Name: K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Öğrenin, canlı memeli hücrelerde EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi ile nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, membran biyofiziği araştırmalarında protein dinamiklerini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Han&#39;a bir Lundbeck Gençler Grubu Lideri Bursu ile desteklenmiştir. PWW Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe fon desteği kabul eder. Biz Ayrıca disk mikroskobu iplik erişim için Güney Danimarka Üniversitesi Danimarkalı Moleküler Biyogörüntüleme Merkezi&#39;ni teşekkür ederim.

KICS analiz için plazma membranında EGFP-etiketli proteinlerinin kazanılması Epifloresans mikroskop, bir TIRF kurulum veya ilgi membran görüntüler elde etmek için ayarlanmış bir dönen disk mikroskop üzerinde yapılabilir. Görüntü kareleri arasında Kamera piksel boyutu hem de zaman analiz için gereklidir. 4-30 Hz çerçeve hızında 100-1,200 kare görüntü dizileri analizi için kullanılabilir. Edinimi sırasında, görüntüleme süresince odak membran tutmak ve floresans düzgün bir şekilde dağılmış olduğu düz bir zarın bir kısmı üzerinde odaklanmak için önemlidir. Kabarcıklara hareketli membran bölgeleri ve hücre organellerini çıkıntılı sonra analiz sürecinde dışarı kırpılmış olabilir. Hücrenin herhangi bir kayma ya da hareket olmadığı, böylece zaman alıcı seçilmelidir. MATLAB için kICS kod komut almak için, Paul Wiseman başvurun (Paul.Wiseman @ McGill.ca). İlk kez kICS kod, açık MAT kullanılırLAB ve dosyayı tıklatın, sonra da set yol, alt klasörler ile ekleyebilir tıklayın ve kICS kod bulunduğu bilgisayarda klasörü bulmak. Ardından ok tıklayın kaydedin ve kapatın. Şimdi önümüzdeki puan açıklanan ürünlerin analizi ile devam ediyor. 1.. TIFF Stack olarak Görüntüleme Analiz Programı içine İlgi görüntü sırası alma Stack1.tif: adı ile dosyayı kaydedin. <ol><li> Membran hareketli hücre organelleri hariç ve membran bölgeleri çıkıntılı düz kısmında ilgi alanları (ROI) dikdörtgen bir bölge seçin. Yeterli istatistik iyi k 2 araziler için oluşturulan böylece ekin boyutu seçilir. </li><li> Bölgeyi kırpın ve uygun bir klasörde TIFF dosyası olarak kırpma kaydedin. Aynı film çeşitli bitkiler varsa, örneğin &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot; bir sayı artışı kullanın. </li><li> Yerel bitkileri içeren klasörü yerleştirinbilgisayarda değil, bir sunucu üzerinde, kICS analiz yaparken. </li></ol> 2.. Analizi gerçekleştirin One tarafından Analizi Yazılım One&#39;a Bitkileri alma <ol><li> Komut penceresi ve basın açık MATLAB ve tip &quot;icsgui&quot; ENTER. ICS GUI görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programı için yürütülebilir adıdır. </li><li> ICS GUI &quot;kICS&quot; sekmesine tıklayın. Analiz penceresinin bir ekran görüntüsü, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Klasör adı &quot;MATLAB kod&quot; ile klasörünü bulun ve dosya adı &quot;Scripts&quot; ile dosyaya ilerleyin ve çift tıklayarak bu açın. Alternatif olarak, dosyaya sağ tıklayın ve &quot;MATLAB ile açmak&quot; veya dosyaya gidin, MATLAB açık ve komut dosyasını açın seçin. Bu dosya Editör denir. </li><li> Editör kaydırma &quot;Load kICS veri setleri&quot;, daha sonra komut satırına kopyalamak veya tipi dosya adı ve klasör konumu başlar içindeimg = örneğin &quot;: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif C&quot; ile. Örneğin [1:500] - klasör konumu altında komut satırında analiz edilecek kare sayısını ayarlayın. Veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullan. Odak kayması sonraki kare varsa, bu analize dahil edilmelidir. </li><li> Editör tıklatın &quot;kurtarmak&quot; ve ardından &quot;hücre değerlendirmek&quot; tıklayın. Veri kümesi şimdi analiz yazılımı yüklenir. </li><li> GUI kICS Analizi penceresinde, analiz için ayarları girin: <ol><li> &quot;T-hücresi&quot; kutuları unclick. </li><li> Giriş zaman sayısı analiz edilecek kalmaktadır. Gecikme süresi (τ) sayısı difüzyon arsa üzerinde etkisi olacaktır ve difüzyon arsa doğrusal şekilde seçilmelidir. 