Name: Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi In Vitro Yapışma Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin probiyotik Streptococcus salivarius'un Streptococcus pneumoniae'nin epitel hücrelere yapışmasını in vitro yöntemle nasıl inhibe ettiğini. Bu teknik, pnömokokal kolonizasyonu önleme stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü ve Victoria Hükümeti&#39;nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Jacoby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+co-occurrence+of+Streptococcus+pneumoniae+with+other+bacterial+and+viral+pathogens+in+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract.</a> Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).</li>
<li>Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acquisition+and+high+nasopharyngeal+co-colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+three+respiratory+pathogens+amongst+Gambian+new-borns+and+infants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants.</a> BMC Infect. Dis. 11, (2011).</li>
<li>Licciardi, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+against+pneumococcal+disease%3A+critical+interactions+between+probiotics+and+the+airway+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome.</a> PLoS Pathog. 8, (2012).</li>
<li>Popova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+probiotics+in+upper+respiratory+tract+infections+and+their+mechanical+actions+to+antagonize+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens.</a> J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).</li>
<li>Pracht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavA+of+Streptococcus+pneumoniae+modulates+adherence%2C+invasion%2C+and+meningeal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation.</a> Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).</li>
<li>Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+human+bronchial+epithelial+cells+%28BEAS-2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B).</a> Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+pneumoniae+adherence+to+human+epithelial+cells+in+vitro+by+the+probiotic+Lactobacillus+rhamnosus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG.</a> BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).</li>
<li>Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+bacteriocins+and+the+case+for+Streptococcus+salivarius+as+model+oral+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics.</a> Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).</li>
<li>Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+oral+probiotic+Streptococcus+salivarius+K12+in+the+prevention+of+recurrent+pharyngitis+and%2For+tonsillitis+caused+by+Streptococcus+pyogenes+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).</li>
<li>Fiedler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+respiratory+tract+streptococci+against+Streptococcus+pyogenes+biofilm+formation+and+epithelial+cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).</li>
<li>Slotved, H. C., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+pneumococcal+isolates+representing+23+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes.</a> BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).</li>
<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
<li>Smith-Vaughan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nasal+bacterial+load+and+its+association+with+otitis+media%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ear+Nose+Throat+Disord%22%5BJournal%5D)">Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media.</a> BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).</li>
<li>Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+of+bacterial+adhesion+onto+mammalian+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu tahlilde önemli bir kısmının S. uygun konsantrasyonları katmaktadır bölümlerde 3.1.7 ve 3.1.12 de salivarius ve pneumococci&#39;ye. Konsantrasyonlar OD okumaları kullanılarak tahmin edilir, ancak bir sonraki gün plakalar sayılmıştır kadar tam olarak uygulanması gibi tespit edilmez. Bu nedenle, orta log fazı belirlemek ve OD ile konsantrasyonunun tahmin yardımcı olmak için tahlilde kullanılan tüm bakteriyel suşlar için zamanla OD ve uygun bir sayıları (CFU / ml) ölçmek için büyüme eğrileri gerçekleşt...

