Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi In Vitro Yapışma Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, bir probiyotik streptokok hücresi levarius'un bir epitel hücre hattına pnömokok yapışmasını inhibe etme yeteneğini incelemektir. Bu, önce CCL 23 epitel hücresi tek katmanlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. 24 oyuklu bir plakada, sonraki slovar ve pnömokoklar sırayla tek tabakaya eklenir ve hücreler inkübe edilir.

Son adımda, yapışmayan bakterileri uzaklaştırmak için kuyucuklar yıkanır. CCL 23 epitel hücreleri parçalanır ve kuyu içeriği hasat edilir. Sonuç olarak, tükürüğün pnömokok uyumu üzerindeki etkisi, hücre ile ilişkili pnömokokların sayısının ölçülmesiyle değerlendirilebilir.

Bu yöntem, probiyotiklerin pnömokok gibi bakteriyel patojenlerin yapışmasını engelleyip engelleyemeyeceği gibi bulaşıcı hastalıklar alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu yöntem için ilk olarak, lactobacillus hipnozu, GG ve diğer probiyotiklerin solunum yollarında potansiyel kullanımını araştırmaya başladığımızda aklımıza geldi. Bu prosedürü göstermek için laboratuvarımızdan doktora öğrencilerine Jane Manning ve Zen olacak Deneyden bir gün önce birleşme kültürüne, CCL 23 epitel hücrelerine bölün ve daha sonra bunları steril 50 mililitrelik bir tüpte mililitre başına 150.000 hücreye kadar Ön Isıtma ortamında seyreltin.

Daha sonraki tohum, tedavi edilmiş 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına bir mililitre hücre ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. Daha sonra 10 mikrolitrelik bir halka kullanarak, her bakteri kültürünün 10 ila 12 iyi ayrılmış kolonisini 10 mililitrelik bir Todd Hewitt suyu artı %0.5 maya özütü içine aşılayın. Deney gününde kültürleri kısaca 14 ila 16 saat boyunca girdaplayın ve inkübe edin.

Bakteri kültürlerinin her birini üç ila beş saniye boyunca vorteksleyin, ardından 10 mililitre et suyu içeren etiketli ön ısıtma tüplerine 100 mikrolitre pnömokok ve 100 mikrolitre tükürük ekleyin. Aşılanmış tüpleri üç ila beş saniye boyunca vorteksleyin ve kültürleri orta log fazına büyütmek için 37 santigrat derecede inkübe edin. CCL 23 hücre kültürünün en az% 80 oranında akıcılığını onayladıktan sonra, ortamı 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan çıkarmak için transfer pipetini kullanın, hücre tek tabakasını bozmamak için plakayı hafifçe eğin, ardından yaklaşık 500 mikrolitre ön ısıtma PBS ekleyerek ve sıvıyı bir transfer pipeti ile nazikçe çıkararak kuyuları iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra tek tabakanın korunmasına yardımcı olmak için yıkama sırasında plakayı eğin. Her bir oyuğa 500 mikrolitre ön ısıtma ortamı ekleyin ve bakteri kültürlerini hazırlarken plakayı inkübatöre geri koyun. İlk olarak, emici 600'de levarius kültürünün bir mililitresinin optik yoğunluğunu ölçün.

Daha sonra beş mililitre Sal Levarius kültürünü 10 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 1.870 Gs'de dört dakika boyunca tüpe santrifüjleyin. Snat Resus'u attıktan sonra, OD okumasına bağlı olarak peleti 200 ila 1000 mikrolitre nokta% 85 sodyum klorür içinde mililitre başına 10 ila dokuzuncu koloni oluşturan birimler yaklaşık 1.5 kez nihai konsantrasyona kadar askıya alın. Doğru sayıda bakteri eklemek, deneyin en zor kısmıdır, çünkü eklenen gerçek bakteri sayısı ertesi gün koloni sayımı yapılana kadar belirlenmez.

Şimdi yeniden askıya alınmış tükürük aşısını yüksek etiketli bir mikro füj tüpüne aktarın. Heparin kontrol kuyularını oluşturmak için seyreltmeler arasında tahlil vorteks tüpleri için orta ve düşük konsantrasyonlarda alvar yapmak için yüksek konsantrasyonu bir ila 10 ve bir ila 100 arasında daha fazla nokta% 85 sodyum klorür ile seyreltin. Her kontrol kuyusundan 40 mikrolitre ortam çıkarın ve oyuk başına mililitre başına 100 birimlik bir nihai konsantrasyona 50 mikrolitre heparin ekleyin.

