Otomatik Ayırma C. elegans Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kolonizasyonun ve buna bağlı olarak deniz zarafetinde doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin başlamasına verdiği zararı değerlendirmektir. Bu, senkronize bir genç yetişkin deniz zarafeti popülasyonunun, patojen tarafından değişken bir şekilde kolonize edilen bir solucan popülasyonu üreten yeşil floresan proteini veya GFP'yi eksprese eden pseudomonas arosa'ya maruz bırakılmasıyla elde edilir. Diferansiyel olarak yıkandıktan sonra, kolonileşmiş solucan popülasyonları, tamamen kolonileşmiş ve kolonileşmemiş solucanların iki uç noktasına odaklanarak saf popülasyonlara ayrılır.

Daha sonra bu popülasyonlardan RNA ekstrakte edilir ve immün gen ekspresyonu, patojenik olmayan e coli üzerinde yetiştirilen solucanlarla karşılaştırılarak değerlendirilir. İmmün yanıt ve kolonizasyon arasındaki ilişkiyi incelemek için, deniz zarafetinin p arosa'ya doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin patojen kolonizasyonundan ayrılabileceğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, deniz zarafetinde bağışıklık tepkisinin başlatılmasını incelemek için diğer yaklaşımlara göre en büyük avantajı, sıcak popülasyonlardaki enfeksiyondaki değişkenliği ele alması ve enfeksiyon sürecinin farklı yönlerini ayırmamıza izin vermesidir.

Bu yöntem, deniz zarafeti, doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin başlatılmasının temeli gibi doğuştan gelen bağışıklık ve yüksek verimli bir şekilde temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Farklı genetik veya çevresel manipülasyonların patojen kolonizasyonuna direnme yeteneği üzerindeki etkisi nedir? Başlamak için, birçok solucan mezar aşamasına ulaşana kadar e coli bakterileri ile tohumlanmış birkaç nematod, büyüme ortamı veya NGM plakaları üzerinde solucanlar yetiştirmek için.

Daha sonra senkronize bir kültür elde etmek için mezar hayvanlarına yumurta hazırlama solüsyonu uygulayın. Sonraki plaka. Birkaç 60 milimetrelik NGM plakasındaki yumurtalar, plaka başına yaklaşık 150 ila 200 yumurta yoğunluğunda bakteri ile tohumlanır.

Birkaç bin solucan elde etmek için en az 15 ila 20 plakaya ihtiyaç duyulacaktır. Sıralama deneyi için, daha fazla sayıda solucana ihtiyaç duyulursa, kullanıcılar plaka başına daha fazla yumurta içeren daha büyük çaplı plakalar kullanarak ölçeği büyütmelidir. Solucanlar L dört veya genç yetişkin aşamasına ulaşana kadar plakaları iki gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.

Yumurta hazırlığının ertesi gününde, POSA kültürünü ifade eden A GFP, PA 14 GFP'yi iki mililitre kral B.Medium içeren antibiyotik içine aşılayın. Kültürü gece boyunca çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, PA 14 GFP kültürünü, her 150 milimetrelik Petri kabında test için gerektiği kadar yavaş öldürme plakasına plakalayın.

75 ila 100 mikrolitre doymuş kültürü pipetleyin ve eşit şekilde yayın. Steril bir cam yayıcı kullanarak, plakaları 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. PA 14 GFP'li plakaları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

Bu arada, NGM plakalarında yetiştirilen solucanları toplamak için, plakayı kaplayacak kadar az miktarda M dokuz tampon ekleyin. Plakayı yavaşça döndürün ve sıvıyı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Solucanları PA 14 GFP plakalarına aktarmadan önce solucanların dibe çökmesine izin verin ve fazla sıvıyı çıkarın Minimum sıvı hacminde, 150 milimetrelik plakalar kullanıldığında, tek bir plakaya birkaç yüz solucan yerleştirilebilir.

P arosa'ya maruz kalan genç yetişkin solucanlar için plakaları 25 santigrat derecede 18 ila 21 saat inkübe edin. Bu, numune sıralamasını gerçekleştirmeden önce kolonize olmuş ve kolonize olmayan hayvanların optimal dağılımını gösteren zaman penceresidir, makinenin düzgün çalıştığından emin olun. Temel adımlar burada özetlenmiştir ve ayrıntılar çevrimiçi olarak edinilebilir.

Kılıf sıvısı akış hızının uygun olduğunu doğrulamak için kılıf valfi basıncını yaklaşık beş PSI'ye ayarlayın. Dağıtıcının altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin. Kılıf valfini açın ve ayırıcı valfini kapatın.

Tüpü dağıtıcının altında 60 saniye tutun. Tüpteki hacim dokuz ila 10 mililitre olmalıdır. Bu aralığın dışındaysa.

Kılıf sıvısı akış hızının doğru sıralamaya izin vereceğinden emin olmak için kılıf valfi basıncını buna göre ayarlayın. Önce kılıf valfini kapatarak sıralama hızını test edin. Daha sonra rezervuara yaklaşık 25 mililitre kontrol parçacığı çözeltisi ekleyin.

Bilgisayar yazılımındaki kılıf valfini ve numune valfini açın. Kontrol parçacığı moduna gidin ve al'a tıklayın. Parçacık akış hızının saniyede yaklaşık beş ila sekiz parçacık olduğundan ve uçuş süresinin 40 mikrometre parçacığın genişliğine yaklaştığından emin olun.