25 ile girerek başlayın ve daha sonra difüzyon arsa doğrusal olduğu için azalır. τ sayısı kICS analiz karşılaştırır zaman-gecikme ve bir gecikme zamanı between bir kare ve bir sonraki. Lineer bir çizgi veren küçük değer seçilmelidir. Süresi en fazla doğrusal uygun daha yüksek bir değer hat takılamaz bilgi verir seçimi, elde edilir, böylece seçilir kalmaktadır. </li><li> Maksimum k 2 değerini girin (Şekil 1 daire 1 bakınız), genellikle 20-50 olduğunu. İyi bir k 2 arsa bir hat boyunca dağıtılmış olan birçok veri noktası olduğu bir grafiğidir. 70 ile girerek başlayın ve daha sonra k 2 ve difüzyon araziler değerlendirilerek sonra azalma ve düşük değerini seçmek nerede düz bir çizgi etrafında veri noktaları küme. K 2 değeri Fourier uzayında mekansal k-vektörünün kare büyüklüğü. Iyi K 2 araziler: Başlangıçta, analiz iyi değerler belirleninceye kadar, daha sonra seçilmiş ayarları verilere iyi bir uyum vermesi kontrol her zaman veri serisindeki tüm ardışık filmler için aynı ayarları kullanabilirsiniz ama tekrar edilmelidirve lineer difüzyon arsa. </li><li> &quot;Store ayarları ve devam&quot; tıklayın. </li><li> Tüm grafikleri göstermek için &quot;evet&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Load görüntü serilerini&quot; (Şekil 1 daire 2 bakınız) tıklayın, ardından &quot;çalışma alanı&quot; tıklayın. </li><li> &quot;ImgSerCrop&quot; seçeneğini seçin, ardından &quot;Workspace al&quot; seçeneğini tıklatın. </li><li> Görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Kutu &quot;piksel boyutuna&quot; in görüntü yığınlarının satın alınan hangi görüntüleme sistemi için öngörülen piksel boyutunu girin. AQP3-EGFP&#39;nin için, 0.111 kullanılmıştır. Kutusuna &quot;çerçeveler arasındaki süreyi (ler) gir&quot;, 0,1150 AQP3-EGFP&#39;nin için kullanıldı. </li><li> &quot;1&quot;, ok tıklayın ve &quot;bütün görüntüyü kullanmak&quot; girin &quot;İB&#39;leri seçin&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> &quot;Do kICS analizi&quot; ni tıklayın ve &quot;hareketsiz filtreleme&quot; yapmak için tıklayın evet. Sonuçlar görüntüleri otomatik olarak açılacaktır. </li><li> Ayarlar penceresini minimize, hücre bilgi windo en aza indirmekw ve PHOTOPHYSICS penceresini minimize. Dinamikleri penceresinde, dinamik arsa veri noktaları korelasyon ve ücretsiz difüzyon kabul edilebilir, yani bir negatif eğimli bir çizgiye veri doğrusal bir uyum gösterdiğini kontrol edin. Belirli bir zaman gecikme için difüzyon katsayısı kaydedin ve 2 ayarları (bu uyum standart sapması dikkat etmek gerekli değildir) k. K 2 parsellerde veri noktaları gecikme belirli bir süre için hat etrafında kümelenmiş gerekir. </li><li> Tick ​​box &quot;görüntüler olarak açık rakamları kaydet&quot;, daha sonra neden dosyaları kaydetmek için &quot;görüntü olarak açık rakamları kaydet&quot; seçeneğini tıklayın. C altında yeni bir klasöre kaydet: Users Documents AQP3diffusion. &quot;Net güncel veri&quot; tıklayın ve bir sonraki ürün analizi ile devam ediyor. </li></ol></li></ol> Hesaplanan Difüzyon Katsayısının 3.. Ortalama Analiz Verilerin bir bakış Get Hesaplanır <ol><li> Bir spre her ROI bireysel difüzyon katsayıları girinadsheet (τ not ve 2 değerlerini k emin olun), yukarıda belirtilen ürünlerin adları kullanın. </li><li> Bir elektronik tablo programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısı ve standart sapma hesaplayın. </li><li> Kolmogorov-Smirnov testi veya öğrencilerin% 5 anlamlılık düzeyi kullanılarak istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için t-testi gerçekleştirin. Hücreler (örneğin, tedavi edilmeyen genel muamele edilmiş) arasında Niceliksel karşılaştırmalar yapılabilir. </li><li> Her ürün için analiz yazılımı tarafından üretilen ve her zaman lag için her durum için verileri ortalama difüzyon parsellerin elektronik tablo sürümünü açın. Gazetelerde veya sunumlarda sunmak için yeni bir ortalama difüzyon arsa üretmek. </li></ol>

