Name: Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon Parhyale hawaiensis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin Parhyale hawaiensis embriyolarından tek blastomer ablasyon tekniğini. Bu yöntem, krustase embriyolojisi ve evrimsel gelişim araştırmalarında germ hücresi öncüllerinin kaldırılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, kamera çalışması için Tripti Gupta ve Frederike Alwes hücre ablasyon tekniği rafine yardım için, ve veri, video ve yazının geri bildirim için Extavour laboratuvar üyeleri Reyhan Arif ve Hassaan Shahawy teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Harvard Kök Hücre Enstitüsü tarafından desteklenmiştir (Tohum Hibe numarası SG-0057-10-00) Ellison Tıp Vakfı (New Scholar Ödülü numarası AG-NS-07010-10) JFMO için, ve Harvard Üniversitesi Araştırma Programı ödül için ARN.

Bazı adımları yürütülmesi faydalı olabilir görmediniz italik olarak gösterilmiştir. 1.. Gün 1: Malzemelerinin Hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki malzemeleri (Malzeme ve Ekipmanları bkz. Tablo) hazırlayın: <ul><li> 15 cm ve 22 cm Pasteur pipetler </li><li> Elmas kâtip </li><li> Süzülen yapay deniz suyu 1 mg / ml Amfoterisin B (100 mg / ml stok çözeltisi 1:100), 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (stok çözeltisi ihtiva eden 01:50 (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) penisilin 5000 ünite / ml streptomisin ve 5.000 mg / ml ihtiva eden) </li><li> katkı maddesi olmadan filtrelenmiş yapay deniz suyu (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) </li><li> Konut çiftler için büyük bir plastik kap (en az 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> Sylgard ile kaplı küçük (3 cm veya 5 cm) petri </li><li> küçük (3 cm veya 5 cm) Petri kapları </li><li> bir gözlem ya da cam, çok oyuklu plaka </li><li> forseps (Kullandığımız künt forseps sağa sola türetilmişbiz yanlışlıkla forseps uçları iki çatal dişleri aynı uzunlukta olduğunu, pürüzsüz olmasını sağlamak için bileme taşı bir forseps kullanarak, ve artık sahip olduğu ile değiştirdikleri diğer laboratuvar prosedürleri, hasar gören m eski Dumont # 5 forseps kindir. Böyle yeni Dumont # 5 forseps gibi son derece ince forseps, bunlar embriyo ve / veya dişileri yaralayabilir olarak istenmemektedir.) </li><li> Sonunda bir Pasteur pipet (aşağıya adım 1.2) genişledi </li><li> Pasteur pipet ince ucu içine gömülü ince, kavisli tungsten telinin oluşan bir embriyo alma aracı (uygulamak alternatif yerini olabilir; aşağıya 1.3 bakınız) </li><li> küçük bir açıklığı olan bir ağız pipet (aşağıya adım 1.4) </li><li> Bir cam kapiller çekti yapılmış bir cam iğne (aşağıya adım 1.5 &#39;e bakınız) </li></ul> Insanlar için toksik malzemeler yoktur bu protokol kullanılır. Risk yönetimi Guidel gereği Ancak, araştırmacılar eldiven veya diğer koruyucu kıyafetleri giymek emin olmalıdırkurumlarının ines. </li><li> Daha sonra genişletilmiş Pasteur pipet, pipet, bir elmas çizici ile dar parmaklarını korumak için bir Kimwipe&#39;dan veya kağıt havlu pipet attı bölgeyi sarmak başlar noktada 15 cm Pasteur pipeti etrafında ilk puanını ve dikkatle yapmak için skor çizgisinde ucunu kırın. Kenarlarını düzeltmek için birkaç saniye için bir Bunsen beki alev üzerinde pipet kırık ucunu tutun. Açılış pipet maksimum genişliğinden az daha dar olmalıdır. </li><li> Tungsten tel kesme aletini yapmak için, 15 cm cam Pasteur pipet ucunu bir tungsten teli ve cam eritmek için bir Bunsen beki alev üzerinde kısa bir süre tutun, yerinde tel sabitleme. Bir çengel şekil için hafifçe eğri telin ucu forseps kullanın. Bu araç için uygun bir şekle sahip bir örnek için Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Ağız pipet için küçük bir açılış yapmak için, iki parça ov içine 22 cm Pasteur pipet ince ucunu çekinbir alev, ve küçük sonu ucu koparak er. Ağız pipet tutucu ucuna yerleştirin. </li><li> Bir iğne çektirmenin kullanılarak ablasyon prosedürü sırasında, ilgi konusu blastomerlerdir delmek için kullanılacak olan cam iğne yapın. Uygun bir biçimde şekillendirilmiş bir iğne, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Bu iğne 2x parametreleri ile bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20 = 250, zaman) + 1X (ısı = 566, çekin = 100, hız = 100, zaman = 250). Ama aynı zamanda embriyo koryon karşı itilir kırmaya yeterli sağlam olması, iğne yapmak için kullanılan belirli bir program ve alet değişebilir, ancak ince bir iğne noktası olması gerekir. </li></ol> 2. 1. Gün: Gathering Parhyale Çiftleşme Çiftler <ol><li> P. çiftleşme toplamak için genişletilmiş Pasteur pipet (adım 1.2 yukarıda) kullanın hawaiensis büyük kültür kabından çiftler ve ayrı bir kap içeren bir c aktarmakYapay deniz suyu eğiliyorum. Bu tuzlu su filtre edilmesi gerekli değildir. Bu, daha sonra öğleden sonra eşleşme çiftleri toplamak ve ertesi sabah, en son döllenmiş embriyolar ve biriken ve dolayısıyla erken bölünme edilmiş, böylece, (20-23 ° C) bir karışımı, oda sıcaklığında gece çiftler bırakmak için en iyi uygun aşamaları ablasyon. Bazı kadın ertesi sabah erken bölünme aşamasında embriyo taşıyan olmasını sağlamak için en az 20 çiftleşme çiftleri toplamak. </li></ol> 3. 