K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle GFP etiketli protein eksprese eden hücrelerin büyütülmesi ve ardından odağı plazma membranına ayarlanmış bir spinning disc mikroskobunda zaman serili bir görüntü dizisinin elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, görüntü yığınında membranın düz olduğu ve hareketli organellerin bulunmadığı bir kırpma alanı seçmektir.

Ardından, kırpılan görüntü vakaya dayalı görüntü korelasyon spektroskopisi yazılımı kullanılarak analiz edilir. Son adım, difüzyon grafiklerinin Excel'de ortalamasının alınmasıdır. Nihayetinde, bir membran proteininin difüzyon katsayısını ölçmek için canlı hücre mikroskopisi ile tekmeler (kicks) kombinasyonu kullanılır.

Bu yöntem, farklı koşullar altında membran proteinlerinin difüzyon katsayılarını belirlemek gibi membran biyofiziği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kicks kodu ilk kez kullanıldığında, MATLAB'ı açın ve dosya (file) sekmesine tıklayın. Ardından yolu ayarla (set path) seçeneğine gidin, alt klasörlerle birlikte ekle (add with sub folders) düğmesine tıklayın ve bilgisayarınızda kicks kodunun bulunduğu klasörü bulun.

Tamam'a tıklayın. Veri toplama işlemi sırasında MATLAB'i kaydedip kapatmadan önce, görüntüleme süresi boyunca membranın odakta tutulması önemlidir. Floresansın homojen dağıldığı membranın düz bölgesinde dikdörtgen bir ilgi alanı veya ROI seçin.

Hareket eden hücre organellerini ve dışa doğru çıkıntı yapan membran bölgelerini hariç tutun. K kare grafiklerinin iyi sonuçlar vermesi için yeterli istatistiğin oluşturulabileceği bir kırpma boyutu seçin. Bölgeyi kırpın ve kırpılan alanı tiff olarak kaydedin.

Uygun bir klasöre kaydedin. Aynı filmden elde edilen birkaç kırpma varsa, stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif gibi artan sayılar kullanın. Analizi gerçekleştirmek için önce MATLAB'ı açın, komut penceresine ICS gooey yazın ve enter tuşuna basarak ICS'yi başlatın.

GUI, ICS Gooey'deki görüntü korelasyon spektroskopisi grafik kullanıcı arayüzü programının yürütülebilir adıdır. Kicks sekmesine tıklayın. MATLAB code isimli klasörü bulun.

scripts dosya adına sahip dosyaya gidin ve üzerine çift tıklayarak açın. Bu dosya editördür. Editör içerisinde.

Kicks veri setlerini yüklemek için kaydırın. Ardından dosya adını ve klasör konumunu kopyalayıp komut satırına yazın. Komut satırı, klasör konumunun altındadır.

Analiz edilecek kare sayısını belirleyin. Veri serisindeki tüm ardışık videolar için aynı ayarları kullanın. Sonraki karelerde odak kayması varsa.

Bunlar, editörde analizden hariç tutulmalıdır. Kaydet'e ve ardından değerlendir'e tıklayın. Hücre veri seti şu anda GUI'deki kicks analiz penceresinde analiz yazılımına yüklenmiştir.

Önce T-hücresi kutucuklarının seçimini kaldırarak analiz ayarlarını girin. Ardından analiz edilecek zaman gecikmesi sayısını girin. Maksimum K kare değerini girin.

Başlangıçta genellikle 20 ile 50 arasındadır. Analiz, en iyi değerler belirlenene kadar tekrarlanmalı ve ardından bu ayar veri serisindeki tüm ardışık filmler için kullanılmalıdır. Seçilen ayarların, iyi ki kare grafikleri ve doğrusal bir difüzyon grafiği ile kanıtlandığı üzere veriler için uygun bir uyum sağladığı her zaman kontrol edilmelidir.

Ardından, depo ayarlarına (store settings) tıklayın ve devam edin. Daha sonra, tüm grafikleri görüntülemek için evet'e tıklayın. Görüntü serisini yükle'ye (load image series) ve ardından çalışma alanına (workspace) tıklayın.

Çalışma alanından içe aktar düğmesine tıklamadan önce görüntü serisi kırpmasını seçin. Şimdi, piksel boyutu kutusuna görüntüleme sistemi toplama ayarlarını girin. Görüntü yığınlarının elde edildiği görüntüleme sistemi için projeksiyon piksel boyutunu girin.

ROI'leri seç'e tıklayın ve bir tane girin. Ardından tamam'a tıklayın ve tüm görüntüyü kullanın. Tekme analizini yap'a tıklayın ve hareketsiz filtreleme yapmak için evet'e tıklayın.

Sonuçlar otomatik olarak görseller şeklinde açılacaktır. Dinamik penceresindeki ayarlar penceresini, hücre bilgi penceresini ve fotofizik penceresini simge durumuna getirin. Dinamik grafiğinin, veri noktalarının korele olduğunu ve serbest difüzyonun varsayılabileceğini gösteren, negatif eğimli bir doğrusal uyum sergilediğini kontrol edin.