<ol><li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-Space+image+correlation+spectroscopy%3A+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+Applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li>
<li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li>
<li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li>
<li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu kağıt floresan proteinleri ile etiketli proteinlerin mikroskopi görüntüleri difüzyon katsayıları belirlemek için kICS analiz yöntemi uygulamak için nasıl ayrıntılı adım-adım bir bakış sundu. Analiz etiketleme yoğunluğunda çok geniş bir dinamik aralık ile prob seçimi bağımsızdır ve bu yüzden aynı zamanda Kuantum noktalarının yanısıra boyalar ve EGFP gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri uygulanabilir. Proteinler için geçerli difüzyon katsayılarını hesaplamak için, optimize...

Plazma zar proteinlerinin dört boyutlu uzaysal Organizasyon ve yanal hareket sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve protein fonksiyonu, aktivite ve protein-protein etkileşimleri, bir rol oynayabilir. Plazma zarı proteinlerinin yanal difüzyon, geleneksel kuantum nokta time-lapse görüntüleme gelen tek parçacıklar için difüzyon katsayılarını hesaplayarak veya etiketli plazma zarı proteinleri 2-4 boya tarafından incelenmiştir. Bu yaklaşım, protein katlanmasına ve işlevini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, bazı proteinler için elde edilemez kuantum nokta ya da boya etiketleme için plazma zar proteini, bir hücre dışı etiketi sokulmasını gerektirir. Kuantum nokta sterik hacmi, proteinin 5 difüzyonunu yavaşlatmak için ve ayrıca, popülasyondaki proteinlerin sadece çok küçük bir bölümü kuantum noktaları ile etiketlenir gösterilmiştir, ve bu fraksiyon toplam temsili ise bilinmemektedir plazma zarı proteinlerinin havuzu. Tek parçacık trakuantum dot etiketli proteinlerin görüntü dizisinden difüzyon katsayıları cking (SPT) ölçümleri haritalayan iki boyutlu Gauss olan parçacıkların görüntülenmiş zirve pozisyonları kapsamlı analizi algoritmaları ardından uyar içerir. Analiz açıklayan parçacık yörüngeleri içine mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (genellikle iki boyutlu uzamsal Gauss) ve partikül pozisyonları sonraki bağlayan yaklaşımları bir time-lapse dizisi her resim çerçevesi uydurma geniş doğrusal olmayan eğri gerektiren hesaplama çok yoğun tek moleküllerin 6,7 hareketi. Yakın zamanda geliştirilen görüntü korelasyonu tekniği, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) floresan plazma zarı etiketli proteinlerin difüzyon katsayılarının göreceli basit ölçümler sağlar. Rutin kICS tarafından floresan proteinleri ile etiketlenmiş membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını hesaplamak için olasılık tutan benzersiz bir araçtırGeleneksel kuantum üzerinde çeşitli avantajları SPT analizi dot: hücre dışı etiketleme alıcı dışı etiketleri ve zaman hiçbir ekleme (floresan proteinleri ifade hücre hatları kullanılabilir) gereklidir; difüzyon katsayıları kuantum noktaları ile etiketlenmiş bir alt ile karşılaştırıldığında floresan proteinlerin toplam miktarından çıkarılır; Analiz tek proteinler izlemek için gerek olmadan basit ve analiz ek kullanıcı programlanması için bir şartı ile olan bir kodu kullanarak gerçekleştirilebilir. Difüzyon katsayılarının hızlı hesaplama ve hesaplamayı sağlayan bir ortalama tekniktir