2. Gün: Gathering Parhyale Embriyolar <ul><li> Ertesi sabah, CO 2 ile süzülmüş yapay deniz suyu (FASW) demlenmeye. Kadınlarda Bazı gece boyunca kendi erkeklerden ücretsiz swum olacak, bunlar ayrılmış kadın toplamak ve FASW / CO 2 onları uyutmak. Kalan eşleştirilmemiş erkek çiftleşme çifti kaptan çıkarıldı ve büyük kültüre geri döndürülebilir. Kalan çiftleşme çiftleri daha sonra embriyo toplanması için kaydedilebilirgün veya ertesi gün. </li><li> FASW / CO 2 saat camı embriyo taşıyan tek Aneztezi kadın aktarın. Tüm ayrılan kadın büyük olasılıkla kadın şeffaf coxal plakaları (Şekil 1A) ile soluk pembe ya da mor küremsilerden gibi gözle görülebilir olacak, yumurta yatırılır olacak. Embriyoların erken bölünme aşamalarında ve blastomer ablasyon için bu nedenle uygun olup olmadığını belirlemek için, araştırmacı kuluçka torbadan embriyolar kaldırmak ve bir mikroskop altında incelemek gerekir. </li><li> Bir mikroskop altında prosedürü görüntülerken, forseps ile vücudun bir tarafında coxal plakaları kavramak. Embriyolar bu coxal plakaları (Şekil 1B) arasındaki ventral yavru kese görünür olacak. </li><li> Damızlık kese arka ucunu, yavaşça damızlık ayırmak için kuluçka kesesinin ön sonuna doğru kabloyu kaldırın, ince, kavisli tel aracı (yukarıdaki adım 1.3 Şekil 3) takınkese kaplamaları (bu 30 oostegites denilen ventral uzantıları modifiye), keseyi açıp embriyolar gevşeterek. Bu membran Yumurtlayarak sonra yaklaşık 2-3 saat kaybolur ve embriyolar bağlı değildir, tüm kolayca tel aracı tarafından bozulacak bir çok ince, şeffaf bir zar içine konur atılmaktadır ilk saat içinde embriyolar birbirleriyle ya da herhangi bir şekilde dişi embriyojenez boyunca bu noktadan itibaren. Araştırmacılar bu rahatsız edici ya da zor damızlık torbadan embriyolar kaldırmak için kavisli tel aracı manevra bulursanız, alternatif bir sürece hareketler yumuşak ve hiçbir sert basınç embriyolar veya damızlık kese uygulanır olarak kullanılabilir uygulamak. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır. </li><li> T dışarı iterek, açılan yavru kese ile su temizlemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanıno saat camın altına yerleşmek gerektiğini, hangi embriyoların. Ana kültürün onu reintroducing önce kurtarma izin (CO 2 olmadan) FASW temizlemek için kadın aktarın. Birden fazla kadın aynı kurtarma çanak içine yerleştirilmiş, ancak onlar hala kısmen anestezi eğer diğer hayvanlar tarafından yemiş olabilir gibi kadın, ana kültürüne onları dönmeden önce tamamen kurtarmak için izin olabilir. </li><li> Temiz FASW ile bir Petri kabı embriyo transferi, ve embriyonik evresini belirlemek için mikroskop altında görüntülemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanın. Bu işlem için uygun olan üçüncü bir bölünme (aşama 4 5), en vardır ayrı embriyolar. Ayrıca önceki germ disk oluşumuna herhangi bir bölünme aşamasına bu protokolü uygulamak mümkün olmalıdır (07-08 Mayıs aşamaları). </li></ul> 4. 2. Gün: Kesip Tek Hücreler <ol><li> FASW sığ bir tabaka ile Sylgard kaplı Petri çanak doldurun. Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pi kullanınpette plakasına tek bir embriyo transfer etmek. </li><li> Künt forseps kullanılarak, hafifçe ablasyon edilecek olan hücre (Şekil 2A ve 2B) tanımlamak için embriyo döndürün. Germ hattı ön g küçük macromere Mav üstüne oturur micromere küçük olarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, doğrudan g mezoderm ön micromeres ml mr payı olarak embriyonun ortasında bir sınır hücre. Mr g sağındaki blastomere olup, bunun üzerine doğrudan karşısında micromere olan en hücreyi temas ve etmez mi g solundaki micromere olduğunu. Mr, ml, ve EN kardeş macromeres ektoderm öncüleri sırasıyla Er, El ve Ep vardır. </li><li> LEF forseps ilearaştırmacı sağ elini ise t el (veya sağ elinde araştırmacı sol elini ise), sağa ilgi hücre ile embriyo şark (veya sola araştırmacı sol elini ise), ve yavaşça stabilize forseps arasında embriyo kavramak. </li><li> Çekilmiş bir cam iğne (yukarıdaki adım 1.5, Şekil 4) kullanılarak, yumuşak, ilgi konusu bir hücreyi delinme. Komşu hücrelere veya ilgi hücrenin altında iğne itin şekilde değil, çok uzak iğne takmayın. İğne sadece koryon ve temel hücre zarı delinme vardır ve ablasyon üzere hücre içine derin uzatmak gerekmez. </li><li> Alışverişi para cezası ile bir ağız pipet cam sonu için embriyo delmek için kullanılan iğne Pasteur pipet (yukarıdaki adım 1.4) çekti. Ilgi hücrede oluşturulan deliğe yakın pipet ucu tutun ve çok hafif bir emme uygulanır. </li><li> Çok hafifçe forseps ile embriyo sıkmak. Blasto içeriği itibariylesadece, adım 4.4 oluşturulan delikten koryon dışına itti embriyo engelsiz bir görünüm sağlamak için ağız pipet içine emmek. Delik yeterince büyükse, delinmiş bir hücrenin çekirdeğinde de ortaya görülebilir. Bu tüm hücre içeriğini kaldırıldı ve rejenere olamaz emin olmak için iyi bir kontroldür. </li><li> Ilgi blastomere kaldırılır dikkatle embriyo gözlemlemek. Delinmiş hücrenin sınır görünür yatan hücrelerinin kavşak yapım, koryon delikten doğru kayacaktır. Ilgilenilen blastomer tüm kaldırıldı kadar basınç uygulamaya devam edilir. Yan yana gelen embriyo rulo forseps kullanın ve görsel ilgi blastomer hepsi gitti olduğunu onaylayın. </li><li> Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pipeti kullanılarak, (FASW + 1 mg / ml amfoterisin B, 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin) FASW + temizlemek için embriyo transferi. </li><li> Bireysel kuyularda blastomere-ablasyon embriyolar kaldırınFASW + temiz bir 48-çukurlu plaka içinde, günlük antibiyotik takviye FASW +% 50 değiştirilmesi. Elimizde embriyo hayatta ve 18-28 ° C arasında bir sıcaklık aralığında, daha iyi takip ablasyonu geliştirmek Araştırmacılar minimal rahatsızlık ile embriyolar yükseltmek için bir temiz (ama mutlaka steril değil) bir yüzeye sahip olduğu için bir sıcaklıkta kendi embriyolar yükseltmek gerekir. Kontrolleri ile blastomer ablasyon embriyoların gelişimsel olayların zamanlamasını karşılaştırma yapabilmek için, 18 º C 4, 25 º C 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir detaylı gelişimsel hazırlama bilgilere okuyucu bakın, ve 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
<li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz manuel ablasyon ve amphipod P. erken bölünme aşamalarında tek blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması için bir protokol açıklar hawaiensis. Biz bir sekiz-hücreli aşamada embriyo tek germ hattı öncü hücre g kaldırarak bu protokolün kullanımını göstermek ve ablasyon sonra embriyojenezinde g &#39;nin kızı hücrelerin yokluğunu teyit başarılı olduğunu gösteriyor. Bu protokol, erken aşamalarında bölünme embriyo micromeres herhangi kaldırmak için kullanılabilir. Birinci v...

