Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama
8 Nisan 2014
Şok dalgaları günümüzde de kendi rejeneratif etkileri bilinmektedir. Bu nedenle in vitro deneyler, giderek artan ilgi çekmektedir. Bu nedenle, böylece rahatsız edici fiziksel etkilerini önlemek vivo koşullarda taklit bize sağlayan in vitro şok dalgası çalışmalarda (IVSWT) için bir model geliştirmiştir.
Bu prosedürün genel amacı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için in vitro şok dalgası tedavisi sırasında dikkat dağıtıcı fiziksel etkilerden kaçınmaktır. Bu, önce bir hücre kültürü şişesinin tamamen kültür ortamı ile doldurulması ve ardından şişenin ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, aplikatörü su banyosuna bağlarken bol miktarda ultrason jeli kullanmaktır.
Daha sonra aplikatör, su banyosunun zarına yatay bir şekilde yerleştirilir. Son adım, hücrelerin dalga odağı içinde konumlandırılmasını sağlamak için şok dalgası kaynağının, hücre kültürü şişesinin merkezi ile aynı hizada olmasını sağlamaktır. Sonuç olarak, hücrelerinizin analizi, ilgilenilen genlerde ve sitokinlerde bir değişiklik olduğunu göstermek için gerçek zamanlı PCR ve bir sitokin dizisi ile şimdi bir örnek olarak gerçekleştirilebilir.
Bu model için ilk olarak, kısa dalgaları doğrudan hücre kültürlerine uygulamak için mevcut yöntemlerin, kültür ortamından ortam havasına geçişte dalga yansımasının etkisini dikkate almadığını gördüğümüzde aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, araştırma grubumdan Dr.Chante PhD öğrencisi olacak. Başlamak için 3,5 litre musluk suyunu 37 santigrat dereceye ısıtın.
Ardından ısıtılmış suyu su banyosuna aktarın. Su seviyesi, su banyosunun üst kısmının üç santimetre altında olmalı ve zarı tamamen örtmelidir. Ardından, sıcaklık sensörünü bir güç kaynağına bağlayın ve sıcaklık sensörünü su banyosunun arka duvarındaki bağlantı parçasına yerleştirin.
Daha sonra suyu karıştırırken, ısıtıcıyı sürekli olarak bir güç kaynağına bağlayın ve suyu 37 santigrat derece sabit bir sıcaklığa ısıtın. Steril koşullar altında. T 25 kültür şişelerindeki koltuk hücreleri.
Böylece gece boyunca kuluçka sonrası %90 akıcılığa ulaşacaklar. Daha sonra şişeleri dikey olarak yerleştirin ve kontaminasyonu önlemek için şişenin boynunun dibine kadar kültür ortamı ile doldurun. Ortamın şişenin boynu veya kapatma kapağı ile temas etmesine izin vermeyin.
Daha sonra, banyodaki suyun kirlenmesini önlemek için şişeleri filtresiz sağlam bir kapakla kapatın. Ardından kapakları paraform ile kapatın. Şişeler kapatıldıktan sonra, bunları bir standa sıkıştırın.
Daha sonra sabit şişeleri su banyosuna yerleştirin ve hücre kültürü şişesinin ortasını hizalayın. Şok şok dalgası aplikatörünün zarının merkezi ile, şok dalgası aplikatörüne ve su banyosunun zarına bol miktarda ultrason iletim jeli uygulayın. Ardından aplikatörü membrana bağlayın ve aralarında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
Ardından, şok dalgası aplikatörünü zarın ortasında tutun ve tüm hücre büyüme alanının tedavisini garanti etmek için hücre kültürü şişesi ile yatay ve dikey olarak kaplandığından emin olun. Ardından, şok dalgası aplikatörü ile kültür şişesi arasındaki ideal mesafeyi belirlemek ve doğru tedavi parametrelerini tanımlamak için bir pilot deney yapın. Shockwave cihazının aktivasyonu sırasında kültür şişesini ve aplikatörü sabit bir konumda tuttuğunuzdan emin olun.
İdeal bir mesafe belirlendikten sonra, deneyi istenen şok dalgası tedavi parametreleri altında gerçekleştirin. Şok dalgası tedavisi tamamlandıktan sonra, hücre kültürü şişesini su banyosundan çıkarın, kağıt havluyla kurulayın ve şişenin dış yüzeyini dezenfekte edin. Ardından, ortamı şişeden bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri normal santrifüj parametreleri altında peletleyin. Resus, hücre peletini iki mililitre hücre kültürü ortamında süspanse eder, daha sonra hücre süspansiyonunu beş mililitre hücre kültürü ortamı içeren şişeye geri aktarır ve hücreleri hücre analizi deneyleri için gerekli ortak akıcılığa kadar büyütür. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinin gerçek zamanlı PCR analizi, şok dalgası tedavisinden sonra iki mRNA seviyesinde bir yukarı regülasyon ortaya çıkardı.