çünkü yöntem hızlıdır. Protein nüfusun bu hızlı difüzyon ölçümleri özenli SPT yöntemlerle nüfusun bir alt kümesi için elde daha ayrıntılı moleküler taşıma bilgileri tamamlar. kICS sefer ilk Fourier uzayında dönüştürülmüştür floresan mikroskobu görüntü dizileri ilişkilidir ve böylece fl ayırırMoleküler ulaşım 1 dolayı olanlardan fotofizikten nedeniyle uorescence dalgalanmalar. Sonuç olarak, kICS, sayı yoğunluğu belirlemek akış hızı ve kompleks ışıkla ağartma ile ilgili olan ya da florofor yanıp sönen difüzyon floresan etiketli moleküller olabilir. Bu, hızlı bir şekilde özel kICS yazma algoritmalar için gerek kalmadan floresan etiketli hücre zarı proteinlerinin difüzyon dinamiklerinin belirlenmesi için uygun bir araç sağlar. Bunun yanı sıra floresan etiketli proteinler, kICS da kuantum dot-işaretli zar proteinleri 8 uygulanabilir. Bu kağıt kodu ve nasıl oluşturulan araziler, değerlendirmek için nasıl kullanılacağını, kırpma yerleştirmek için nasıl göstererek EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayıları ayıklamak için kICS kullanmak için nasıl bir adım-adım giriş sağlayan difüzyon itibaren katsayıları ayıklanır. Bir örnek olarak, yarı toplam iç yansıma disk mikroskopi dizi eğirme ile elde edilen veriler floresanEGFP&#39;nin ile etiketlenmiş bir böbrek su kanalı proteini aquaporin-3 (AQP3) ve nce (TIRF) modu, sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp; region=DK">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı içermeyen orta</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp; region=DK">D8418 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Aparatı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eğirme Diski Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

k-uzay görüntü korelasyon spektroskopisi kullanarak egfp-etiketli plazma membran proteinleri difüzyon katsayılarının kolay Ölçümü

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Yanal difüzyon ve plazma membran proteinlerinin kompartmentalizasyonunun sıkı hücrelerinde düzenlenir ve bu nedenle, bu süreçleri inceleyerek plazma membran proteini fonksiyonu ve regülasyonu için yeni anlayışlar ortaya çıkaracaktır. Son zamanlarda, k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) 1 doğrudan prob fotofizikten tarafından tanıtıldı sistematik önyargıları kaçınılması floresan etiketli plazma zarı proteinlerinin görüntüleri, gelen difüzyon katsayılarının rutin ölçümler sağlamak için geliştirilmiştir. Analiz için teorik temel karmaşık olsa da, bu yöntem proteinlerin difüzyon katsayıları ölçmek için bir kodu kullanarak serbestçe kullanılabilir nonexperts ile uygulanabilir. kICS karşılıklı (k-) alan her görüntünün Fourier dönüşümünden sonra bir floresan mikroskopi görüntü yığınından bir zaman korelasyon işlevi hesaplar. Daha sonra, dairesel ortalama, doğal logaritma dönüşümü ve doğrusal verir korelasyon fonksiyonuna difüzyon katsayısı uyuyor. BuKağıt kICS üzerinden görüntü analizi ve difüzyon katsayılarının ölçümü için bir adım-adım kılavuz sağlar. İlk olarak, bir floresan etiketli plazma zar proteini yüksek çerçeve hızlı görüntü dizisi, bir floresans mikroskobu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, ilgi (ROI) membran bölgeleri, hücre içi organelleri kaçınarak veziküllerini hareketli veya çıkıntılı bir bölge seçilir. ROI yığını bir serbestçe kullanılabilir koduna ithal edilir ve birkaç tanımlanmış parametreler (Yöntem bölümüne bakınız) kICS analiz için ayarlanır. Program daha sonra k-uzay zaman korelasyon fonksiyonlarından komplo bir &quot;yamaçlarında yamaç&quot; oluşturur ve difüzyon katsayısı arsa eğiminden hesaplanır. Aşağıda bir örnek olarak, bir kanonik EGFP ile etiketlendi renal su kanalı aquaporin-3 ile, bir membran proteini difüzyon katsayısı ölçmek için bir adım adım kICS işlemdir.