Amphipod kabuklu Parhyale hawaiensis evrimsel gelişim biyolojisi araştırmalarında 1 kullanım için büyük potansiyeli olan bir gelecek vaat eden bir model organizma olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Meyve. D. Drosophila melanogaster uçuyordu eklembacaklılar arasında, çoğu modeli sistemleri böceklerdir ve en yaygın olarak bu okudu melanogaster böcek Diptera takımının bir üyesi olan ve bazal biçimde dallanma böceklerin 2 kişilerce ilgili olarak elde edilen bu tür görüntüler çok embriyolojik özellikler gibi. Ayrıca, böcekler böcekler pancrustaceans denilen uzun ayakta &quot;doğal&quot; grup içinde kendi yakın akrabaları var, yani Subphylum Pancrustacea 3 iç içe olan, ve bu grup paraphyletic olduğunu vardır. Bu ek dorsalde böcek modelleri dallanma önerir, diğer kabuklular çalışmalar gelişimsel özelliklerin evrimsel tarihinin daha geniş bir görünüm kazanmak için gerekli olan birçok iyi D. çalışılmıştır nd moleküler mekanizmalar melanogaster. Ancak, çok az kabuklular iyi gelişme deneysel laboratuar analizi için kurulmuştur. Amphipod P. hawaiensis deneysel teknikler bir dizi için uygun son derece uysal bir laboratuar model sistemidir. Amphipods kendi ana superorder Peracarida (plaj siloları, scuds, ve de karides) içinde birçok benzersiz özellikleri görüntülemek ve bu nedenle nispeten kabuklular bu grup içinde türetilmiş olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, Parhyale tarafından sunulan embriyolojik ve fonksiyonel genetik manipülasyon göreli kolaylığı bu amphipod model organizmaların mevcut envanter için değerli bir katkı yapmak. Bir laboratuar hayvanına, P. de hawaiensis bir çok avantaj sunar. Hayvanlar sıcaklık ve tuzluluk geniş bir yelpazede karşı toleranslı olan ve yapay deniz suyu 1 büyük kültürlerinde iyi hayatta. Bu betw ayırt etmek kolaydırbelirgin morfolojik farklar, çiftleşme sırasında dişi kavramak için kullanabileceğiniz Erkeklerde en önemlisi, büyük, çengel, ön gövde uzantıları dayalı een kadın ve erkekler. Embriyolojik ve gelişimsel çalışmaları için, P. hawaiensis birkaç çok çekici özelliklere sahiptir. Embryogenezis yaklaşık 10 gün sürer ve cinsel olgunluk zamanı 28 º C&#39;de yaklaşık altı hafta (ama Parhyale yaklaşık 20-30 º C arasında değişen sıcaklıklarda iyi hayatta unutmayın, ve bu ayrıntılı gelişimsel evreleme bilgisi 18 º C&#39;de 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir , 25 º C 4, ve 26 º C 5,6). Yetişkin laboratuvarda tüm yıl boyunca dostum, yani embriyolar yılın herhangi bir zamanında kullanılabilir. Dişiler ilk birkaç bacak çifti (Şekil 1A ve 1B) arasında yer alan bir ventral kuluçka kese içine döllenmiş yumurta (dişi yaşına bağlı olarak) 2-20 koymak ve bu embriyo toplamak mümkündürkadın öldürme veya embriyolar (Şekil 1C) zarar vermeden çok erken gelişme var. Embriyolar, tarama için süzülür yapay deniz suyu içinde hayatta sonraki gen ifadesi ya da histolojik analiz 7 için sabitlenebilir, ve detaylı bir hazırlama tablo geliştirilmesi 5 boyunca ilerleme doğru belirlenmesini sağlar. Sağlam protokolleri ya da in situ hibridizasyon 8-15 4,16,17 immün olarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır, ya da RNA girişim 13,15 morpholinos 12 ve sabit bir germ hattı ile fonksiyonel portatif 18, genetik dönüştürme. Transgenesis sistemi, uyarılabilir ifade 14 ve 19 yöntemleri de P. gen araştırmak üzere de kullanılabilir güçlendirici tuzağı kullanılarak hawaiensis. Kamuya açık bir genom dizisi şu anda mevcut değil ise, oogenezisin ve embriyogenez sırasında üretilen transkript içeren bir transcriptome arı vardırn de novo monte edilmiş ve 20 açıklamalı ve gen keşif kolaylaştıran, aranabilir bir veritabanında 21 yatırılır. Sonuç olarak, P. hawaiensis gelişimini anlamak için birden fazla deneysel ve genetik yaklaşımlar için uygun son derece uysal bir model organizmadır. D. erken sinsityal bölünmeler aksine melanogaster, P. hawaiensis embriyolar holoblastically fertilizasyon (Şekil 2A), aşağıdaki bölmektedir. Köken izleme analizleri üçüncü bölünme ile, üçüncü bölme blastomerlerin her biri özel olarak üç germ tabakaların bir ya da germ hattı 6 (Şekil 2B) meydana getirmek için mahkum olduğunu göstermiştir. Bu veriler, birlikte mikroarray veri 22, hücre soy 6,23 analizleri ve blastomer izolasyon deneyleri 4 gelişimsel potansiyelleri cel asimetrik miras yoluyla en azından bazı üçüncü bölünme blastomerlere için ayrılmış olduğunu ileri sürmüşlerdirl kader belirleyici. Hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi duruma göre, (Parhyale hücre soyu terminoloji 6&#39;daki &quot;g&quot; olarak adlandırılır) germ hattı ön sekiz hücre aşamasında uzaklaştırılmış olan blastomere ablasyon deneylerde, embriyolar, geç gelişim evrelerinde 4 ° germ hücreleri yoksun En metazoans 24 bir germ çizgi işareti olan protein Vasa, ifade. Bunun aksine, somatik blastomere ablasyon deneyler göstermiştir ki P. hawaiensis embriyolar da önemli düzenleyici yetenekleri, sahip sekiz hücreli aşamada ablazeydi mezoderm veya ektoderm öncü blastomer kaderi kalan blastomerlerin 25 bazı torunları tarafından ele olabilir böyle. Nasıl düzenleyici hücre kaderinin yedek oluşabilir, ve somatik blastomerlere otonom hücre kaderi benimsenmesi ölçüde bilinmemektedir. Örneğin blastomere ablasyonu gibi deneysel embriyolojik teknikler Understan yararlı olabilirding göreli özerklik ve hücre kaderini belirleyen 26,27 arasında nonautonomy ve P. çalışmada ilgi bu nedenle hawaiensis embriyogenez. Ektodermal ve mezodermal soy düzenleyici değiştirilmesini gösterdi deneylerde, blastomer ablasyon enjeksiyon 28 ve fototoksik boyaların 25 sonraki uyarılması ile yapıldı. Bu teknik enjekte blastomer (ler) öldürmede etkili olsa da, tamamen embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Buna ek olarak, farklılıklar hücre soyu floresan soy izleyiciler 28,29 ile blastomerlerdir enjekte ederek embriyojenezin Gastrulasyon aşamalarında aracılığıyla toplanan verilerin, ve aynı embriyonik aşamalarında 23 geliştirilmesi yoluyla soğukkanlı blastomerlerdir izleyerek toplanan veriler arasında gözlenmiştir. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Daha önce hücre soyunun sonuçlarını yayınladı tek hücreler elle 23 ablazeydi hangi embriyoların analizleri. Ancak, erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerdir çıkarmak için gerekli olan hassas işlemleri henüz tam olarak tarif edilmemiştir. Burada P. toplanması için bir protokol mevcut hawaiensis embriyolar ve sekiz hücreli evre embriyo tek blastomer manuel ablasyon. Bu yöntemin amacı, hücresel davranışları ve embriyogenez ve post-embriyonik gelişimi sırasında, kalan hücrelerin hücre hayati yeterliliklerinin gözlem sağlayan, embriyo, hücre gövdesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Bizim protokol germ hattı ön g (Şekil 2C) çıkarılmasını gösterir, ancak veya daha bölünme aşamaları blastomerlerin için, sekiz-hücre aşamasında herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prensip olarak, bu protokol tasarımlarıyla erken bölünme evresindeki embriyolar, tek hücreleri çıkarmak için uygulanabilirr holoblastically deniz omurgasız bölünmesi.

