4D Eşodaklı Time-lapse Görüntüleme ardından Numune Drift Düzeltme

TimeLapse Mikroskopi, bu görüntü üzerinde meydana gelen numunenin gelişimi, büyümesi veya sürüklenmesi süreçlerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Edinim, aşağıdaki protokol olan hücre hareketlerini takip edememe veya izleyememe ile sonuçlanabilir. Zaman içinde üç boyutlu sapmayı düzeltmek için açık kaynaklı görüntüleme işleme yazılımı kullanıyoruz.

Farklı odak düzlemlerinde bir dizi optik kesitin yakalanması, numunenin üç boyutlu bir modelinin oluşturulmasına olanak tanır. Bu, hızlandırılmış bir dizi 3D veri seti oluşturularak dört boyuta genişletilebilir. Uzun süreli zaman atlamalı deneylerde, numune hareketini gözlemlemek yaygındır.

Bu, donanım kontrol aşamasındaki kayma doğruluklarından ve odak konumlarından kaynaklanabilirken, diğer durumlarda, numune büyümesi veya montaj ortamı yöntemlerindeki esnekliğin neden olduğu hareketlerin bir sonucu olarak sürüklenme, donanım odaklama sistemlerinde yapılan birçok iyileştirme ve montaj ortamının artan sertliği ile bu hareketleri sınırlamayı telafi etmek için mevcuttur. Bununla birlikte, numunelerin korunması ve büyümesinin düzeltilmesi için uygun koşulları sağlamak için gereken görüntüleme kurulumu nedeniyle bu yaklaşımlar birçok durumda uygulanamamaktadır. Örnek sürüklenmesi için, Fiji'nin açık kaynaklı görüntüleme işleme platformunu kullanmak için bir eklenti geliştirdik.

Doğru 3D kayma eklentimiz, çok kanallı deneylerde üç boyutlu hızlandırılmış deneylerde bir rol veya örnek kayması olarak meydana gelen hareketi düzeltmek için bir faz korelasyon kaydı oluşturabilir. Doğru 3D drift eklentisi, gerekli düzeltmeyi belirlemek için bir kanal kullanır. Bu düzeltme daha sonra dört D veri kümesinin kaydedilmesiyle sonuçlanan herhangi bir ek kanala uygulanır.

Açık kaynaklı ücretsiz Web paketi. Fiji, mikroskopi deneylerinden toplanan veriler üzerinde çok sayıda işlem gerçekleştirmek için önceden yüklenmiş eklentiler içeren bir dağıtım çatalı olan Image J programıdır. Fiji, daha kolay bir eklenti mimarisi sağlar ve varsayılan kuruluma dahil eder.

Kurulum tamamlandığında bu analiz için kullanacağımız doğru üç EG eklentisinin bir kopyası Fiji'yi açın. Fiji, çok çeşitli tescilli mikroskopi görüntü formatlarının içe aktarılmasını destekler. Bu, sürükle ve bırak yoluyla veya kullanıcılar, Açık mikroskopi ortamı aracılığıyla elde edilebilir.

Bio formatları içe aktarma eklentisi. Veri kümesi sisteminizde kurulu olan belleğin boyutunu aşıyorsa, görüntü dosyasını sanal bir yığın olarak ve bir bellek Yönetimi seçeneği olarak açın. Bu analizde kullanacağımız veri seti, GFP'nin iskelet kasında ifade edildiği ACTA, GFP transgenik zebra balığının üç boyutlu bir zaman serisi deneyinden oluşturulmuştur.

Çekirdekleri görselleştirmek için, bu transgenik çizgiye, bu Fluor zeminlerini daha iyi temsil etmek için M kirazını lokalize eden çekirdek enjekte edildi, renk kanalı aracı altında bu kanalların her biri için arama tablolarını değiştirebiliriz. Toplanan zaman serisi boyunca, fermuar balığı örneğinin görüş alanında sürüklendiği görülüyor. Bu sürüklenmeyi düzeltti, Fiji'de kurulu eklentilerin kayıt alt menüsünde doğru 3D sürüklenme eklentisini açtı.

Bir örneklem içinde geniş çapta ifade edilen veya görüntü elde etme sırasında piyasa olaylarına dahil olmayan Satıcı İşaretleyicileri, sapma düzeltmesi için en iyi kaynağı sağlar. Bu örnekte, ACTA olan, birinci kanalda GFP floresansı. Sisteminizde bellek sınırlıysa, sanal yığın seçeneğini seçin ve Doğru 3D drift eklentisinin çalışmasına izin verin.

Düzeltilmiş veri kümesi, orijinaline kıyasla daha büyük bir tuval boyutuna sahip olacaktır. Numunenin hareketine uyum sağlamak. Optik bölümlerin maksimum Projeksiyon görüntülerinin oluşturulması, düzeltilmiş örnekten çıkarılan kaymanın karşılaştırılmasının yapılmasına olanak tanır.

Maksimum yoğunluk Projeksiyonu, boyutu veri kümesinden kaldırır, ancak sapma Düzeltmesinin sonuçlarını hızlı bir şekilde incelemek için yararlı bir yaklaşım olarak. Burada, düzeltilmiş ve düzeltilmemiş veri setlerindeki her bir bağlantı noktası için maksimum projeksiyon görüntülerini görüyoruz. Bu zaman atlamalı deney tek bir görüntü olarak yansıtıldığında, kısa bir zaman atlamalı deneyde bile meydana gelebilecek sapma miktarı belirgindir.

Örneğinizin bir kanalının kayması kaydedilerek yapılan düzeltmeler, bu görüntü yığınında yer alan diğer tüm kanallara da uygulanır. Sisteminizde bellek sınırlıysa sapma Düzeltme prosedürü biraz değiştirilmiştir. Hem satın alma biçiminde, içe aktarma menüsünde hem de doğru 3B drift eklentisi Açılır menüsünde Kullanılan sanal yığın seçeneğini seçin.

Bu seçeneği belirlediğinizde, bir eklentinin zaman atlamalı denemenizin her kanal dilimi ve zaman noktası için ayrı ayrı görüntü dosyalarını dışa aktarabileceği bir konum seçmeniz istenir. Oluşturulan sanal yığın, önceki örneğimizle aynı kayma düzeltmesini içerir. Seçilen kaydetme konumunu açarsak, ortaya çıkan bireysel görüntü dizisi dosyalarının Oluşturulduğunu göreceğiz.

Bu dosya koleksiyonunu açmak için görüntü sırası içe aktarma aracını kullanın. Ortaya çıkan dosya kanalları, optik bölümleri veya zaman noktalarını ayırmaz. Bu özellikleri görselleştirmek için, günlük dosyasındaki verileri kullanarak yığını bir hiper yığına dönüştürün, kanal sayısını, Optik dilimleri ve toplanan bağlantı noktalarını girin, Hızlandırılmış deneyimizin görüntülenen rengini ayarlamak için arama tablolarını tekrar değiştirebiliriz.

Bu Protokol, zaman noktaları arasında meydana gelen kaymayı düzeltir, tek bir zaman noktasının yakalanması sırasında meydana gelen kayma bu protokol tarafından düzeltilemez. Görüntü alma için kullanılan parametrelerin, yakalanacak her zaman noktası için geçen süreyi azaltmasını öneririz. İşlem sonrası yazılımda sapmayı düzeltme yeteneği, aksi takdirde numunenin sürüklenmesiyle beceri kazanacak hücre hareketlerinin analiz edilmesine ve ölçülmesine izin verir.