Name: 4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin, açık kaynak yazılım kullanarak 4D time-lapse mikroskopide üç boyutlu numune kaymasını nasıl düzelteceğinizi. Bu yöntem, hücre hareketlerinin doğru izlenmesini ve gelişim süreçlerinin analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Gaby Martins ve bu çalışma başladı ve Fiji ve ImageJ projelere katkıda tüm EMBO2010 3D Gelişimsel Görüntüleme atölye düzenleyenlere teşekkür etmek istiyorum.

1.. 4D Time-lapse Görüntüleme Deneyleri Görüntü elde etmek için kullanılan ayarları kullanılan donanıma bağlı olarak farklılık gösterecektir. Uyarma, iğne deliği boyutunu, hedef sayısal açıklık, numunenin kırılma endeksi ve örnek gömülü olduğu orta dalga boyu: optik bölümünde bir örnek için eş odaklı mikroskopi kabiliyeti bir dizi faktöre bağlıdır. Seçilen konfokal iğne deliği boyutunu toplanmış optik kısmın kalınlığını belirleyecektir. Daha küçük bir iğne deliği ince bir optik bölüm z ekseni artan çözünürlük, ancak yakalanan ışık miktarını azaltmak üretecektir. Daha büyük bir z-ekseni iğne deliği çözünürlüğünü azaltan fakat yakalanan ışık miktarını artırarak, optik kısmın kalınlığı artacaktır. Önce düzeltme 4D veri toplama sırasında dikkate ek faktörler şunlardır: <ol><li> D kaldırmak veya limit, sürüklenmeye tarama hızı optimizetek bir zaman noktası yakalama uring. Bu nedenle görüntü toplama için alınan zaman zaman noktaları arasındaki aralığın küçük bir bölümü olması gerekir. </li><li> Bu, gerekli düzeltme tespit etmek mümkün değil gibi mükemmel tekrar eden yapılar, ya da ızgaralar, kayıt için yapılar gibi uygun değildir. Rastgele dağıtılan boncuklar veya düzensiz yapılar kesindir kayıt sağlayacaktır. </li><li> Sürüklenme beklenen ise, ilgi alanı görüntü yığını içinde kalmasını sağlamak amacıyla tarama alanını ve üst ve alt odak sınırlarını artırmak. </li><li> Sağlamanın yanı sıra, ilgi yapılarını çözmek çalışılan dinamik etkinlikler için temporal çözünürlük sağlamak için örnekleme oranını ayarlamak için uygun mekansal çözünürlüğü var. Not: Görüntü zaman noktaları arasındaki süre nedenle düzenli tekrarlanan olaylar arasında en az yarım zaman aralığı olması ve düzensiz olaylar için düşmelidir. </li></ol> 2.. Eşodaklı D Açılışataset Açık kaynak paketi Fiji mikroskobu deneylerden toplanan veriler üzerinde çeşitli işlemleri gerçekleştirmek için önceden yüklenmiş eklentileri içeren ImageJ programı, bir dağılımıdır. Yazılım kolay eklentisi güncelleme mimarisi sağlar ve bu protokol için kullanılan Doğru 3D sürüklenme plug-in bir kopyasını içerir. Yazılım Açık Mikroskopi Environment Bio-Biçimleri ithalat plug-in kullanımı yoluyla mülkiyet mikroskopi görüntü biçimlerinin geniş bir dizi ithalat destekler. <ol><li> Fiji programı yükleyin (http://fiji.sc/Downloads). </li><li> LOCI Bio-Biçimleri İthalatçı eklentisi kullanarak edinilen veri kümesi yükleyin. </li><li> Veri kümesi program için ayrılan bellek büyükse, Bellek yönetimi bölümünde &quot;Use sanal yığın seçeneğini&quot; seçin. </li></ol> 3.. Mesaj İşleme 3D Nesne Drift düzeltme Uzun bir zaman sukut sırasındagömülü bile örnek bir hareket edebilir deneme. Herhangi bir hareketi düzeltmek için ve görüntülü göç olayları analiz edilecek izin, görüntü işleme sonrası yapılabilir. Tüm görüntü işleme açıkça bu işten elde edilen herhangi bir analizin metodolojisi tarif edilmelidir. <ol><li> Veri kümesi yüklendikten sonra, Doğru 3D sürüklenme eklentisi çalıştırmak. </li><li> Birden fazla görüntü kanalları varsa, görüntüleri kaydetmek için kullanılacak kanalı seçin. Bu ideal değil, herhangi bir göçmen veya mobil elemanların daha örnek içinde statik bir yapıyı temsil etmelidir. Eğer bu mümkün değilse, ancak, en az bir hareket ile kanal seçilmelidir. </li><li> Bu analiz için kullanılan sistemde mevcut RAM orijinal veri kümesi iki katından az boyut ise, kullanımı sanal yığın seçeneğini seçin. Bu oldukça RAM&#39;de dosya kaydetme yerine, bir görüntü dizisi olarak kayıtlı hyperstack depolar. <ol><li> Çıkış bireye plug-in için bir klasör seçin ima düzeltilmişGes dosyaları. Ayrı bir resim dosyası, her z pozisyonunda her kanal için oluşturulur. </li></ol></li><li> Eklenti daha sonra kümesi uygulanır gerekli düzeltme belirlemek için her zaman noktası arasında bir çift-bilge faz korelasyon analizi yapacaktır. </li></ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Uzun zaman atlamalı mikroskopi deneylerden elde edilen veri örnek kaymasını düzeltmek için post-işleme yazılımı kullanmak için yeteneği bir dizi faktöre ile sınırlıdır. Bir numunenin göç hareketine karşı sürüklenme ayırt yeteneği kullanılan hücresel belirteçleri bağlıdır. Ya yaygın bir örnek içinde ifade edilir veya görüntü alımı sırasında göç olayları dahil olmayan hücresel belirteçleri sürüklenme düzeltilmesi için en iyi kaynağı sağlamak. Eklenti zaman noktaları arasındaki hareketi kaydetmek için bir tek kanal kullanı...