<table><tbody><tr><td>15 cm Pastör pipeti</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Sağlam ve blastomer ablasyonlu embriyoları tabaktan tabağa aktarmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>22 cm Pastör</td><td>pipeti Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Ağız pipet uçları yapmak için.</td></tr><tr><td>3 cm Petri kapları</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Embriyoları toplamak ve saklamak için bazılarını değiştirilmemiş olarak kullanın; blastomer ablasyonları için bir çalışma yüzeyi oluşturmak için bazılarını bir Sylgard tabakası ile kaplayın (aşağıya bakınız).</td></tr><tr><td>48 oyuklu Plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Ablasyonu takiben embriyoları kültürlemek için.</td></tr><tr><td>Şişe üstü filtreler 0.2 ve mikro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>FASW oluşturmak için (Aşağıya bakınız).</td></tr><tr><td>Bunsen brülör</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Tungsten tel aleti ve ince ağız pipeti ucu oluşturmak için.</td></tr><tr><td>Elmas yazıcı</td><td>Musco Spor Aydınlatma</td><td>52865-005 VWR</td><td>Çiftleri toplamak için geniş ağızlı Pasteur pipetleri oluşturmak için.</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11050-10 Güzel Bilim Araçları</td><td>Embriyoların kuluçka kesesinden çıkarılması sırasında anestezi uygulanmış dişileri tutmak için. Bunların ince uçlu Dumont forsepsleri olması gerekmez - uçlar en az katalog numarasının burada listelendiği forsepslerinki kadar kör olabilir.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amfoterisin B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>FASW'ye 1 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve bu çözeltiyi blastomer ablasyonlu embriyoları kültürlemek için kullanın.</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar 4 inç uzunluğunda, 1/0.58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Ablasyon yapılacak blastomeri delmek için iğneler yapmak için.</td></tr><tr><td>Cam saat camı 300 mm çap</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70543-30 Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Anestezi uygulanmış dişilerin kuluçka kesesinden embriyoların çıkarılmasında kullanım içindir.</td></tr><tr><td>Instant Ocean Yapay Deniz Suyu (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>, tuzu deiyonize suda 1.022-1.024 tuzluluğa kadar çözerek ASW yapar.</td></tr><tr><td>Anında Okyanus Filtreli Yapay Deniz Suyu (FASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>0.2 ve mikro kullanır; ASW'yi sterilize etmek için m filtreleri. Gerektiği kadar küçük miktarlarda (< 250 ml) hazırlayın.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Çiftleri toplamak için modifiye edilmiş Pasteur pipetlerinin ince ucunu güvenli bir şekilde koparmak için.</td></tr><tr><td>Ağız pipeti adaptörü</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Ablasyon prosedürü sırasında ekstrüde hücre içeriğini çıkarmak için kullanılmak üzere ince çekilmiş Pasteur pipet ucunu bu uca yerleştirin.</td></tr><tr><td>Ağız pipeti hortumu</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich Bunu</td><td>, ablasyon prosedürü sırasında boynunuza rahatça asacak kadar uzun olacak şekilde kesin.</td></tr><tr><td>İğne Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td>P97 Sutter Enstrüman Şirketi Ablasyon</td> yapılacak <td>blastomeri delmek için cam kılcal damarlardan iğneler yapmak için.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>FASW'ye 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin nihai konsantrasyonuna ekleyin ve bu çözeltiyi blastomer ablasyonlu embriyoları kültürlemek için kullanın.</td></tr><tr><td>Kauçuk ampul Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>100488-418 VWR</td><td>Embriyoları tabaktan tabağa aktarmak için Pasteur pipetlerini kullanmak için.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>KR Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>Make, üreticinin talimatlarına göre. Blastomer ablasyonları için bir çalışma yüzeyi oluşturmak için 3 cm'lik bir petri kabına 2-5 mm kalınlığında bir tabaka dökün.</td></tr><tr><td>Tungsten tel 0.004 inç çapında</td><td>A-M Sistemleri</td><td>719000 A-M Sistemleri</td><td>Anestezi uygulanmış dişilerin kuluçka kesesinden embriyoları çıkarmak için bir araç yapmak için bunu kullanın.</td></tr></tbody></table>