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) pnömoni, otitis media ve menenjit gibi enfeksiyonlara neden olabilen bir Gram pozitif bir bakteridir. Düşük gelirli ülkelerdeki çocukların ve yıllık 1 beş yaşın altındaki çocukların yaklaşık 800.000 kişinin ölümünden sorumlu hastalığın önemli bir nedenidir. Pnömokok sıklıkla genç çocukların nazofarenks yapılmaktadır. Bu kolonileşme genellikle asemptomatik kabul edilir olsa da, bu pnömokok kökenli enfeksiyon takip eder ve insan popülasyonlarında 2&#39;deki bakteriler için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Pnömokok kökenli konjügat aşısı etkili aşı içinde bulunan serotiplerin taşıma azaltır. Ancak, 90 pnömokok serotipleri üzerinde olan ve aşı serotiplerinin ortadan kaldırılması nonvaccine serotip 3 kaynaklanan taşıyıcı ve hastalık bir artış takip etmektedir, burada serotip değiştirilmesi, yol açabilir. Ayrıca, bazı yüksek riskli popülasyonlarda, pnömokokkolonizasyon genellikle önce ilk aşı dozu 4,5 tatbikatından, çok erken yaşta ortaya çıkar. Son zamanlarda, probiyotiklerin kullanımı pnömokok kolonizasyon 6,7 inhibe etmek için ilave bir strateji olarak teklif edilmiştir. In vitro deneyler, yapışma pnömokokkal yapışmayı 8,9 incelemek için kullanılmıştır. Bu deneyler pnömokok bağlılık 10 probiyotik Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) etkisini araştırmak için adapte edilmiştir. LGG ve diğer laktik asit bakterileri ek olarak, Streptococcus salivarius, ağız boşluğu, ortak yerleşik nedeniyle potansiyeli ve in vitro 11 pnömokok ve diğer solunum yolu patojenleri inhibe etme yeteneği ile kolonizasyon için solunum yolu için potansiyel bir probiyotik olarak incelenmiştir - 13. Burada sunulan protokol S. etkilerini araştırmak için kullanılan bir bağlılık tahlili tarif Pnömokok bağlılık üzerine salivarius K12insan epitel hücre hattı CCL-23. Büyümesi ve yapışma özellikleri izolatların 10,14 arasında önemli ölçüde değişebilir olarak deneyde kullanılmadan önce, pnömokok izolatı, yapışma özellikleri için değerlendirilmiştir. Pneumococci ve S. büyüme eğrileri salivarius (OD, Şekil 1) optik yoğunluk ile orta log fazı ve tahmini konsantrasyon (koloni oluşturan birim veya CFU / ml) tespit etmek için yapılmıştır. Her deneyde kullanılmadan önce izole edilmesi için uygun bir sayısı ve OD ile büyümesini incelemek için tavsiye edilir. Bu deney, standart doku kültürü tesisleri ve ekipmanları ile herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Bu protokol, S. üç doz etkisi salivarius önce S. uyumda pnömokok ilavesinden 1 saat uygulanmıştır pneumoniae PMP843, bir nazofarenks sürüntü türetilmiş bir serotip 19F taşıma izole incelenmiştir. Yapışık pnömokok ölçmek için iki farklı yol sunulmuştur: caydırmak için kan agar üzerine kaplamamaden canlı sayımları ve DNA ekstraksiyon ve qPCR 15 tarafından pnömokok lytA geninin tespiti. Temel yapışma tahlili protokolü kolay farklı dozlarda ve probiyotik tatbikat süresi test etmek için modifiye edilebilir ve aynı zamanda, diğer bakteri türleri ya da türleri ile kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Minimum Esansiyel Medya (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Matara</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CCL-23 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre kültürü plakası</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>At kanı agar (HBA) plakaları</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Koyun kanı agar plakaları da kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt Et Suyu</td><td>Oksoit</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık küvetler</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Pfizer</td><td>2112105,</td><td>5.000 IU / 5m/&nbsp'de steril ampullerde gelir;</td></tr><tr><td>Steril yayıcı</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternatif olarak, bir cam yayıcı %96 etanole batırılabilir ve her kullanımdan önce alevle sterilize edilebilir</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS% 20 çözüm</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mini kiti (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F astar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Özel yapılmış</td><td>5 '-> 3' dizi ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R astar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Özel yapılmış</td><td>5 '-> 3' dizi&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA probu</td><td>Eurogentec</td><td>Özel yapım</td><td>5 '-> 3' dizi Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternatif floroforlar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Hızlı QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Termo-Hızlı 96 Algılama plakası &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraclear qPCR kapak şeritleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR Sistemi</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>*Listelenen <td></td><td></td><td>ürünlerin çoğu/tümü için alternatif kaynaklar mevcuttur</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bir kullanma pnömokok kolonizasyon üzerinde probiyotiklerin etkileri incelenmesi<em&gt; in vitro</em&gt; yapışma deneyi

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Nazofarenks epitel astar Streptococcus pneumoniae (pnömokok) yapışması kolonizasyonu neden olabilir ve. In vitro deneyler, hücre yapışma epitel pnömokokkinin eki incelemek için kullanılabilir zatürre ve orta kulak iltihabı gibi pnömokok kökenli enfeksiyonları için bir ön koşul olarak kabul edilir ve mono tabakaları, bu tür probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler, araştırmak pnömokokkal kolonizasyonu inhibe. Burada açıklanan protokol (bazen HEp-2 hücreleri olarak da adlandırılır), insan epitel hücre hattı CCL-23, pnömokokkinin yapışması üzerinde, probiyotik Streptococcus salivarius etkilerini incelemek için kullanılır. Deney üç ana adımdan oluşur: epitel ve bakteri hücrelerinin 1) hazırlanması, hücre mono tabakaları epitel bakteri 2) ilavesi ve canlı sayısı (seri seyreltme ve kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR yapışık pnömokokkinin 3) tespiti .) Bu technique nispeten basittir ve bir doku kültürü kurulum dışındaki özel ekipman gerektirmez. Deney, diğer probiyotik türler ve / veya kolonizasyon pnömokok potansiyel inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir ve kolayca pnömokok yapışma ve yayılım ile ilgili diğer bilimsel soruları için modifiye edilebilir.

Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, bu pnömokok in (S. pneumoniae PMP843, bir kolonize 19F izole edilmiş) 1 saat S. eklenmesinden sonra CCL-23 hücrelerine ilave edildi salivarius ve pnömokokkal yapışmayı canlı sayımı ve lytA qPCR her ikisi tarafından nicelleştirilmiştir Tablo 2 &#39;de gösterilmiştir. Sonuçlar sayısına normalize bakteri mutlak sayısı (CFU / ml olarak gösterilmiştir) ve% bağlılık, her ikisi için de, iki yöntem arasındaki uyumluydu yalnız pnömoko...

In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Bu prosedürün genel amacı, probiyotik bir streptococcus cell levarius'un, pnömokokların bir epitelyal hücre hattına tutunmasını inhibe etme yeteneğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle CCL 23 epitelyal hücre monotabakalarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. 24 kuyucuklu bir plakada, slovar ve pnömokoklar sırasıyla monotabakaya eklenir ve hücreler inkübe edilir.Son adımda, yapışmayan bakterileri uzaklaştırmak için kuyucuklar yıkanır. CCL 23 epitel hücreleri lizize edilir ve kuyucuk içerikleri toplanır. Nihayetinde, salivarius'un pnömokok yapışması üzerindeki etkisi, hücreye ilişmiş pnömokok sayısı nicelendirilerek değerlendirilebilir.Bu yöntem, probiyotiklerin pnömokok gibi bakteriyel patojenlerin yapışmasını inhibe edip edemeyeceği gibi enfeksiyon hastalıkları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, laktobasillus hipnosis, GG ve diğer probiyotiklerin solunum yolundaki potansiyel kullanımını araştırmaya başladığımızda edindik. Bu prosedürü laboratuvarımızdan PhD öğrencileri Jane Manning ve Zen uygulamalı olarak göstereceklerdir. Deneyden bir gün önce, konflüans durumundaki CCL 23 epitel hücre kültürünü ayırın ve ardından steril 50 mL'lik bir tüp içerisinde, önceden ısıtılmış medyada 150.000 hücre/mL konsantrasyona seyreltin.Ardından, hücreleri işlem görmüş 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağına kuyucuk başına bir mililitre olacak şekilde ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir öze kullanarak, her bir bakteriyel kültürden ayrık olan 10 ila 12 koloniyi, %0,5 maya ekstresi eklenmiş 10 mililitrelik Todd Hewitt besiyeri alikotlarına inoküle edin. Kültürleri kısaca vorteksleyin ve deney gününde 14 ila 16 saat boyunca inkübe edin.Bakteri kültürlerinin her birini üç ila beş saniye boyunca vorteksleyin, ardından 10 mL besiyeri içeren etiketlenmiş ve ön ısıtılmış tüplere 100 µL pneumococci ve 100 µL salivarius ekleyin. İnoküle edilen tüpleri üç ila beş saniye boyunca vorteksleyin ve kültürleri orta log fazına kadar büyütmek için 37 °C'de inkübe edin. CCL 23 hücre kültürünün en az %80 konfluans düzeyine ulaştığını doğruladıktan sonra, hücre monokatmanını bozmamak için plakayı hafifçe eğerek transfer pipeti yardımıyla 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundaki medyumu uzaklaştırın; ardından kuyucuklara yaklaşık 500 µL ön ısıtılmış PBS ekleyip sıvıyı transfer pipetiyle nazikçe çekerek kuyucukları iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra monokatmanı korumaya yardımcı olmak için yıkamalar sırasında plakayı eğik tutun. Her kuyucuğa 500 µL önceden ısıtılmış besiyeri ekleyin ve bakteriyel kültürleri hazırlarken plağı inkübatöre geri yerleştirin. İlk olarak, 1 mL levarius kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm absorbsiyonda ölçün.Ardından, beş mililitre Sal Levarius kültürünü 10 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 1.870 Gs'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, pellet'i OD okumasına bağlı olarak, yaklaşık 1,5 × 10⁹ koloni oluşturan birim/mililitre final konsantrasyonuna ulaşana kadar 200 ila 1000 mikrolitre %0,85 sodyum klorür içinde süspanse edin. Doğru sayıda bakteri eklemek, deneyin en zor kısmıdır çünkü eklenen gerçek bakteri sayısı ancak ertesi gün koloni sayımı gerçekleştirildiğinde belirlenir.