Konfokal görüntüleme yaygın morfolojisi hücre hareketleri ve değişiklikleri takip etmek, hücre ve gelişim biyolojisi kullanılır. Farklı odak düzlemleri optik bölümleri bir dizi yakalama sağlar, sonra 3D veri setlerinin bir time-lapse serisi oluşturarak dört boyutlu (4D) içine uzatılabilir bir örnek üç boyutlu (3D) modelinin üretimi. 4D veri setlerinin nesil cep hareketlerin ve davranışların detaylı ölçümünü sağlar. Uzun vadeli time-lapse deneylerde örnek hareketini gözlemlemek yaygındır. Bu donanım kontrol aşamasında ve fokal pozisyonlarda hafif yanlışlıklar neden olabilir. Başkaları durumlarda, sürüklenme örnek montaj medya içinde örnek büyümesi ya da esneklik tarafından uyarılan hareketlerin bir sonucu iken. Yöntemler donanım odaklama sistemlerine iyileştirmeler ve montaj orta artırılmış sertlik dahil, bu hareketleri telafi ya da sınırlamak için vardır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar nedeniyle görüntüleme s birçok durumda uygulanamamaktadırve yukarı numuneler bakım ve büyümesi için uygun koşullar sağlamak için gereklidir. Açık kaynak yazılım çözümleri ImageJ veya Fiji StackReg ve TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 eklentileri kullanımı yoluyla, zamanla 2D hareketin düzeltilmesi için var, ama bu olamaz 4D veri setlerine uygulanabilir. Örnek sürüklenme düzeltmek için biz açık kaynak görüntüleme işleme platformu, Fiji 1 kullanmak için bir plug-in (Doğru 3D sürüklenme) geliştirdik. Bizim plug-in üç boyutlu time-lapse deneylerde örnek sürüklenmesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar hareketi düzeltmek için faz korelasyon kaydını gerçekleştirmek mümkün değildir. Faz korelasyon 6 görüntüleri arasında çeviri belirlemek için bir hesaplama etkili bir yöntemdir. Burada açıklanan plug-in Preibisch vd. 7 tarafından geliştirilen faz-korelasyon kütüphane kullanır. Çok kanallı deneylerde, plug-in saptamaya bir kanal kullanırGerekli düzeltme ne. Bu düzeltme, daha sonra 4D kümesi kayıt ile sonuçlanan herhangi bir ek kanal tatbik edilir. Zebra balığı model sistemde birçok saatlerce, hatta birkaç gün 8 bir süre içinde zaman atlamalı görüntüleme yürütmek mümkündür. Zebrafish monte etmek için yaygın bir yöntem, hareketini kısıtlayan 9-11, düşük erime noktasına sahip agaroz (% 0.8-1.5) &#39;de anestezi canlı embriyo gömmek etmektir. Hareket sınırlı iken numunenin büyüme hala konumu kaydırılarak görüş alanı içindeki hücrelerin sonuçlanan oluşur. Embriyonun içindeki hücrelerin hareketini takip etmek için ilk olarak Numunenin tamamının hareket düzeltmek için gereklidir. Bu protokol, zebra balığı numuneler ile geliştirilen, ve görüntü hücre gruplarının geliştirme 12 için kullanılmıştır fakat herhangi bir 4D konfokal kümesi uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Trikain)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Düşük jelleşme sıcaklığı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 4 Forseps Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 3 ml dereceli</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen transfer pipeti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9cm bakteri sınıfı Petri kapları</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Florlu etilen propilen (FEP) boru</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-710 Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objektif</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