Belirli zaman gecikmesi ve K kare ayarları için difüzyon katsayısını kaydedin. K kare grafiklerindeki veri noktaları, belirtilen zaman için çizginin etrafında kümelenmiş olmalıdır. Lags onay kutusunu işaretleyin, açık şekilleri resim olarak kaydet seçeneğini seçin ve ardından sonuç dosyalarını kaydetmek için açık şekilleri resim olarak kaydet düğmesine tıklayın.

Yeni bir klasöre kaydedin ve ardından mevcut verileri temizle seçeneğine tıklayıp bir sonraki ürünün analiziyle devam edin. Daha önce belirlenen ürün isimlerini kullanarak, her bir ROI'den elde edilen bireysel difüzyon katsayılarını bir hesap tablosuna girin ve zaman gecikmesi sayısı ile K kare değerlerini not ettiğinizden emin olun. Bir hesap tablosu programı kullanarak ortalama difüzyon katsayısını ve standart sapmayı hesaplayın.

İstatistiksel farkları değerlendirmek için MOV Smirnoff testi veya Student t-testi uygulayın. %5 anlamlılık düzeyi kullanılarak hücreler arasında nicel karşılaştırmalar açıkça yapılabilir. Difüzyon grafiklerinin hesap tablosu sürümü, her ürün için analiz yazılımı tarafından oluşturulmuş olup her zaman gecikmesi için her koşula ait verilerin ortalamasını almaktadır.

Makalelerde veya sunumlarda sunulmak üzere yeni bir ortalama difüzyon grafiği oluşturun. Burada sunulan sonuçlar, odağı plazma membranına ayarlanmış bir dönen disk mikroskobunda görüntülenen, renal epitel hücreleri olan canlı MDCK hücrelerindeki EGFP ile işaretlenmiş Aquaporin three'nin zaman atlamalı görüntü dizisidir.

Burada, kırpılacak alanların seçimi için örnek ROI kırpma bölgelerinin dikdörtgenlerle vurgulandığı bir hücre görüntüsü gösterilmektedir. Sadece iki boyutlu difüzyonun görselleştirilebilmesi için, membranının düz ve tekdüze olduğu hücre çevresinden kırpma yapmak önemlidir. Hücre organellerinden, veziküllerden ve membran çıkıntılarından kaçınılmalı ve analiz için zaman atlamalı çekim sırasında herhangi bir kayma (drift) olmaması önemlidir.

Hareketli veziküllerin difüzyon katsayısına katkıda bulunabilmesi nedeniyle, bu temsili kırpılmış görüntü analizden ve kick işlemlerinden hariç tutulmuştur. Membrandaki bir deliğin bulunduğu, hariç tutulan bir başka kırpılmış görüntü örneği burada gösterilmektedir. Kick işlemleriyle oluşturulan bir kırpılmış görüntünün difüzyon grafiği burada sunulmuştur.

Bu yöntem; floresan protein, bir boya veya kuantum noktaları ile işaretlenmiş bir proteinin difüzyon katsayısını bulmak için kullanılabilir. Difüzyon grafiğindeki eğrinin eğimi, basitçe difüzyon katsayısının negatifidir; burada EGFP ile işaretlenmiş Aquaporin three için gösterilen difüzyon grafiği, çok fazla zaman gecikmesi ile hesaplanmış bir grafiktir. Bu durumda analiz, difüzyon grafiğinin lineer olması için daha az zaman gecikmesi kullanılarak yeniden yapılmıştır.

Burada tipik bir kareli grafik örneği sunulmuştur. Bu, söz konusu kareli grafiklerden seçilen bir zaman gecikmesine ait radyal olarak ortalanmış ve logaritmik olarak dönüştürülmüş korelasyon eğrisidir. Eğim zaman gecikmelerine karşı grafiklenmiş olup sonuç, daha önce gösterilen difüzyon grafiğidir.

K kare grafikleri incelenirken, uyumun bu K kare grafiği üzerinden değerlendirilmesi önemlidir. Grafiğin negatif bir eğime sahip olması ve lineer bir şekilde gürültü tabanına doğru azalması gerektiğinden, kırpmanın çok küçük olduğu ve analiz edilemediği sonucuna varılabilir. Daha büyük K kare değerlerinde artan artıklar nedeniyle uyum artık iyi olmadığı için, bu K kare grafiğinin azaltılmış bir maksimum K kare değeri ile yeniden analiz edilmesi gerekmektedir.

Bu durumda, daha düşük bir maksimum K kare değeri girilerek analiz yeniden çalıştırılmalıdır. Burada 10 kırpma üzerinden ortalaması alınmış bir ortalama difüzyon grafiği gösterilmektedir. Difüzyon grafiği, analizden elde edilen Excel dosyasında bulunmuş ve oradan alınmıştır.

AQUAPORIN üç EGFP difüzyon katsayısı bu prosedür takip edilerek hesaplanır. İlaç tedavisi sonrası difüzyon katsayısının değişip değişmediği ve membran üzerindeki lipid ortamlarında ve/veya protein-protein etkileşimlerinde değişiklikler olmasının muhtemel olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için, farklı ilaçların eklenmesinin ardından membran proteinlerinin difüzyon katsayısının ölçülmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.