amphipod crustacean sekiz hücreli embriyolardan tek hücre ablasyon<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Amphipod Parhyale hawaiensis dünya çapında tertidal deniz habitatlarda bulunan küçük kabuklu olduğunu. Geçtiğimiz on yıl içinde, Parhyale iyi okudu eklembacaklı model organizma Drosophila melanogaster yararlı bir dışgrup karşılaştırma sağlayarak, geliştirme laboratuar çalışmaları için umut verici bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila sinsityal bölünmeler aksine, Parhyale erken yarılmış holoblastic bulunmaktadır. Erken blastomerlerin enjekte tracer boyalar kullanılarak kader eşleme her üç germ tabakaları ve germ hattı sekiz-hücre aşamasına göre kurulan göstermiştir. Bu aşamada, üç blastomerler ektoderm doğuran mahkum olan, üç mezoderm doğuran mahkum ve geri kalan iki blastomerler sırasıyla endoderm ve mikrop hattının ön vardır. Ancak, blastomer ablasyon deneyler Parhyale embriyoları da önemli düzenleyici capabiliti sahip olduğunu göstermiştirsekiz hücreli aşamada ablasyon Blastomerlerin kaderi kalan blastomerlerin bazı soyundan tarafından satın alınabilir es, öyle ki. Enjeksiyon ve fototoksik boyalar ya da manuel ablasyon sonraki aktivasyonu: Blastomer ablasyon daha önceleri, iki yöntemden biri ile tarif edilmiştir. Ancak, photoablation blastomerlerdir öldürür ama embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Burada canlı ve sağlam kalan blastomerlerdir tutarken hücre gövdesinin tamamen çıkarılması için gerekli olan araçları ve manuel işlemleri gösteren, Parhyale embriyoların sekiz-hücre evresinden itibaren bir blastomerlerin elle çıkarılması için bir protokol mevcut. Bu protokol, sekiz hücre evresinde veya diğer yarılma erken aşamalarında blastomerlerin için bir Parhyale hücreye uygulanabilir. Buna ek olarak, prensip olarak, bu protokol erken Clea için geçerli olabilirDiğer holoblastically yaran Omurgasız deniz vage sahne embriyolar.