KICS ile analiz edilmesi için uygun resim yığınları elde etmek için, farklı bir mikroskop sistemleri kullanılabilir. Bu bir epi-floresan mikroskop gibi bir TIRF veya dönen bir disk kurulumu görüntü dizileri analiz etmek mümkündür. Membran herhangi bir büyük hareketli hücre organelleri olmayan veya kesecikleri / hareketli nesneleri düz olmalıdır. Bu kağıt 9.2 Hz&#39;lik bir kare hızında plazma zarı ayarlanmış bir odaklanma ile dönen disk mikroskop görüntülü canlı MDCK hücrelerinde EGFP&#39;nin ile etiketlendi AQP3 bir za...

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle GFP etiketli protein eksprese eden hücrelerin büyütülmesi ve ardından odağı plazma membranına ayarlanmış bir spinning disc mikroskobunda zaman serili bir görüntü dizisinin elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, görüntü yığınında membranın düz olduğu ve hareketli organellerin bulunmadığı bir kırpma alanı seçmektir.Ardından, kırpılan görüntü vakaya dayalı görüntü korelasyon spektroskopisi yazılımı kullanılarak analiz edilir. Son adım, difüzyon grafiklerinin Excel'de ortalamasının alınmasıdır. Nihayetinde, bir membran proteininin difüzyon katsayısını ölçmek için canlı hücre mikroskopisi ile tekmeler (kicks) kombinasyonu kullanılır.Bu yöntem, farklı koşullar altında membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını belirlemek gibi membran biyofiziği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kicks kodu ilk kez kullanıldığında, MATLAB'ı açın ve dosya (file) sekmesine tıklayın. Ardından yolu ayarla (set path) seçeneğine gidin, alt klasörlerle birlikte ekle (add with sub folders) düğmesine tıklayın ve bilgisayarınızda kicks kodunun bulunduğu klasörü bulun.Tamam'a tıklayın. Veri toplama işlemi sırasında MATLAB'i kaydedip kapatmadan önce, görüntüleme süresi boyunca membranın odakta tutulması önemlidir. Floresansın homojen dağıldığı membranın düz bölgesinde dikdörtgen bir ilgi alanı veya ROI seçin.Hareket eden hücre organellerini ve dışa doğru çıkıntı yapan membran bölgelerini hariç tutun. K kare grafiklerinin iyi sonuçlar vermesi için yeterli istatistiğin oluşturulabileceği bir kırpma boyutu seçin. Bölgeyi kırpın ve kırpılan alanı tiff olarak kaydedin.Uygun bir klasöre kaydedin. Aynı filmden elde edilen birkaç kırpma varsa, stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif gibi artan sayılar kullanın. Analizi gerçekleştirmek için önce MATLAB'ı açın, komut penceresine ICS gooey yazın ve enter tuşuna basarak ICS'yi başlatın.GUI, ICS Gooey'deki görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programının yürütülebilir adıdır. Kicks sekmesine tıklayın. MATLAB code isimli klasörü bulun.scripts dosya adına sahip dosyaya gidin ve üzerine çift tıklayarak açın. Bu dosya editördür. Editör içerisinde.Kicks veri setlerini yüklemek için kaydırın. Ardından dosya adını ve klasör konumunu kopyalayıp komut satırına yazın. Komut satırı, klasör konumunun altındadır.Analiz edilecek kare sayısını belirleyin. Veri serisindeki tüm ardışık videolar için aynı ayarları kullanın. Sonraki karelerde odak kayması varsa.Bunlar, editörde analizden hariç tutulmalıdır. Kaydet'e ve ardından değerlendir'e tıklayın. Hücre veri seti şu anda GUI'deki kicks analiz penceresinde analiz yazılımına yüklenmiştir.