Şimdi, resüspande edilen tükürük inokülümünü üzerinde "yüksek" yazan bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Analiz için orta ve düşük konsantrasyonlarda inokülüm hazırlamak amacıyla, yüksek konsantrasyonu 0,85% sodyum klorür içinde 1:10 ve 1:100 oranlarında seyreltin; heparin kontrol kuyucuklarını oluşturmak için seyreltmeler arasında tüpleri vortekslenmiş şekilde karıştırın. Her kontrol kuyucuğundan 40 µL ortamı uzaklaştırın ve kuyucuk başına 100 U/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde 50 µL heparin ekleyin.Sadece CCL 23 hücrelerinin bulunduğu kuyucuklara ve sadece CCL 23 hücreleri ile pnömokokların bulunduğu kuyucuklara 10 µL %0,85 sodyum klorür ekleyin ve tüm SIV konsantrasyon alanlarını tamamen vorteksleyin. Ardından, bakterilerin hücre monotabakasıyla temasını teşvik etmek için, ilgili kuyucuklara 10 µL seyrelmemiş, 1:10 ve 1:100 oranlarında çeşitli SIV konsantrasyonları ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında, 114 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından hücreler inkübe edilirken plağı bir saat boyunca inkübe edin. Tükürük stokunu %0,85 sodyum klorür ile seri dilüsyonla seyreltin ve steril bir yayma çubuğu kullanarak 10⁻⁵, 10⁻⁶ ve 10⁻⁷ dilüsyonlarından 100 µL'yi at kanlı agar plaklarına çift örnek şeklinde dağıtın.Plakları, monolayer aşamasının sonuna doğru, bir gece boyunca ters konumda inkübe edin. Pnökok kültürünün optik yoğunluğunu ölçün ve ardından hücrelerin bir mililitresini santrifüjle çöktürün. Pelleti, OD okumasına bağlı olarak, mililitrede yaklaşık 150 milyon koloni oluşturan birim nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde 300 ila 2000 mikrolitre %0,85 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin.Ardından, negatif kontrol kuyucukları dışındaki tüm kuyucuklara 10 µL seyreltilmemiş pneumococci ekleyin, 24 kuyucuklu plakayı tekrar santrifüjleyin ve ardından ko-kültürleri üç saat boyunca inkübe edin; inkübasyon adımı sırasında pneumococcal stokunu, salivarius ile benzer şekilde seri olarak seyreltin ve plakaya ekin. Üç saatlik inkübasyonun ardından, hücreleri herhangi bir sitopatik etki yönünden mikroskop altında kontrol edin.Şimdi her kuyucuktaki medyumu uzaklaştırın ve yapışmayan bakterileri temizlemek için ko-kültürleri 1X PBS ile üç kez nazikçe yıkayın; bu sırada monokatmanları bozmamaya dikkat edin. Ardından, hücreleri 200 µL %0,1 Digitonin ile 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında yedi dakika boyunca lizleyin. Sonrasında, her birine 800 µL THB ekleyin.Birkaç kez pipetle yukarı aşağı çekerek her kuyruktaki hücre süspansiyonlarını etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Son olarak, adherent pnömokokları seri olarak seyreltin ve ertesi gün uygun dilüsyon plaklarında kolonileri sayın. Bu tablodaki pnömokok ve slovar miktarlarını belirlemek için, pnömokokların slovar eklenmesinden bir saat sonra CCL 23 hücrelerine eklendiği temsili bir deneyin sonuçları gösterilmektedir.Pnömokok yapışması hem canlı sayımı hem de lit. A-Q-P-C-R ile nicelendirilmiştir. Her iki yöntemle elde edilen sonuçlar, hem bakterilerin mutlak sayısı hem de yapışma yüzdesi açısından birbiriyle tutarlıdır. Yalnızca pnömokok içeren kuyucuklardaki yapışan pnömokok sayısına göre normalize edilmiştir.Heparin, pnömokokal adezyonu inhibe ettiği bilindiği için kontrol olarak kullanılır. Bu nedenle, pnömokoklar artı heparin örneklerinde adezyonun, tek başına pnömokoklara kıyasla yaklaşık %40 veya daha fazla azalması, assay'in başarılı olduğunun göstergesidir. Salivarius, pnömokokal adezyonu doz bağımlı bir şekilde inhibe eder ve yaklaşık 10 salivarius'a karşı bir pnömokok şeklinde olan yüksek salivarius konsantrasyonu, en düşük pnömokokal adezyonla sonuçlanmıştır.Bu grafikler, salivarius'un pneumococci'den bir saat önce, pneumococci ile eş zamanlı olarak veya pneumococci'den bir saat sonra eklendiğinde, pneumococci'lerin CCL 23 hücrelerine yapışmasını göstermektedir. Alvar, pneumococci'den önce eklendiğinde pneumococcal yapışmasını inhibe etmede daha etkilidir; nitekim pre-edition analizinde Alvar'ın hem yüksek hem de orta dozları pneumococcal yapışmasını anlamlı derecede azaltmıştır. Buna karşılık, Coit edition ve post-edition analizlerinde yalnızca yüksek dozlardaki Slovar pneumococcal yapışmasını inhibe etmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, probiyotik streptococcus cell areas tarafından pnömokokal adezyonun inhibisyonunu ölçmek için in vitro bir analiz yönteminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, kültür hücreleri üzerine yapıştırılır birimler oluşturan bakteri kolonisi sayısının sayma oluşan basit bir bakteriyel yapışma testtir. Testin sağlam, adhesin bağımsız olarak okudu ve çeşitli varyasyonlar bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan çoğu laboratuvarlarda kullanılır.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