4d eşodaklı time-lapse görüntüleme ardından numune drift düzeltme

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

Dört boyutlu (4D) konfokal veri setlerinin üretimi; zaman 3D görüntü sekansların oluşturduğu; gelişim süreçleri dahil hücresel davranışları yakalamak için mükemmel bir yöntem sağlar. Hücre hareketlerini izlemek ve takip yeteneği görüntü alımı sırasında numunenin kayması ya da, bazı durumlarda, bir büyüme nedeniyle meydana örnek hareketleri ile sınırlıdır. Sürüklenme ve / veya büyüme etkilenen veri kümelerinde Takip hücrelerin hücre konumundaki herhangi bir analiz içine bu hareketleri dahil edecektir. Bu durum, numune içindeki statik yapıların görünür hareketi neden olabilir. Bu nedenle önce hücre izleme, herhangi bir numune sürüklenme düzeltilmelidir. ImageJ 2,3 açık kaynak Fiji dağıtımı 1 ve dahil LOCI araçlarını kullanma 4, biz konfokal veri setlerinin hatalı örnek hareketi kaldırmak için Doğru 3D sürüklenme plug-in geliştirdi. Bu protokol etkin odak po örnek çeviri veya değişiklikler dengeleruzun time-lapse deneyler üzerinde hücre hareketleri görselleştirmek ve ölçmek için yeteneğini korurken dört boyutlu konfokal veri setlerinin her zaman noktasını kaydetmek için faz korelasyonu kullanarak sition.

13 - Gelişmekte olan Zebra balığı, hızlı kas hücreleri 19 saat sonrası fertilizasyon (somite aşama 20) adlı çok çekirdekli fiberlerin kaynaşmasına. Çekirdeklerin hareketini ve kas her etiket için iskelet α-aktin promoterinin kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik suşu kullanılarak 4D konfokal zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirilir kas hücrelerinin füzyon görselleştirmek amacıyla Hücreler 14 ve MCherry çekirdekleri etiketlemek için, bir nükleer lokalizasyon d...

Time-lapse mikroskopi gelişimsel süreçlerin görselleştirme sağlar. Görüntü alımı sırasında büyüme veya örneklerin sürüklenme doğru takip ve gelişim sırasında hücre hareketlerini ölçmek için yeteneğini azaltır. Biz zamanla üç boyutlu örnek kaymalarını düzeltmek için açık kaynak kodlu bir resim işleme yazılımı kullanımını tanımlamak.

