Name: Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, bitki protein komplekslerinde çeviri sonrası değişiklikleri immünopresipitasyon ve kütle spektrometrisi kullanarak nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, fosforilasyon sitelerinin tespitini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VN Royal Society tarafından desteklenmektedir. JPR bir Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Fellow (FT0992129) &#39;dir. Biz eleştirel yazının okunması için Dr Miriam Gifford teşekkür ederim.

Not: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında yapılır. 1.. Bitki Malzeme ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> N. benthamina <ol><li> Agrobacterium (bu örnekte Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG ve bir kontrol olarak boş vektör) 28 ° C&#39;de sıvı kültür (uygun antibiyotikler ile L medium) (200 rpm) çalkalanarak geçici ekspresyon için ilgi tumefaciens büyümek durağan faz kadar C °. </li><li> Toplamak ve santrifüjleme (5 dakika boyunca 3,000 x g) ile Agrobakterium pelet. Süpernatant atın ve sızma tamponu peletlenmemiş Agrobacteria&#39;yı tekrar süspansiyon. </li><li> 600 nm &#39;lik bir emişteki optik yoğunluğun (OD) değeri (Abs 600 nm) elde etmek ile agrobakteri miktarını ölçün. 0,1-0,8 bakterilerin OD ayarlayın. </li><li> 4 haftalık N. Infiltrate han tarafından agrobakteriye ile benthamina bitkiler (22 ° C, 16 saat ışık)(a-1 ml iğnesiz şırınga ile) ya da vakum (% 0.02 v / v yüzey aktif madde ekleyin) d. Not: İlk neredeyse tamamen genişlemiş-yaprak kullanarak, en etkili ve protein ifadesi için iki hemen büyük yaprak. Ubikitinlenmesi veya asetile proteinlerinin tespiti için 100 nM MG-132 ya da 100 ng / ml, Trichostatin A, sırasıyla 1 de ve 2 gün post-infiltrasyon ile yaprakların sızmak. </li><li> Infiltre yaprakları 2-5 gün sonra infiltrasyonu ve sıvı azot içinde dondurularak hasat. -80 ° C derin dondurucuda örnekleri saklamak. Not: önce 5 gün arasında bir süre boyunca numune alma ve immüno-lekeleme ile protein seviyelerini tespit ilgilenilen proteinin ekspresyonu en iyi düzeyde belirler. </li></ol></li><li> A için thaliana kararlı transgenik çizgiler <ol><li> A. büyüyecek 6 oyuklu plakalar içerisinde oyuk başına tohum thaliana Sıvı MS ortamı içinde, 5 ml (v sukroz w /% 1) ile takviye edilmiştir. Transgenik satır beş tohum (sterilize edilir ve tabakalı) için üç koyunfaiz veya kuyu başına dönüştürülmemiş kontrol çizgisinin. Büyüme odaya plaka aktarmadan önce iki gün boyunca 200 rpm&#39;de çalkalayın ve 2 hafta (22 ° C, 10 saat ışık) için bırakın. </li><li> Hasat örnekler ve sıvı azot içinde dondurularak. Not: Bir kontrol olarak, ilgi konusu proteinin aynı etiketi ile ilişkisiz bir proteini ifade eden bir transjenik çizgi kullanabilir. </li></ol></li><li> Tamponlar <ol><li> 1-2 saat boyunca tampon A. De-gaz tamponu hazırlayın (RLKs için, diğer zara bağlı proteinlerin ve nükleer proteinler,% 1 v / v Igepal CA-630 53 ekleyin). Not: süresiz 4 ° C&#39;de Tampon A tutabilirsiniz. Sen Triton yerine IGEPAL CA-360 v / 1% v kullanabilirsiniz. </li><li> Ekstre önce soğuk tampon B en az 1-2 saat 80 ml hazırlayın. Not: ekstraksiyon tamponu genel doku ideal oranı 1:04 (w / v) &#39;dir. </li></ol></li></ol> 2. Protein Ekstraksiyon <ol><li> Hemen önce ekstre soğuk tampon C 80 ml hazırlamak <li> N. 20 g eziyet benthamiana doku (yaklaşık 15 yaprak) veya A. bir havan kullanılarak sıvı azot içinde thaliana fideleri (6-çukurlu plaka başına 2-4 g). </li><li> , Zemin dokusunun 20 g soğuk tampon C 80 ml ilave edilir, iyice karıştırılmakta ve buz üzerinde eritin. Not: Aynı anda (faiz ve kontrol protein) tüm örnekleri öğütün. </li><li> (4 ° C&#39;de önceden soğutulmuş) bir doku homojenleştirici ile tam hızda 10 saniye, her 3 patlamaları ile homojenize edilmiştir. 