Kaynak: Jagau, H. ve diğerleri. Sabit akışta birincil insan endotel hücrelerinin pnömokok enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, sabit ortam akış koşulları altında endotel hücreleri üzerindeki Von Willebrand Faktörü (VWF) dizilerine pnömokok bağlanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir. VWF salınımını uyarmak, dizileri etiketlemek ve bakteri bağlanmasını ölçmek için adımları özetlemektedir.

Sabit Medya Akışı Altında Primer İnsan Endotel Hücrelerine Pnömokok Bağlanmasının Değerlendirilmesi

Kaynak: Calatayud Arroyo, M. ve diğerleri. In vitro bağırsak konak-mikrob arayüzünde sentetik bakteriyel konsorsiyumunun uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, bakteriyellerin canlılığını incelemek için in vitro bağırsak konakçı-mikrop modelini gösteriyor. Caco-2 ve HT29-MTX hücrelerinin ortak kültürü, simüle edilmiş sindirim koşullarında önceden işlenmiş bakterilerle kuluçka geçirilir. Epitel bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç kullanılarak...

Bakteriyel Yapışma ve İçselleştirmeyi Değerlendirmek İçeriği Değerlendirmek İçerik Bağırsak Modeli

Video, biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz yapışma testini göstermektedir. Çok kuyucuklu bir plakada, safra tuzu takviyeli ortamdaki bakteriler katı yüzeylere yapışarak biyofilmler oluşturur, bu da kristal viyole boyama ve etanol muamelesi yoluyla kolorimetri ile doğrulanır.

Biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz uyum testi

Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Streptococcus pneumoniae ciddi toplum kökenli pnömoni ve dünya çapında 2 milyondan fazla kişinin ölümünden sorumludur neden lider patojen olduğunu. Spor ya da virülans karıştığı bakteriyel faktörlerin etkisi biyolüminesens bakterileri kullanarak akut fare pnömoni veya bakteriyemi modelinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Streptococcus pneumoniae'deki rekabete, pnömokok ve diğer ilgili türlere karşı inhibe edici aktiviteye sahip bakteriyosinler, küçük antimikrobiyal peptitler aracılık eder. Burada, bakteriyosin aktivitesinin ve inhibitör spektrumun karakterizasyonuna, bakteriyosine özgü bağışıklığa ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin veren optimize edilmiş bir bakteri kaplama testini açıklıyoruz.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Bu çalışmada yenidoğan fareler için Probiyotikler gavaging kesin miktarda işlem ayrıntıları. Deneysel ayarı içerecek şekilde optimize edildi ama dozaj, yönetim yöntemleri ve bakterilerin bağırsak quantification probiyotik sınırlı değildir.

Probiyotik çalışmalar yenidoğan farelerde sonda ile besleme kullanarak

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Bu protokol, pks+ Escherichia coli farelerinin inflamatuar olmayan koşullarda kolonileşmesi için gerekli adımları, ayrıca kolonizasyonun doğrulanması ve dışkıda pks+ E. coli genişlemesinin değerlendirilmesi için invaziv olmayan yöntemleri tanımlar.

Murine pks+ Escherichia coli ile İltihap Olmayan Koşullarda Kolonizasyon

Keşfedin probiyotik Streptococcus salivarius'un Streptococcus pneumoniae'nin epitel hücrelere yapışmasını in vitro yöntemle nasıl inhibe ettiğini. Bu teknik, pnömokokal kolonizasyonu önleme stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi

Daha fazla video keşfet