Bir üçüncü bölge P. başarı ablasyon sonra Bu protokol daha önce tarif edildiği gibi, kısmen kesilip alınmış blastomer tarafından işgal edilen alanı işgal edecek şekilde hawaiensis micromeres, kalan micromeres yavaş yavaş hafif konumlarını kayması. G kaldırıldığında Örneğin, blastomerler MR komşu ve biraz vardiya ve g ile doğrudan temas (Şekil 2A ve 2C karşılaştırın) eskiden olduğu yanal hücre sınırlarını paylaşmak için...

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Bu gösterim, pod içindeki erken embriyolardan germ hattı öncül hücresinin çıkarılması tekniğini göstermektedir. Krustasean parli sys parli, evrimsel ve gelişimsel araştırmalarda kullanım için geniş potansiyele sahip, gelişmekte olan bir model organizmadır. Çoğu model eklem bacaklı böceklerdir ve bunlar arasında en kapsamlı şekilde çalışılanı meyve sineği Glip Melanogaster'dir; böcekler, panc cresta alt filumu içinde yer alır ve böcekler dışındaki diğer krustaseanların incelenmesi, drosophila'da iyi çalışılmış olan gelişimsel özelliklerin ve moleküler mekanizmaların evrimsel tarihine dair daha geniş bir bakış açısı sağlar.Buna rağmen, gelişimin deneysel laboratuvar analizleri için çok az kabuklu canlı türü tam olarak tanımlanmıştır. Parelli, laboratuvar ortamında çalışılması oldukça kolay bir model sistemdir ve bu nedenle model organizma envanteri için değerli bir katkı sunmaktadır. Bir laboratuvar hayvanı olarak Parelli'nin bakımı ve onunla çalışmak oldukça kolaydır.Yapay deniz suyu içeren büyük kültürlerde rahatça yaşayabilir ve belirgin morfolojik farklar sayesinde erkekler ve dişiler kolayca ayırt edilebilir. En dikkat çekici özellik, erkeklerin çiftleşme sırasında dişileri tutmak için kullandıkları büyük, kancalı ön eklemli ayaklardır. Parelli, gelişimsel çalışmalar için oldukça cazip özelliklere sahiptir; çiftler yıl boyunca çiftleştiği için embriyolar herhangi bir zamanda toplanabilir.Dişiler embriyoları, ilk birkaç çift bacağın arasında bulunan kuluçka kesesine bırakırlar ve embriyolar, dişiyi öldürmeden veya embriyolara zarar vermeden gelişimlerinin çok erken aşamalarında toplanabilir. Embriyolar, çıkış aşamasına kadar filtrelenmiş yapay deniz suyunda yaşatılabilirler ve gelişimin ilerleyişinin doğru şekilde tanımlanmasını sağlayan ayrıntılı bir evreleme tablosu mevcuttur. Burada, sekiz hücreli gelişim evresiyle birlikte, çıkışa kadar olan paral gelişim evrelerinden bir seçki gösterilmektedir.Paral embriyosundaki hücrelerin her biri, üç germ tabakasından birine veya primordiyal germ hücrelerine özgü olarak farklılaşır. Bu gösterimde, özellikle germ hücresi popülasyonunun spesifikasyonu ilgi odağıdır. Germ hattını temsil eden G hücre isminin, parli soy hattı izleme deneylerinde tek germ hattı öncüsü olduğu bilinmektedir; bu deneyler, G'nin soyundan gelenlerin tüm germ hücrelerini oluşturduğunu ve hiçbir soyun diğer germ tabakalarının bir parçası olmadığını göstermektedir.Ayrıca, diğer hücrelere zarar vermeden G'nin embriyodan çıkarıldığı deneyler gerçekleştirilmiştir. Bu deneylerde, G'nin çıkarıldığı embriyoların, metazoalar genelindeki model organizmalarda bir germ hattı belirteci olan vasa proteinini eksprese eden hücrelerin yokluğuyla belirtildiği üzere, embriyogenezin geri kalanı boyunca germ hücrelerinden yoksun olduğu görülmüştür. Şimdi, parli embriyolarının nasıl toplanacağını ve sekiz hücreli bir embriyodan G'nin manuel olarak nasıl ablate edileceğini göstereceğiz.Bu video G hücresinin çıkarılmasını göstermektedir, ancak sekiz hücreli evredeki herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prosedürün bu kısmı için, ucu genişletilmiş bir pastör pipeti, değiştirilmemiş ikinci bir pastör pipeti, filtrelenmiş yapay deniz suyu, çiftlerin konulacağı büyük bir kap, küçük Petri kapları, cam kuyucuklu plaka, forseps ve ucunda ince kavisli bir tel bulunan bir pastör pipeti şeklinde bir diseksiyon aracı gereklidir. Bu gösterimde eldiven kullanılmamıştır, ancak kurumunuzdaki risk yönetimine uygun olarak koruyucu ekipman eklemeyi unutmayın. Genişletilmiş pastör pipetini hazırlamak için önce pipeti elmas kalemle çevre boyunca çizin ve ardından ucunu dikkatlice kırın.Kenarları düzeltmek için birkaç saniye boyunca alev üzerinde tutun. Açıklık, pipetin maksimum genişliğinden biraz daha dar olmalıdır. Tel diseksiyon aracını yapmak için, bir cam pipetin ucuna bir tungsten tel yerleştirin ve camı eritmek için alev üzerinde tutun.Teli sabitlemek için, aletle en kolay manipülasyonu sağlamak amacıyla bir penset kullanarak telin ucunu nazikçe kıvırın. Kancalı ucun uzunluğu yarım santimetreden biraz fazla olmalıdır. Çiftleri genişletilmiş pastör pipeti kullanarak toplayın ve ayrı bir yapay deniz suyu kabına aktarın.