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 30,000 x g&#39;de 22-25 um bir doku ve santrifüj yoluyla Filtre ° C. Not: Alternatif olarak, yeni bir önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağı ile homojenize. </li><li> Afinite matrisi engelleme ve yıkama adımları için, Tampon D&#39;nin 20 ml hazırlamak </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca,% 1 BSA ihtiva eden soğuk tampon D 500 ml kullanılarak uygun bir afinite matrisi Blok 100 mi ° C. Not: Tercih affinity matrisler anti-FLAG M2 agaroz, Streptavidin agaroz, GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz içerir. </li><li> 1 ml soğuk tampon D ile yıkayın 3x </li><li> Buz üzerinde yeni bir tüp içine, bir 0.45 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir yaprağı ekstresi ve filtre süpernatantı. Not: özü rengi yeşil ya da sarı olmalı, örnek kahverengiye döndüğünde ise, atın ve yeniden başlayın. </li><li> , Immunoblot için ham ekstraktı atın 5x bir kısım SDS-PAGE yükleme tamponu, girdap ekleyin ve 80-100 ° C&#39;de 10 dakika için kaynatma ile denatüre örnekleri Isı bloğu C °. </li></ol> 3. Protein İmmunopresipitasyon <ol><li> Iki adet 50 ml tüpler içinde protein özü bölünmüş ve her bir tüpe Tampon D içinde süspansiyon haline afinite matrisi 50 ul ekle. 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca yumuşak bir rotasyon ile inkübe Not: uzun inkubasyon verimini arttırmak için bulunmuştur edilmemiştir. </li><li> Eklenmesi ile elüsyon tampon 600 ul (afinite matrisi 6x boncuk hacmi) hazırlanmasıTampon D (nihai konsantrasyonlar):% 0.5 BSA, (anti-FLAG M2 agaroz için) 0.25 mg / ml ya da FLAG peptit (Streptavidin agaroz için), 10 mM D-biotin. Not: Elüsyon GFP-Trap_A ve anti-HA matrislerin durumunda tavsiye edilmez, bu nedenle 1 x SDS-PAGE yükleme tamponu içinde kaynama noktasına kadar doğrudan devam, 3.11 nolu aşama. </li><li> 4 ° C (1000 x g, 5 dakika) santrifüj ile afinite matrisi çöktürün. </li><li> , Immunoblot için bağlanmamış ekstraktının bir tümbölenini al yüzer geri kalanını atmak, tüpün alt yaklaşık 500 ul bırakır. </li><li> Geniş çaplı ucu ile bulamaç solüsyon yeniden süspanse edin. </li><li> Tek bir 1.5 ml tüp iki tüplerden karışık çamur solüsyon aktarın. Not: Şu andan itibaren, mikrofuge&#39;de tüpleri bağlama 1.5 ml düşük protein kullanın. </li><li> Afinite matrisi çöktürmek ve süpernatant kaldırmak için bir masa üstü santrifüj kullanılarak 5 saniye için nabız 3x. </li><li> Yıkamalar arasında, 1 ml soğuk tampon D ile 3-5x yıkayın afinite matri çökeltmekx, daha önce tarif edilen ve süpernatant atılır. Son yıkama bir şırınganın iğne ile fazla Tampon D çıkarın. Not:% 0.1 Igepal ile Tampon D kullanılarak bir son yıkama başka spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Sabit şekilde çalkalanarak (anti-FLAG M2 veya Streptavidin agaroz bakınız adım 3.2) uygun bir elüsyon tamponu içinde 200 ul 3x, 5 dakika ile her Zehir. </li><li> Tek bir tüp içinde 3 yıkama sıvıları Havuz. Emme reçine 30 ul kullanılarak proteinleri konsantre edilir. Vortex, 5 dakika boyunca bekletin ve reçine (10.000 x g&#39;de 2 dakika) çökelmesi edelim. Süpernatant atın. Not: GFP-Trap_A ve anti-HA agaroz için, adımları 3.9 ve 3.10 atlayın. </li><li> Çöken afinite matrisi ya da emme reçinesine 