Bu, bir seferde yalnızca tek bir 40 mikronluk nesnenin geçmesini sağlayacaktır. Değerler bu aralığın dışındaysa, ayarları uygun şekilde ayarlayın. 15 mililitrelik konik tüplere M dokuz tampon yıkama solucanları kullanarak, yetişkin solucanların yerçekimi ile tüpün dibine batmasına izin verin ve süpernatanı çıkarın.

Tüpü yeni M nine tamponu ile doldurun. Bu işlemi üç ila dört kez tekrarlayın. Bu, larvaların büyük bir bölümünü ve fazla bakterileri ortadan kaldırır ve yaklaşık 10 dakika sürer.

Hafifçe karıştırılan küçük bir karıştırma çubuğu içeren solucan ayırıcı rezervuarına solucanlar ekleyin. Yeşil fotoçoğaltıcı tüpü 600'e ve kırmızı ve sarı fotoçoğaltıcı tüpü 200'e ayarlayarak ilk sinyal kazancını ayarlayın. Ayarları yapmak için veri toplamaya başlayın.

Saniyede 25 ila 30 olay veya solucan sıralama hızı hedefleyin. Sayı oranı çok yüksekse, rezervuardaki solucanları M dokuz ile seyreltin. Buna göre tamponlayın.

Oran çok düşükse, küçük bir M dokuz hacmine daha fazla solucan ekleyin. Deney, kolonileşmiş ve kolonileşmemiş solucanların çok sıkı bir şekilde ayrılmasını gerektiriyorsa, tesadüf kontrolünü saf olarak ayarlayın. Bu, iki nesnenin birbirine çok yakın veya aynı damlada meydana gelmesi durumunda, makinenin düşüşü reddetmesini sağlar.

İlgilenilen popülasyonu sıralamak için toplamak yerine, eksenin etrafına boyut ve floresan yoğunluğunu gösteren kapılar çizin. Floresan geçit değerleri ampirik olarak belirlenmelidir. Ardından, solucanları toplamak için dağıtıcının altına çok kuyulu bir plaka veya Petri kabı yerleştirin.

Ardından solucanları sıralamaya başlamak için sıralama valfini açın. Mikroskop altında sıralanan popülasyonun ilgilenilen popülasyon olduğunu doğrulamak için küçük bir hayvan popülasyonu toplayın. Değilse, geçit parametrelerini buna göre ayarlayın ve numune toplamaya devam edin.

Yaşla eşleştiğinde, GFP eksprese eden pozalara maruz kalan genetik olarak özdeş deniz zarafeti, kolonizasyon seviyelerinde geniş bir dağılımla sonuçlanır, kolonize olmayan solucanların kolonize solucanlardan verimli bir şekilde ayrılması bir solucan ayırıcı kullanılarak elde edilmiştir. Kolonileşmemiş solucanların aksine, kolonize solucanlar halsizlik gibi belirgin belirtiler gösterir ve dışkılamayı azaltır. İkincisi, P arosa tarafından kolonize edilen solucanların enfeksiyonu temizlemekte zorluk çekmesinin bir nedeni olabilir.

Solucanların kolonizasyon durumundan bağımsız olarak P arosa maruziyetine benzer şekilde dört gen indüklendi ve genlerin ekspresyonunu ölçmek için kantitatif R-T-P-C-R kullanıldı. Dört genin CL egan'ın bağışıklık tepkisinin bir parçası olduğu bilinmektedir. Lys iki, özellikle enfeksiyona yanıt veren iki karakterize edilmemiş gen olan bir lizozimi kodlar ve bunlardan biri de enfeksiyon direncine katkıda bulunur ve PGP beş, enfeksiyona ve ağır metal stresine yanıt verir.

Sonuçlar, kolonizasyonun ve buna bağlı hasarın bir bağışıklık tepkisi için gerekli olmadığını gösteren daha önce yayınlanmış sonuçları doğrulamaktadır. Bunun yerine, PGP beşin kolonize olmayan hayvanlarda indüklendiğini gösteren sinyal verileri olarak patojenle ilişkili moleküler modellere işaret etmek, ki bu da yaşanması beklenmemektedir. Kapsamlı hasar, düzenleyici programlarda, bağışıklık tepkilerini ve deniz zarafetindeki genel stres tepkilerini kontrol etmede bir örtüşme olduğunu göstermektedir.

Bu yöntem, deniz zarafetinde bağışıklık tepkilerinin başlatılması hakkında yeni bilgiler sağlayabilir, ancak enfeksiyon süreçlerinin yanı sıra çevresel koşulların veya genetik manipülasyonun kolonizasyon veya farklı patojenler arasındaki rekabet üzerindeki etkileri gibi diğer sorulara da uygulanabilir. Bu yöntem, solucanların metabolitlerin veya kimyasalların yutulması veya tutulması gibi çevreleriyle olan diğer etkileşimlerini takip etmek için de uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen sıralanmış popülasyonlar, gen ekspresyonunun ötesinde çeşitli amaçlar için kullanılabilir.

Bunlar, sonraki enfeksiyon veya hayatta kalma testleri veya davranışsal deneyler için canlı hayvanların toplanmasını içerir. Bu teknik, patojen maruziyetinin ve kolonizasyonun doğuştan gelen bağışıklık ve deniz zarafeti üzerindeki etkilerini incelemek için yararlı bir yol sağlar.