Çiftleri gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Ertesi sabah, filtrelenmiş yapay deniz suyunu karbondioksit ile doyurun. Ayrılan dişileri toplayın ve bu su içerisinde anesteziye alın.Disseksiyon mikroskobu altında görüntüleme yaparak, tek bir dişiyi karbondioksit içeren filtreli yapay deniz suyuyla dolu bir cam kuyucuk plakasına aktarın, bir pens yardımıyla vücudun bir tarafındaki koksal plakaları tutun. Embriyolar kuluçka kesesinde görünür durumdadır. Tel disseksiyon aracını kuluçka kesesinin arka ucuna yerleştirin ve kuluçka kesesi örtüsünü ayırmak için teli nazikçe ön tarafa doğru kaldırarak keseyi açın ve embriyoları ortaya çıkarın.Açılmış kuluçka kesesinden su geçirmek için bir pastör pipeti kullanın. Embriyoları dışarı itin. Dişiyi, ana kültüre geri döndürmeden önce toparlanmasını sağlamak için karbondioksit içermeyen, filtrelenmiş yapay deniz suyuna aktarın.Embriyoları, filtrelenmiş yapay deniz suyu içeren bir Petri kabına aktarın ve evrelerini belirlemek için mikroskop altında inceleyin. Embriyoları dişiden çıkarmadan önce evrelerini belirlemek genellikle zor olduğundan, doğru evrede yeterli sayıda embriyoya sahip olmak için genellikle çok sayıda dişiden embriyo toplamanız gerekir. Sekiz hücreli embriyoları elde etmenin genellikle en kolay yolu, daha erken evrelerdeki embriyoları toplayıp doğru evreye gelene kadar beklemektir.Ablasyon prosedürü için halihazırda topladığımız embriyolara ek olarak; bir pastör pipeti, pens, filtrelenmiş yapay deniz suyu, tabanında agar tabakası bulunan bir Petri kabı, çekilmiş cam kılcal tüpten yapılmış bir iğne, ucu küçük bir ağız pipeti, temiz Petri kapları ve ağız pipetinin ucu için amfoterisin ile penisilinle streptomisin içeren filtrelenmiş yapay deniz suyuna ihtiyaç duyacağız. Bir alev üzerinde uzun uçlu bir pastör pipetini çekin ve küçük ucunu kırarak ağız pipetinin ucuna yerleştirin. Bu uç, prosedür için mükemmel boyuttadır.Ablasyon prosedürü sırasında G'yi delmek için kullanılacak cam iğne, ince uçlu olmalı ancak koriyona doğru itildiğinde kırılmayacak kadar dayanıklı olmalıdır. Burada, laboratuvarımızda kullanılan yaygın bir şekil gösterilmiştir. Ablasyon için öncelikle hangi hücrenin G olduğunu belirlemeliyiz; soldaki embriyoda G siyahla çerçevelenmiştir ve bir sonraki bölümde G'nin diğer mikro aynalardan nasıl ayırt edileceğini öğreneceğiz.Sağdaki embriyo, başarılı bir ablasyon sonucunda görmeniz gereken görünümü göstermektedir. Bu embriyoda, siyah daire ile belirtildiği üzere G ablate edilmiştir ve forseps kullanılarak sadece üç mikro mer kalmıştır. Hücreleri görüntülemek ve karşılaştırmak için embriyoyu nazikçe döndürün.G, en küçük makromer M'nin üzerinde yer alan en küçük mikromer olarak tanımlanabilir. Embriyo döndürülerek, en küçük makromer MAV olarak belirlenebilir. Ek olarak, G, karşısındaki mikromer olan EN hücresine temas etmez. Bu embriyo için hücrenin el ve er kısımları G ile EN arasında bir sınır paylaştığından, en küçük mikromerin solda yer aldığını ve karşısındaki mikromere temas etmediğini görebiliriz.Embriyoyu döndürerek, bu mikro aynanın en küçük makro ayna üzerinde olduğunu teyit edebiliriz. Artık embriyonun sol alt kısmında yer alan bu aynayı güvenle G olarak adlandırabilir ve ablasyon işlemine geçebiliriz. Özetle.Bu işlem için, çekilmiş cam iğne ile G'yi delerken embriyoyu pensle sabitleyeceğiz. Daha sonra pensle embriyoya hafif bir basınç uygulayarak G içeriğinin açtığımız delikten dışarı çıkmasını sağlayacağız. G tamamen boşaltıldığında bunu görebilmek için, G içeriği embriyodan çıktıktan sonra onu ağız pipetiyle uzaklaştıracağız.Şimdi bu işlemi detaylandıracak olursak, ipek koruma plakasını sığ bir filtrelenmiş yapay deniz suyu tabakasıyla doldurun. Sekiz hücreli bir embriyoyu, pastör pipeti ve pens yardımıyla plakaya aktarın. Sol elinizde, embriyoyu G kısmı sağa gelecek şekilde yönlendirin ve çekilmiş bir cam iğne kullanarak embriyoyu stabilize etmek için nazikçe kavrayın; G kısmını hafifçe delin, iğneyi G'nin altındaki makro aynaları itmemek için çok derine sokmayın. Sağ elinizdeki iğneyi, ucu çekilmiş bir pastör pipeti takılı ağız pipetiyle değiştirin.Pipetin ucunu G'deki deliğe yakın tutun ve çok hafif bir vakum uygulayın. G'nin içeriği koriyondan dışarı itilirken, embriyoyu pensle nazikçe sıkıştırın. Embriyonun engelsiz bir şekilde görünmesini sağlamak için onu ağız pipetine çekin.Embriyoyu dikkatle izleyin. G çıkarıldıkça, G'nin sınırı koriyondaki deliğe doğru çekilecek ve altta kalan hücrelerin kesişimi görünür hale gelecektir. G'nin tamamı çıkarılana kadar basınç uygulamaya devam edin ve embriyoyu döndürmek için penset kullanarak G'nin tamamen gittiğini görsel olarak doğrulayın.Bir pastör pipeti kullanarak embriyoyu, amfoterisin ve penisilin-streptomisin eklenmiş filtrelenmiş yapay deniz suyuna aktarın. Enfeksiyonu önlemek için embriyonun üzerindeki suyun yarısını her gün değiştirin. İşte ablasyon öncesi ve sonrası bir embriyo.G'nin daha önce bulunduğu yerde boş bir alan olduğunu görebilirsiniz. İşlem hassas bir şekilde gerçekleştirildiğinde ve embriyolara işlem sonrası iyi bakıldığında, büyük bir yüzdesi kuluçka dönemine kadar hayatta kalır. Laboratuvarımızda ortalama hayatta kalma oranı %50'nin biraz üzerindedir