1x SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul ekle. 80-100, 10 dakika vorteksleyin ve kaynatma Isı bloğu C °. </li><li> 10,000 x g, 2 dakika için kaynatılmış afinite matrisi ya da reçine santrifüjleyin. Supernatan alikosu 5 ulimmüno-t ve ~ 10 cm uzunluğunda SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 2) üzerine diğer fraksiyonlar ile çalıştırın. </li><li> İlave ayrılma (Şekil 2) gerekli ise, kütle spektrometrisi ile ayrılması ve fosforile edilmiş proteinlerin tanımlanması için, ~ 19 cm uzunluğundaki bir SDS-PAGE jeli üzerine, geri kalan 45 ul yükleyin. Not: Boş bir şerit örnekleri kirlenmesini azaltmak için tüm örnekler arasında dahil edilebilir. </li></ol> 4. Protein Sindirim <ol><li> Coomassie Brilliant Blue (CCBB) boyası ile SDS-PAGE jel leke. Not: keratinlerden ile kirlenmeyi azaltmak için jel kullanımını en aza indirin. Ekipman veya araçlarının hiçbiri imünoblotlarını veya artık protein kontaminasyonu yapmamışlar başka faaliyetler için kullanılan emin olun. </li><li> Su içinde bol yıkanarak, tercihen O / N ile jel destain Temiz bir jilet ile jelden ilgi bant kesin. Not: immunoblot ile jel hizalama halinde necessadoğru alanını bulmak için ry. Fosforilasyon SDS-PAGE üzerinde protein göçünü geciktirme gibi hemen çıkar bant üzerinde ve altındaki alana kesin. </li><li> (Bu jel pipet uçları engelleme olmadan tüp içinde çözümler ile kaplı olmasını sağlar) 2-4 mm&#39;lik küpler halinde jel dilim zar. Bir tüp içinde yerleştirin. </li><li> Jel iyi batık tutmak için gerekli hacmi tahmin. Türevleştirme, proteaz ve peptid çıkarma ile inkübasyon için bu miktarda kullanın, ve sonra yıkama için üçlü hacimleri çift kullanın. Not: Tipik olarak, kesme jel parçalarının yaklaşık olarak 100 ul ile sindirmek yıkama için 500 ul çözeltisi, su kaybı boyunca 2 x 180 ul, indirgeme, alkilasyon için 120 ul ve 120 ul sindirim için 150 ul kullanın. </li><li> (50 mM amonyum bikarbonat, ABC),% 50 asetonitril eklenerek jel parçalarından 2 x 20 dak (veya beneği kadar) yıkanır. Jel parçaları kaldırmak için özen çözüm pipetle. </li><li> % 100 Aceto ile dehydrate5 dakika boyunca nitril ve serbest sıvı boşaltılır. Not: Jel çekmiş ve beyaz görünmelidir. Mavi renk devam ederse, asetonitril / ABC ve / veya yüksek bir sıcaklıkta (45-55 ° C) daha inkübe edilir. </li><li> Su içinde 10 mM DTT eklenerek protein disülfıt bağlarını azaltır ve çalkalanarak 56 ° C&#39;de 30-45 dakika inkübe edilir. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> 20-30 dakika boyunca (oda sıcaklığı, karanlık) için (50 mM ABC) 55 mM kloroasetamid eklenmesiyle sistein kalıntısı alkile. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> (50 mM ABC),% 50 asetonitril ile jel parçalarından 2 x 10 dakika yıkayın. Serbest sıvı çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 asetonitril ile jel parçaları kurutmak ve serbest sıvı boşaltılır. </li><li> Triptik için, sindirimi tripsin çalışma çözeltisinin 40 ul (sindirim tamponu içinde 100 ng Tripsin: 50 mM ABC, ortalama bir Coomassie boyalı bant boyunca 5% asetonitril) ekleyin. Jel parçaları 10 dakika depoIayabiIirIer izin verin. Gerekirse jel parçaları karşılamak için sindirim tamponu yeterli ekleyin. 37 º C&#39;de inkübeO / N </li><li> Sindirim durdurmak ve jel parçalarından peptidleri özü,% 5 formik asit (% 50 asetonitril) (sindirim hacmi ile aynı hacim eklemek) ekleyin. 5-10 dakika için sonikasyon. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. Ekstraksiyon 3 kez tekrarlayın. </li><li> Liyofilizasyon (tercih edilir) veya (Speed-Vac veya Savant gibi) bir vakum yoğunlaştırıcı ile peptidleri kurutun. -20 º C&#39;de muhafaza </li><li> Kütle spektrometresi için örnek gönderin. Not: Sainsbury Laboratory (Norwich, UK) ile kütle spektrometresi tesisine bizim örnek sundu. Kütle spektrometrisi tesislerinde Protocols ölçüde değişiklik gösterir, ancak tipik olarak peptidler, tandem kütle spektrometrisi-püskürtücü elektro birleştirilmiş bir sıvı kromatografi sistemi üzerine yüklenmeden önce% 2 asetonitril ile% 0.2 trifloroasetik asit içinde çözülmüş olacaktır. </li></ol>

Yazarlar, (mali ya da diğer) herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

PAMPs ve efektörler tarafından reseptör aktivasyonunun mekanizmasını açıklamaya bitki bağışıklığının anlayışımıza büyük katkıda bulunabilir. Son 20 yıl içinde, genetik ve maya iki hibrit ekranlar PRRS ve NB-LRR proteinlerin keşfi için vesile olmuştur. Daha yakın zamanda, kütle spektrometresi tabanlı protokoller 55-58 işaret bağışıklık kendi PTMS 11,33,59,60 boyunca ayrı düzenlenmiş proteinlerin tanımlanması için kurulmuştur, immün komplekslerin 61 ve effektör bileşim 62 hedefliyor. Burada immün komplekslerinin aktivasyonu düzenleyen PTMS belirlenmesi için basit bir protokol açıklar. Daha önce tarif edilen protokol ile karşılaştırıldığında, bu protokol PTMS dinamik değişimlerin ayrıntılı belirlenmesini sağlar. Büyük ölçekli proteomiks yaklaşımların Protokolleri proteinlerin PTMS belirlemek ama sınırlamak nedeniyle PTMS site plastisite ortaya çıkarmak mümkün değildir olabilired protein miktarları. Protein fosforilasyon durumunda, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar tipik olarak sadece baskın fosforilasyon siteleri 11,33,59 belirlemek. Bir protein fosforilasyon durumunun detaylı karakterizasyonu sadece hedef proteinin 47 kısmi saflaştırılması yoluyla elde edilebilir protein bir miktar gerektirir. Protokol, saflaştırılmış proteinin kütle spektrometresi analizi ile, çiftler burada hedef proteinin önemli bir miktar veren bir protein saflaştırma bir yaklaşım tarif. Bu protokol ardından, Pto tek fosforilasyon olay, daha önceden açıklandığı gibi 52 Ser-198 ağırlıklı olarak atfedilen ancak bazı kütle spektrometresi spektrumları da Pr-195 veya Pr-199 üzerinde tek bir fosforilasyon olayı desteklenmiştir. Pto çift fosforlama etkinlik gözlenmiştir zaman başka sitelerde kombinasyonları da gözlenmiştir, ancak, fosforilli amino asitler baskın kombinasyonu (198 ve Ser-Thr-199 idiTablo 1). Bu sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilasyon yeri doldurulan malzeme ve ayrıntılı olarak mümkün olan tüm fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. Bu protokolün en kritik adımlar şunlardır: proteinlerin 1) yeterli çıkarma; PTMS 2) korunması ve hedef protein 3) yeterli miktarda. İlk olarak, proteinlerin yeterli çıkarılması için, sıvı azot içinde doku öğütmek için ve daha sonra protokolde tarif edildiği gibi bir doku homojenleştirici kullanılması önemlidir. Bir doku homojenleştirici mevcut değilse, bir havan ve havaneli kullanılabilir. Bu, üç (veya dört) ekstraksiyon tamponu hacmi doku gram birinden bir oran kullanmak da önemlidir. Oranını ve öneririz yüksek mukavemetli tampon tampon Bu doku, pH çıkarma işlemi sırasında tarafsız kalmayı sağlayacaktır. Bu A için özel öneme sahip olduğu bulundu thaliana ve domates ekstrahiçbir zaman göz ardı 52. PTMS korunması tüm tampon PTMS kaldırabilir enzimlerin uygun inhibitörleri de dahil olmak üzere elde edilebilir. Bu 4 ° C&#39;de tüm adımları gerçekleştirmek