4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

TimeLapse Mikroskopi, görüntü boyunca meydana gelen gelişim, büyüme veya numune kayması süreçlerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Görüntüleme işlemi, hücre hareketlerinin takip edilememesiyle sonuçlanabilir; aşağıdaki protokolde, zaman içindeki üç boyutlu kaymayı düzeltmek için açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı kullanıyoruz.Farklı odak düzlemlerinde bir dizi optik kesit yakalamak, numunenin üç boyutlu bir modelinin oluşturulmasına olanak tanır. Bu işlem, 3D veri setlerinden oluşan bir zaman dizisi (time-lapse) oluşturularak dört boyuta genişletilebilir. Uzun süreli zaman dizisi deneylerinde, numune hareketinin gözlemlenmesi yaygındır.Bu durum, kontrol aşamasındaki donanımda meydana gelen kayma hassasiyetlerinden ve odak pozisyonlarından kaynaklanabileceği gibi, diğer durumlarda örnek büyümesinin veya montaj ortamındaki esnekliğin tetiklediği hareketler sonucunda oluşan sürüklenmelerden kaynaklanabilir; donanım odaklama sistemlerinde yapılan birçok iyileştirme ve montaj ortamının rijitliğinin artırılmasıyla bu hareketleri sınırlamak için telafi yöntemleri mevcuttur. Bununla birlikte, örneklerin korunması ve büyümesi için gerekli olan görüntüleme düzeneği nedeniyle, bu yaklaşımlar birçok durumda uygulanamamaktadır. Örnek sürüklenmesi için, Fiji'nin açık kaynaklı görüntü işleme platformunu kullanan bir eklenti geliştirdik.Correct 3D drift eklentimiz, çok kanallı deneylerdeki üç boyutlu zaman ayarlı (time-lapse) deneylerde dönme veya örnek kayması şeklinde meydana gelen hareketleri düzeltmek için bir faz korelasyonu kayıtlaması oluşturabilmektedir. Correct 3D drift eklentisi, gerekli düzeltmeyi belirlemek için tek bir kanalı kullanır. Bu düzeltme daha sonra diğer tüm kanallara uygulanarak dört boyutlu veri setinin kayıtlanması sağlanır.Açık kaynaklı, ücretsiz bir Web paketidir. Fiji, mikroskopi deneylerinden toplanan veriler üzerinde çok sayıda işlem gerçekleştirmek için önceden yüklenmiş eklentiler içeren Image J programının bir dağıtım çatalıdır (fork). Fiji, daha kolay bir eklenti mimarisi sunar ve varsayılan kuruluma dahildir.Kurulum tamamlandığında bu analiz için kullanacağımız doğru üç EG eklentisinin bir kopyasını edinin, ardından Fiji'yi açın. Fiji, çok çeşitli tescilli mikroskopi görüntü formatlarının içe aktarılmasını destekler. Bu işlem, sürükle ve bırak yöntemiyle veya kullanıcıların açık mikroskopi ortamı aracılığıyla gerçekleştirilebilir.Bio-formats içe aktarma eklentisi. Eğer veri seti sisteminizde yüklü olan bellek boyutunu aşarsa, görüntü dosyasını sanal bir yığın olarak açın ve bir bellek yönetimi seçeneği belirleyin. Bu analizde kullanacağımız veri seti, GFP'nin iskelet kasında eksprese edildiği ACTA1, GFP transgenik zebra balıklarının üç boyutlu zaman serisi deneyinden üretilmiştir.Çekirdekleri görselleştirmek için, bu transgenik hatta nükleusa lokalize olan M cherry enjekte edilmiştir; bu floresan kanalları daha iyi temsil etmek için, renk kanalı aracı altındaki her bir kanal için bakma tablolarını (lookup tables) değiştirebiliriz. Toplanan zaman serisi boyunca, zebra balığı örneğinin görüş alanı içinde kaydığı görülmektedir. Bu kaymayı düzeltmek için, Fiji'ye yüklü eklentilerin kayıt (registration) alt menüsünde bulunan 3D drift eklentisi açılmıştır.Örnek içerisinde yaygın olarak ifade edilen veya görüntüleme sırasında marker olaylarına karışmayan hücre belirteçleri, drift düzeltmesi için en iyi kaynağı sağlar. Bu örnekte, kanal birdeki ACTA ve GFP floresansı kullanılmıştır. Sisteminizde bellek sınırlıysa, sanal stack seçeneğini belirleyin ve Correct 3D drift eklentisinin çalışmasına izin verin.Düzeltilmiş veri seti, örneğin hareketini karşılayabilmek için orijinaline kıyasla daha geniş bir tuval boyutuna sahip olacaktır. Optik kesitlerin maksimum projeksiyon görüntülerinin oluşturulması, düzeltilmiş örnekten giderilen kaymanın karşılaştırılmasına olanak tanır.Maksimum yoğunluk projeksiyonu, veri setinden bir boyutu çıkarır ancak kayma düzeltme sonuçlarını hızlıca incelemek için kullanışlı bir yaklaşımdır. Burada, her bir bağlama noktası için düzeltilmiş ve düzeltilmemiş veri setlerindeki maksimum projeksiyon görüntülerini görüyoruz. Bu zaman atlamalı deney tek bir görüntü olarak projekte edildiğinde, kısa süreli bir zaman atlamalı deneyde bile meydana gelebilecek kayma miktarı belirginleşmektedir.Numunenizin bir kanalındaki kaymanın kaydedilmesiyle yapılan düzeltmeler, bu görüntü yığındaki diğer tüm kanallara da uygulanır. Sisteminizdeki bellek sınırlıysa, kayma düzeltme prosedürü hafifçe değiştirilir. Hem dosya formatı içe aktarma menüsünde hem de "correct 3D drift" eklentisi açılır menüsünde "used virtual stack" seçeneğini seçin.Bu seçeneği seçtiğinizde, bir eklentinin zaman atlamalı deneyinizin her bir kanal dilimi ve zaman noktası için ayrı görüntü dosyaları dışa aktarabileceği bir konum seçmeniz istenecektir. Oluşturulan sanal yığın, önceki örneğimizdekiyle aynı sürüklenme düzeltmesini içerir. Seçilen kayıt konumunu açtığımızda, oluşturulan ilgili bireysel görüntü dizisi dosyalarını göreceğiz.Bu dosya koleksiyonunu açmak için görüntü dizisi içe aktarma aracını kullanın. Elde edilen dosya kanalları, optik kesitleri veya zaman noktalarını ayırmayacaktır. Bu özellikleri görselleştirmek için, günlüğündeki verileri kullanarak yığına bir hiper yığın olarak dönüştürün; toplanan kanal sayısını, optik dilimleri ve zaman noktalarını girin. Zaman geçimli deneyimizde görüntülenen renkleri ayarlamak için araştırma tablolarını tekrar değiştirebiliriz.Bu protokol, zaman noktaları arasında meydana gelen kaymaları düzeltir; tek bir zaman noktasının yakalanması sırasında meydana gelen kaymalar bu protokolle düzeltilemez. Görüntüleme için kullanılan parametrelerin, her bir zaman noktasının yakalanması için geçen süreyi azaltmasını öneririz. Son işlem yazılımıyla kaymaları düzeltme yeteneği, aksi takdirde numunenin kayması nedeniyle gözden kaçacak olan hücre hareketlerinin analiz edilmesine ve ölçülmesine olanak tanır.