Önce T-hücresi kutucuklarının seçimini kaldırarak analiz ayarlarını girin. Ardından analiz edilecek zaman gecikmesi sayısını girin. Maksimum K kare değerini girin.Başlangıçta genellikle 20 ile 50 arasındadır. Analiz, en iyi değerler belirlenene kadar tekrarlanmalı ve ardından bu ayar veri serisindeki tüm ardışık filmler için kullanılmalıdır. Seçilen ayarların, iyi ki kare grafikleri ve doğrusal bir difüzyon grafiği ile kanıtlandığı üzere veriler için uygun bir uyum sağladığı her zaman kontrol edilmelidir.Ardından, depo ayarlarına (store settings) tıklayın ve devam edin. Daha sonra, tüm grafikleri görüntülemek için evet'e tıklayın. Görüntü serisini yükle'ye (load image series) ve ardından çalışma alanına (workspace) tıklayın.Çalışma alanından içe aktar düğmesine tıklamadan önce görüntü serisi kırpmasını seçin. Şimdi, piksel boyutu kutusuna görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Görüntü yığınlarının elde edildiği görüntüleme sistemi için projeksiyon piksel boyutunu girin.ROI'leri seç'e tıklayın ve bir tane girin. Ardından tamam'a tıklayın ve tüm görüntüyü kullanın. Tekme analizini yap'a tıklayın ve hareketsiz filtreleme yapmak için evet'e tıklayın.Sonuçlar otomatik olarak görseller şeklinde açılacaktır. Dinamik penceresindeki ayarlar penceresini, hücre bilgi penceresini ve fotofizik penceresini simge durumuna getirin. Dinamik grafiğinin, veri noktalarının korele olduğunu ve serbest difüzyonun varsayılabileceğini gösteren, negatif eğimli bir doğrusal uyum sergilediğini kontrol edin.Belirli zaman gecikmesi ve K kare ayarları için difüzyon katsayısını kaydedin. K kare grafiklerindeki veri noktaları, belirtilen zaman için çizginin etrafında kümelenmiş olmalıdır. Lags onay kutusunu işaretleyin, açık şekilleri resim olarak kaydet seçeneğini seçin ve ardından sonuç dosyalarını kaydetmek için açık şekilleri resim olarak kaydet düğmesine tıklayın.Yeni bir klasöre kaydedin ve ardından mevcut verileri temizle seçeneğine tıklayıp bir sonraki ürünün analiziyle devam edin. Daha önce belirlenen ürün isimlerini kullanarak, her bir ROI'den elde edilen bireysel difüzyon katsayılarını bir hesap tablosuna girin ve zaman gecikmesi sayısı ile K kare değerlerini not ettiğinizden emin olun. Bir hesap tablosu programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısını ve standart sapmayı hesaplayın.İstatistiksel farkları değerlendirmek için MOV Smirnoff testi veya Student t-testi uygulayın. %5 anlamlılık düzeyi kullanılarak hücreler arasında nicel karşılaştırmalar açıkça yapılabilir. Difüzyon grafiklerinin hesap tablosu sürümü, her ürün için analiz yazılımı tarafından oluşturulmuş olup her zaman gecikmesi için her koşula ait verilerin ortalamasını almaktadır.Makalelerde veya sunumlarda sunulmak üzere yeni bir ortalama difüzyon grafiği oluşturun. Burada sunulan sonuçlar, odağı plazma membranına ayarlanmış bir dönen disk mikroskobunda görüntülenen, renal epitel hücreleri olan canlı MDCK hücrelerindeki EGFP ile işaretlenmiş Aquaporin three'nin zaman atlamalı görüntü dizisidir.Burada, kırpılacak alanların seçimi için örnek ROI kırpma bölgelerinin dikdörtgenlerle vurgulandığı bir hücre görüntüsü gösterilmektedir. Sadece iki boyutlu difüzyonun görselleştirilebilmesi için, membranının düz ve tekdüze olduğu hücre çevresinden kırpma yapmak