ve tamponlar ve araçlar prechill da önemlidir. Hedef proteinin yüksek verimleri yeterli miktarlarda protein eksprese eden bitkiler kullanılarak, doku (yaklaşık 20 g), yüksek miktarda kullanarak elde edilebilir. Hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek için en önemli adımı, doğrudan immüno-çökeltme ile hedef proteinin konsantre edilir. Bu adımın önemi nedeniyle Yardımcı bağışık çökeltilmiş Pto (Şekil 2B) sınırlı miktarda bir Prf immunoprecipitation sonra Pto PTMS belirlemek için başarısızlık tarafından vurgulanır. Bunun aksine, Pto doğrudan immüno-protein dizisi ve PTMS (Tablo 1) tanımlanması nedeniyle yaklaşık% 80 içerisinde yol açan önemli ölçüde daha fazla ölçülebilir peptidler (Şekil 2C) vermiştir. Biz de strongly protein immunoprecipitation için epitop-etiketleri kullanmanızı öneririz. Proteinler, doğal epitop afinite matrisi karşı ortaya çıkartılan antikorlar ile karşılaştırıldığında, kısmen saflaştırılmış protein yüksek miktarlarda verebilir. Immüno-çökeltme için yerel Pto protein 51 (Şekil 2A) karşı ortaya çıkan bir antikor kullanarak, Pto iki baskın fosforilasyon siteleri tek tek fosforilasyonunu tespit etmek mümkün oldu. Bu protokol, esas olarak N. kısmi saflaştırılması için geliştirilmiştir benthamiana sitoplazmik protein ve fosforilasyon siteleri sonraki tespiti. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen modifikasyonları kullanılarak, bu protokol kolayca A. için uyarlanabilir thaliana proteinler ve zara bağlı proteinler. Bu protokol ana amacı PTMS tanımlanması için hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek üzere ve karmaşık en yüksek saflık elde etmek için değildir. Eğer daha yüksek saflıktakompleks gereklidir saflaştırılması bir ikinci adım, bu protokol 52 eklenebilir. Bu durumda, bir ilk adım sert elüsyon koşulları gerektiren, yüksek tuzları veya asit kullanımı ve bir sonraki aşamada olmadan afinite matrisinden hedef proteinin elüsyon işlemi ise bir matris gerektirebilir sağlayacaktır. Biz sadece fosforilasyon sitelerinin tanımlanması için bu protokolü test edilmiş ve şu anda ek PTMS ayrıntılı tanımlanması için kabiliyetini test olduğunu olduğunu vurgulamak önemlidir. Bizim için temsili sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilleme alanı plastisite ve fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. En önemlisi, kütle spektrometrisi ile ve oto-fosforilasyon siteleri tek bir nokta mutasyonu tarafından proteinlerin düşük miktarda güvenmek fosforilasyon siteleri kimlik kafa karıştırıcı sonuçlar verebilir vurgulamak. Biz burada daha önce göstermek 47 </sup&gt; Ser-Thr-198 ve 199 ile ilgili Pto bu çift fosforlama Prf / Pto kompleksinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunun aksine, daha önce yayınlanmış sonuçlar 47,63 Ser-Thr-198 ve 199 tek bir nokta mutasyonu kompleks aktivasyonu için bir önkoşul, bu siteye bu fosforilasyonunu gösteren işaret yeteneğine sahip olan, bu sitelerde fosforilasyonunu değildir önleyen, alanine göstermiştir . Bu sonuçlar, şu anda ikincil site Thr-195 fosforilasyonu ile açıklanabilir. Diğer protein kinaz fosforilasyon Alanı plastiklik içine Benzer fikir, bu protokol takip edilerek elde edilebilir. Ayrıca, fosforilasyon bölgelerini kullanan bir birleşik yaklaşım mutasyon, protein kinazların fosforilasyon yer plastisite evrimsel öneminin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır protein immüno ve kütle spektrometre analizleri ile bağlantılı olarak, özel kinazlarının (efektörler) inhibe edebilir proteinlerin etmektedir.