Bu, şok dalgası tedavisini, artmış endotel hücre proliferasyonunu ve anjiyogenezi düşündürmektedir. Göbek damarındaki sitokin seviyeleri. Endotel hücreleri bir sitokin dizisi kullanılarak ölçüldü.
İki inflamatuar sitokin IL altı ve IL sekizinin de önemli ölçüde arttığı bulundu, her ikisi de anjiyojenik sürece eşlik eden inflamasyonda rol oynar. Bu teknik, şok dalgası temel bilimi alanındaki çok sayıda araştırmacının in vitro deneylerde tek bir hücre tipi üzerindeki etkilerini keşfetmesinin yolunu açtı. Şok dalgası biliminde tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için daha fazla araştırmacıyı bu modeli kullanmaya ikna etmeyi umuyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, in vivo koşullarını çoğaltmak ve rahatsız edici fiziksel etkileri en aza indirgemek için tasarlanmış in vitro şok dalgası denemeleri (IVSWT) için bir model sunar. Metodoloji, şok dalgası tedavisi deneylerinde sonuçların tekrarlanabilirliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Rejeneratif Tıp
Arka Plan
- Şok dalgaları, rejeneratif etkileriyle bilinir.
- Bu etkileri incelemek için in vitro deneyler giderek daha fazla kullanılmaktadır.
- Fiziksel dikkat dağıtıcıları en aza indirmek doğru sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
- In vivo koşulların çoğaltılması deneysel geçerliliği artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Şok dalgası denemeleri için güvenilir bir in vitro model geliştirmek.
- Tedavi sırasında fiziksel dikkat dağıtıcılarından kaçınmak.
- Hücresel analizde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kültürü şişesini kültür ortamı ile doldurmak.
- Şişeyi ısıtılmış su banyosuna yerleştirmek.
- Aplikatörün etkili bağlanması için ultrason jel kullanmak.
- Şok dalga kaynağını şişenin merkeziyle hizalamak.
Ana Sonuçlar
- Hücreler, optimal tedavi için dalga odağı içinde konumlandırılır.
- Analizler için gerçek zamanlı PCR ve sitokin dizileri kullanılabilir.
- İlgili genlerde ve sitokinlerde değişiklikler gözlemlenebilir.
Sonuçlar
- IVSWT modeli in vivo koşullarını etkili bir şekilde taklit eder.
- Dikkat dağıtıcıların en aza indirilmesi daha tekrarlanabilir sonuçlara yol açar.
- Bu yaklaşım, hücreler üzerindeki şok dalgası etkilerinin anlaşılmasını artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This model addresses a critical gap in shockwave research by enabling reproducible in vitro studies that closely mimic in vivo conditions. By eliminating wave reflection artifacts through a water-coupled system, it supports reliable mechanistic de-risking of shockwave therapies in early discovery. The approach enhances predictive confidence in target validation for angiogenic and inflammatory pathways relevant to cardiovascular and wound healing indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways linking physical shockwave stimuli to biological responses in endothelial cells.
- Operational Value: Provides a standardized platform for consistent application of physical stimuli across experiments.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of shockwave effects on gene expression and cytokine release relevant to angiogenesis and inflammation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible readouts via real-time PCR and cytokine arrays for pathway modulation assessment.
- Operational Value: Establishes a scalable, reusable system for shockwave exposure with minimal technical variability.
- Assay Readiness: Produces standardized biological responses that enable reliable compound or stimulus evaluation in downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by replicating physiological wave propagation conditions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies dose-response relationships between physical stimulus intensity and biological output in human endothelial cells.
- Preclinical Modeling: Supports early evaluation of shockwave-induced pro-angiogenic and anti-inflammatory signals prior to animal studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic insight before progressing to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of shockwave effects on endothelial gene expression and secretory profiles.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative molecular readouts essential for assay standardization and cross-experiment comparison.
- Analytics: Enables statistical analysis of gene upregulation (e.g., Tie2) and cytokine elevation (IL-6, IL-8) to define significant biological responses.
- Translational Research: Aligns in vitro mechanotransduction observations with known angiogenic and inflammatory processes in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a adaptable platform applicable to multiple cell types beyond endothelial models for broader pathway exploration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from physical artifacts in shockwave delivery.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs and experiments through controlled wave propagation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing clearer mechanistic links between physical stimulus and cellular response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of shockwave-based approaches by clarifying biological effect thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture maintenance, sterile technique, and shockwave equipment operation.
- Dependent on access to a shockwave source, temperature-controlled water bath, and ultrasound gel for acoustic coupling.
- Necessitates standardization of flask positioning, gel application, and environmental controls to ensure wave focus consistency.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to different cell types or culture vessels.
- Limited by the need to validate biological responses across cell lines to confirm generalizability of mechanotransduction findings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Preparation of Water Bath for In Vitro Shock Wave Trials
1:59
Cell and Culture Flask Preparation
2:53
Application of Shock Waves to the Water Bath
3:47
Cell Analysis Post-shock Wave Treatment
4:27
Results: Shock Wave Treatment of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
5:03
Conclusion
