boyunca hem küçük hem de büyük olmak üzere daha fazla dallanma ve daha fazla varislik gösterdi. Oklardaki dal düğümlerine, ok başlarındaki varislere ve yıldız işaretindeki büyük varislere dikkat edin. Nöral dallanmadaki bu değişiklikler istatistiksel analiz için ölçüldü.

Bu prosedürü denerken, larvalara veya disseke edilen doku örneklerine zarar vermemeyi unutmamak önemlidir.

Explore More Videos

Nörobilim Sayı 81 Nöral Yollar Drosophila Mikroskopi beyin görüntüleme Davranış Davranış Mekanizmaları Dopamin İmmünohistokimya nörit proventrikülüs serotonin varisler hayvan modeli