Bağışıklık yollar hızla sinyalleri iletmektedir ve bağışıklık tepkileri 1 aktif hale getirmek için protein çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. PTMS protein yapısını, etkinlik, stabilite, yerelleştirme ve protein-protein etkileşimlerini 2-4 etkileyebilir protein yapısının hızlı, tersine çevrilebilir, ve son derece spesifik kimyasal değişiklikler bulunmaktadır. Bitkilerde, PTMS 300&#39;den fazla türleri ubikitinasyon, sumoilasyon, sülfasyon, glikosilasyon ve fosforilasyon 2,5 dahil olmak üzere tespit edilmiştir. Kanıt artan vücut bitki bağışıklık 1,5,6 farklı yönleriyle PTMS önemini vurgulamaktadır. Protein fosforilasyonu, bir serin bir fosfat grubunun tersine çevrilebilir bağlanma, treonin ya da tirosin Tortu, pek çok hücresel bir fonksiyon düzenleyici olup, şaşırtıcı bir şekilde çok yüksek cascades 5-11 sinyal bitki savunma PTM incelenmiştir. Fosforilasyon-bağımlı sinyal bitki defe ayrılmaz bir parçasıdırnse aktivasyon multidomain dayanıklılık proteinleri 5,8 ile transmembran reseptörleri tarafından mikropların hücre dışı algı, ya da hücre içi tanıma sonra başlattı. Bitkiler işgal üzerine, mikroplar örüntü tanıma reseptörleri (PRR&#39;ler) 12 denilen plazma zarı reseptörleri tarafından tespit edilir. Bilinen PRR reseptör-benzeri proteinler (RLPs) ya da reseptör-benzeri kinazlar (RLKs), her ikisi de bir ligand bağlayıcı ektoalan taşıyan ve tek-geçişli bir zar geçiş alanı ya da bulunmaktadır. RLPs aksine, RLKs bir hücre içi kinaz etki alanını 13-15 sahiptir. PRRS of ekto RLKs durumunda, hücre içi etki alanı 6, ​​16 içinde otofosforilasyon ve transfosforilasyonu için, patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPs) olarak adlandırılan lider korunmuş mikrop elisitör moleküllere bağlanır. PRRS algılama indüklediği fosforilasyon bölgesinin aşağısında, 17 kinazlar da dahil olmak üzere, sitoplazmik proteinler daha sonra fosforilasyon, </su&gt; 18 p, 19, E3 ligaz, mitojen tarafından aktive edilen protein kinazları (MAPK &#39;ler) 20, 21, kalsiyum-bağımlı protein kinaz (CDPK) PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI) 22, 23 ve 24, transkripsiyon faktörleri, 25 yol açar. PRRS ile hücre dışı algı ek olarak, patojenlerin hücre içi sitoplazmik tanıma reseptörleri yoluyla elde edilir. Bu multidomain direnci (R) proteinlerinin değişken bir N-ucu alanı, merkezi bir nükleotid-bağlayıcı (NB) motifi, ve C-terminali lösin açısından zengin tekrarları (LRR) içerir ve bu nedenle NB-LRR proteinler 26, 27 olarak adlandırılır. R proteinleri, doğrudan veya dolaylı olarak da PRRS ve bağışıklık sisteminin diğer hedef düğümleri için bilinen efektörleri olarak adlandırılan bir patojen kaynaklı hastalık oluşturma molekülleri, tanır. Tanıma efektör-tetiklenen bağışıklık (ETI) 28-31 önde gelen güçlü savunma uyarmaktadır. NB-LRR proteinler müsadere varte NB alanı 30, 32 içindeki motif ATP-bağlama, ancak bunlar bir kinaz sahası yoksundur. NB-LRRS korunmuş etki fosforilasyonu, büyük çaplı bir proteomik diğer 33&#39;te rapor edilmiştir, ancak ETE ile ilişkisi açık değildir. Benzer şekilde PTI için, NB-LRR proteinlerin aktivasyonu MAPK 34-37 ve 38-40 gibi CDPKs sitoplazmik proteinlerin fosforilasyonuna yol açar. En önemlisi, efektör tanıma NB-LRR protein 41 ile doğrudan etkileşim aksesuar proteinlerin fosforilasyonunun yol açabilir. Bazı örnekler NB-LRR proteinleri ile etkileşen proteinleri RIN4 (Arabidopsis thaliana) ve Pto (domates, Solanum lycopersicum) arasında, RPM1 42, 43 ve 44, sırasıyla Prf. Pseudomonas syringae bakterilerin enfeksiyon esnasında, efektör protein AvrB, reseptör-benzeri kinaz RIPK 45, büyük olasılıkla, RIN4 fosforilasyonunu uyarır <sup&gt; 46. Benzer şekilde, domates P. syringae ve AvrPto AvrPtoB Pto 47 fosforilasyonunun uyarılması efektörler. , Bir kinaz sahasına sahip değildir ve trans-fosforile edilmiş olmalı RIN4 aksine, Pto oto-fosforilasyonu 48 ve alt tabakalar 49, 50 trans-fosforilasyonu sahip aktif bir kinazdır. Pto sinyallemesinin efektör