Sadece CCL 23 hücrelerine 10 mikrolitre nokta,% 85 sodyum klorür ekleyin ve CCL 23 hücreleri artı sadece pnömokoklar tüm SIV alanları konsantrasyonlarını tamamen girdap haline getirir. Daha sonra, hücre ile bakteri temasını teşvik etmek için uygun kuyucuklara 10 mikrolitre seyreltilmemiş, bir ila 10 ve bir ila 100 siv çeşitli konsantrasyonlar ekleyin. Tek tabakalı, plakayı oda sıcaklığında 114 Gs'de üç dakika santrifüjleyin ve daha sonra hücreler inkübe edilirken plakayı bir saat inkübe edin, seri olarak tükürük stoğunu %85 sodyum klorür noktasında seyreltin ve steril bir yayıcı kullanarak 10 ila eksi beş, 10 ila eksi altı ve 10 ila eksi yedi seyreltmeyi at kanı agar plakaları üzerinde çift olarak dağıtın.

Plakaları, kurtarıcı inkübasyonu olarak tek katmanın sonuna doğru gece boyunca ters çevrilmiş bir konumda kültürleyin. Pnömokok kültürünün optik yoğunluğunu ölçün ve ardından hücrelerin bir mililitresini aşağı doğru döndürün. Resus, OD okumasına bağlı olarak peleti 300 ila 2000 mikrolitre nokta %85 sodyum klorür içinde mililitre başına yaklaşık 150 milyon koloni oluşturan birimlik bir nihai konsantrasyona kadar askıya alır.

Daha sonra, negatif kontrol kuyuları dışındaki tüm kuyucuklara 10 mikrolitre seyreltilmemiş pnömokok ekleyin, 24 oyuklu plakayı tekrar santrifüjleyin ve ardından inkübasyon aşaması sırasında kokültürleri üç saat inkübe edin. Pnömokok stoğunu tükürüklere benzer şekilde seri olarak seyreltin ve plakalayın. Üç saatlik inkübasyondan sonra, herhangi bir sitopatik etki için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin.

Şimdi ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve tek tabakaları rahatsız etmemeye dikkat ederek, yapışmayan bakterileri uzaklaştırmak için kokültürleri bir XPBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre% 0.1 Dig toin ile 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yedi dakika boyunca lyant. Ardından, her birine 800 mikrolitre THB ekleyin.

Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve her bir kuyucuktan hücre süspansiyonlarını etiketli mikro santrifüj tüplerine toplayın. Son olarak, yapışan pnömokokları seri olarak seyreltin ve ardından ertesi gün kolonileri uygun seyreltme plakalarında sayın. Bu tablodaki pnömokokları ve alvarı ölçmek için, pnömokokların slovar ilavesinden bir saat sonra CCL 23 hücrelerine eklendiği temsili bir deneyin sonuçları gösterilmiştir.

Pnömokok uyumu hem canlı sayım hem de lit. A-Q-P-C-R sonuçları, hem mutlak bakteri sayısı hem de yapışma yüzdesi için iki yöntem arasında tutarlıydı. Sadece pnömokok içeren kuyucuklardaki yapışkan pnömokok sayısına normalize edilmiştir.

Heparin, pnömokok aderansını inhibe ettiği bilindiği için bir kontrol olarak kullanılır. Bu nedenle, pnömokok artı heparin örneklerinde aderansın tek başına pnömokok ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 40 veya daha fazla azalması, başarılı bir testin göstergesidir. Tükürük doza bağlı bir şekilde pnömokok yapışmasını inhibe ettiğinden, bir pnömokoka yaklaşık 10 tükürük konsantrasyonunun yüksek konsantrasyonu en düşük pnömokok uyumu ile sonuçlanmıştır.

Bu greftler, tükürük eklendiğinde, pnömokoktan bir saat önce eş zamanlı olarak veya pnömokoktan bir saat sonra pnömokokların CCL 23 hücrelerine yapıştığını gösterir. Alvar, pnömokoktan önce eklendiğinde pnömokok yapışmasını inhibe etmede daha etkilidir, çünkü hem yüksek hem de orta dozlarda Alvar, baskı öncesi testte pnömokok aderansını önemli ölçüde azaltmıştır. Coit baskısı ve sonrası baskı, sadece yüksek dozlarda Slovar'ı test ederken, pnömokok aderansını inhibe etti.

Bu nedenle, bu videoyu izledikten sonra, probiyotik streptokok hücre alanları tarafından pnömokok yapışmasının inhibisyonunu ölçmek için bir in vitro testin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.