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Bu video, erken embriyolardan C. elegans blastomerlerini izole etmek için bir yöntem sunar. Elde edilen hücreler, hücre kültürü veya ex vivo deneyler için uygundur.

C. elegans Blastomer Diseksiyonu: Yumurta Kabuğunu Çıkarmak ve Embriyonik Hücreleri Ayırmak İçin Bir Yöntem

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Bu protokol, farklı genetik geçmişlere sahip parabiyotik zebra balığı embriyolarının nasıl oluşturulacağına dair adım adım talimat sağlar. Zebra balığı embriyosunun benzersiz görüntüleme yetenekleriyle birleştirildiğinde, bu yöntem, ilgilenilen aday genler için hücre özerk ve hücre özerk olmayan işlevleri araştırmak için benzersiz derecede güçlü bir araç sağlar.

Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.

Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.

İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerler ve Yapıştırıcı Polistiren Boncuklar ile Mekansal Hücre Temas Desenleri In Vitro Reconstitution

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Zebra balığı blastoderm eksplantları, embriyonik hücrelerin erken embriyo içindeki endojen sinyal merkezlerinden izole edilmesiyle, nispeten naif hücre kümelerinin kolayca manipüle edilmesi ve kültürlü ex vivoüretilmesiyle üretilir. Bu makalede, gastrülasyon sırasında Nodal sinyali için rolleri sorgulayarak bu tür eksplantlar yapmak için talimatlar sağlar ve yardımcı programlarını gösterir.

Zebra Balığı Embriyolarından Naïve Blastoderm Explants Üretimi

Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.

Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları

Öğrenin Parhyale hawaiensis embriyolarından tek blastomer ablasyon tekniğini. Bu yöntem, krustase embriyolojisi ve evrimsel gelişim araştırmalarında germ hücresi öncüllerinin kaldırılmasını sağlar.

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon

Daha fazla video keşfet