bağımlı başlatılması için, bunun kinaz aktivitesini gerektirir, kinaz ölü Pto mutantlar yine bir efektör-bağımsız bir şekilde 51 in sinyal edebiliyoruz. Biz son zamanlarda Prf / Pto karmaşık çoklu Prf içeren, oligomerik ve Pto 52 molekülleri ve aynı kompleks içinde Pto molekülleri 47 birbirine trans-fosforilatlayabilen o göstererek bu gözlemleri açıkladı. Biz, Pto (sensör) bir molekül da ikinci Pto molekül (yardımcı) wit aktive olduğu NB-LRR protein (Prf) bir değişikliğe yol açan konformasyon, efektör protein ile etkileşime girdiği bir model önerilenkarmaşık hin. Daha sonra, yardımcı Pto molekülü sensör Pto karmaşık direnci 47 tam aktivasyonuna yol trans-fosforile eder. Bu örnekler efektör tanınması üzerine immün kompleks bileşenleri ve potansiyel PTMS belirleme sinyalleri aşağı hedeflerine efektör algı transdüksiyona nasıl daha iyi anlaşılmasına yol açabilir göstermektedir. Burada NB-LRR etkileşen proteinler ve bunların PTMS daha sonra tespit edilebilmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Bir model olarak Nicotiana benthamiana ve domates Prf / Pto kompleksi kullanarak, ancak aynı protokolü kolay N. ikinci RLKs uygulanabilir benthamiana ve A. küçük değişikliklerle thalianadan 53 biz protokolü dahilinde açıklamak gibi.

<table><tbody><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Asetosiringon</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>toksik - DMSO</td></tr><tr><td>Şırıngada 1 M stok 1 ml steril</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77 (yüzey aktif madde)</td><td>Lehle Tohumları</td><td>VIS-01</td><td>toksik</td></tr><tr><td>MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td> <td>Sigma</td><td>C2211</td><td>DMSO'da 1 M stok, -80 ve derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>MS tuzları</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td>oksitleyici, toksik</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Trizma baz</td><td>Sigma</td><td>T1503</td>, <td>1 M Tris-HCl tamponu yapmak için pH'ı 1 N HCl ile ayarlayın</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>5 M stok</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>toksik - 0,5 M stok</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>EC-606</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>aşındırıcı</td></tr><tr><td>PVPP (polivinilpolipirolidon)</td> <td>Sigma</td><td>P5288</td>, <td>PVP</td></tr><tr><td>DTT (DL-ditiotreitol)</td> ile karıştırmayın <td>Sigma</td><td>43815</td><td>toksik - 1 M stok, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Bitki proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>çok fazla donma/çözülme yapmaz</td></tr><tr><td>PMSF (fenilmetilsülfonil florür)</td> <td>Sigma</td><td>P7626</td><td>aşındırıcı, toksik</td></tr><tr><td>Kalikülin A</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9902</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Florür (NaF)</td> <td>Sigma</td><td>S7920</td><td>toksik - 1 M stok</td></tr><tr><td>Sodyum Molibdat (Na2MoO4)</td><td>Sigma</td><td>S6646</td><td>0,5 M stok</td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td>toksik - 200 mM'lik bir sodyum ortovanadat çözeltisi hazırlayın. 1 N NaOH veya 1 N HCl kullanarak pH'ı 10.0'a ayarlayın. Sodyum ortovanadat çözeltisinin başlangıç pH'ı, birçok kimyasala göre değişebilir. PH 10.0'da çözelti sarı olacaktır. Çözeltiyi renksiz olana kadar kaynatın (yaklaşık 10 dakika). Oda sıcaklığına soğutun. pH'ı 10.0'a yeniden ayarlayın ve çözelti renksiz kalana ve pH 10.0'da stabilize olana kadar 3. ve 4. adımları tekrarlayın.