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz üç test örneklerinin hazırlanması ve nasıl optimize etmek ve STORM mikroskoplar performansını değerlendirmek için kullanılır açıklar. Bu örnekleri kullanarak biz ham veri almak ve daha sonra yaklaşık 30-50 nm çözünürlükte hücrelerinde süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek işlemek için nasıl gösterir.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Bu protokol, Fibrin pıhtıları kullanılarak numune hareketsizleştirme uygulamalarını açıklar, sürüklenmeyi sınırlar ve canlı görüntüleme sırasında reaktiflerin eklenmesine ve yıkanmasına izin verir. Örnekler, bir kapak parçasının yüzeyinde kültür ortamı içeren bir fibrinojen damlasına aktarılır, daha sonra trombin eklenerek polimerizasyon indüklenir.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu çalışma, atomik çözünürlük iletim elektron mikroskopisi görüntülemede atomik konum izleme için bir iş akışı sunar. Bu iş akışı açık kaynaklı bir Matlab uygulaması (EASY-STEM) kullanılarak gerçekleştirilir.

Elektron Mikroskopisi ile Pikometre-Hassas Atomik Konum Takibi

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Öğrenin, açık kaynak yazılım kullanarak 4D time-lapse mikroskopide üç boyutlu numune kaymasını nasıl düzelteceğinizi. Bu yöntem, hücre hareketlerinin doğru izlenmesini ve gelişim süreçlerinin analizini kolaylaştırır.

4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

Daha fazla video keşfet