önemlidir. Hücre organellerinden, veziküllerden ve membran çıkıntılarından kaçınılmalı ve analiz için zaman atlamalı çekim sırasında herhangi bir kayma (drift) olmaması önemlidir.Hareketli veziküllerin difüzyon katsayısına katkıda bulunabilmesi nedeniyle, bu temsili kırpılmış görüntü analizden ve kick işlemlerinden hariç tutulmuştur. Membrandaki bir deliğin bulunduğu, hariç tutulan bir başka kırpılmış görüntü örneği burada gösterilmektedir. Kick işlemleriyle oluşturulan bir kırpılmış görüntünün difüzyon grafiği burada sunulmuştur.Bu yöntem; floresan protein, bir boya veya kuantum noktaları ile işaretlenmiş bir proteinin difüzyon katsayısını bulmak için kullanılabilir. Difüzyon grafiğindeki eğrinin eğimi, basitçe difüzyon katsayısının negatifidir; burada EGFP ile işaretlenmiş Aquaporin three için gösterilen difüzyon grafiği, çok fazla zaman gecikmesi ile hesaplanmış bir grafiktir. Bu durumda analiz, difüzyon grafiğinin lineer olması için daha az zaman gecikmesi kullanılarak yeniden yapılmıştır.Burada tipik bir kareli grafik örneği sunulmuştur. Bu, söz konusu kareli grafiklerden seçilen bir zaman gecikmesine ait radyal olarak ortalanmış ve logaritmik olarak dönüştürülmüş korelasyon eğrisidir. Eğim zaman gecikmelerine karşı grafiklenmiş olup sonuç, daha önce gösterilen difüzyon grafiğidir.K kare grafikleri incelenirken, uyumun bu K kare grafiği üzerinden değerlendirilmesi önemlidir. Grafiğin negatif bir eğime sahip olması ve lineer bir şekilde gürültü tabanına doğru azalması gerektiğinden, kırpmanın çok küçük olduğu ve analiz edilemediği sonucuna varılabilir. Daha büyük K kare değerlerinde artan artıklar nedeniyle uyum artık iyi olmadığı için, bu K kare grafiğinin azaltılmış bir maksimum K kare değeri ile yeniden analiz edilmesi gerekmektedir.Bu durumda, daha düşük bir maksimum K kare değeri girilerek analiz yeniden çalıştırılmalıdır. Burada 10 kırpma üzerinden ortalaması alınmış bir ortalama difüzyon grafiği gösterilmektedir. Difüzyon grafiği, analizden elde edilen Excel dosyasında bulunmuş ve oradan alınmıştır.AQUAPORIN üç EGFP difüzyon katsayısı bu prosedür takip edilerek hesaplanır. İlaç tedavisi sonrası difüzyon katsayısının değişip değişmediği ve membran üzerindeki lipid ortamlarında ve/veya protein-protein etkileşimlerinde değişiklikler olmasının muhtemel olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için, farklı ilaçların eklenmesinin ardından membran proteinlerinin difüzyon katsayısının ölçülmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Bu yazıda, photobleaching sonra çok foton floresan kurtarma kullanarak difüzyon katsayıları ölçmek için prosedür anlatacağız. Biz örnek optik yol boyunca lazer hizalayarak ve uygun deneysel parametrelerin belirlenmesi ile başlayacak, daha sonra devam üreten ve nihayet uydurma floresan kurtarma eğrileri.

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Öğrenin, canlı memeli hücrelerde EGFP-etiketli plazma membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi ile nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, membran biyofiziği araştırmalarında protein dinamiklerini anlamanıza yardımcı olur.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü (Video) | JoVE Journal

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Daha fazla video keşfet