</td></tr><tr><td>Okadaik asit</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-3513</td><td></td></tr><tr><td>Kinematica Polytron doku homojenizatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-320</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 agaroz</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>bu matris önerilir</td></tr><tr><td>Streptavidin-agaroz</td><td>Thermo-Scientific</td><td>20347</td><td>bu matris önerilir</td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek</td><td>gta-20</td><td>bu matris önerilir</td></tr><tr><td>Anti-HA-Agaroz</td><td>Sigma</td><td>A2095</td><td>bu matris</td></tr><tr><td>0.45 & mu önerilir; m filtresi</td><td>VWR</td><td>513-1902</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptit</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin</td><td>Sigma</td><td>47868</td><td></td></tr><tr><td>StrataClean reçine</td><td>Agilent</td><td>400714</td><td>bu absorpsiyon reçinesi protein çökeltmesi için önerilir</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>bu leke önerilir</td></tr><tr><td>Protein düşük bağlayıcı tüpler (LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.116</td><td>bu tüpler önerilir</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat (ABC)</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>toksik</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>VWR</td><td>83639</td><td>toksik, yanıcı</td></tr><tr><td>2-kloroasetamid</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td>toksik</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>tahriş edici, hassaslaştırıcı</td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma</td><td>14265</td><td>toksik, aşındırıcı</td></tr><tr><td>Su banyosu sonikatörü</td><td>Ultravawe</td><td>Ultra BT Ultrasonik Banyo</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap XL</td><td>Termo-Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma</td><td>T8552</td><td>toksik</td></tr></tbody></table>

plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bitkiler algı ayrıntılı nedeniyle değişen ortamlara ve sinyalizasyon sistemi ile hızlı bir şekilde adapte. Patojen atak sırasında Bitkiler, hızla immün komplekslerin toplama ve etkinleştirme ile enfeksiyona yanıt. Immün komplekslerinin aktivasyonu, fosforilasyon, glikosilasyon ya da ubikitinasyon gibi proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlar (PTMS) ile ilişkilidir. Bu PTMS koreografisini nasıl anlamak direnç elde edilir nasıl daha iyi bir anlayışa yol açacaktır. Burada nükleotid-bağlayıcı lösin açısından zengin tekrar (LRR-NB) etkileşen proteinleri ve post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) sonraki belirlenmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Küçük değişikliklerle, protokol diğer bitki protein komplekslerinin saflaştırılması için uygulanabilir. Yöntem, daha sonra kısmen saflaştırılır ilgilenilen proteinin, b bir epitop etiketli versiyonu ekspresyonuna dayanıry immüno ve etkileşen protein ve PTMS belirlenmesi için kütle spek-trometresine tabi. Bu protokol olduğunu göstermektedir: i.) Fosforilasyon gibi PTMS dinamik değişikliği kütle spektrometresi ile tespit edilebilir, ii). Bu ilgilenilen proteinin yeterli miktarda olması ve bu immünoçökeltme saflık eksikliği telafi edebilir önemlidir, iii). Ilgi konusu bir proteinin PTMS tespit etmek için, bu protein, protein yeterli bir miktarını elde etmek için imüno zorundadır.

Bu stabil bir transgenik A. etiketli proteinlerin saflaştırılması için burada bir protokol açıklar thaliana çizgiler veya N proteinlerin geçici tanımlamadan sonra benthamina. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, hedef proteinin saflaştırılması etkileşen protein ve hedef proteinin PTMS belirlenmesine olanak sağlamak için, kütle spektrometresi ile birleştirilir. Protokol ve bitki bağışıklığının PTMS kimlik katılan proteinlerin saflaştırılması için tasarlanmıştır, ancak herhangi etiketli bitki proteininin saflaştırılması için uygulanabilir. Bir örnek olarak N arasından Prf / Pto kompleksinin kullanımı arıtma benthamiana. transjenik N. 35S benthamiana satır 38-12 54: Pto, geçici 35S ile transforme edildi: Prf-FLAG ve karmaşık anti-FLAG M2 agaroz (Şekil 2A) ile immüno-çökeltildi. Şekil 2A&#39;da imüno (IB)hedeflenen protein (Prf) çoğu imüno olduğunu göstermektedir. Pto ve etkileşen efektör protein AvrPtoB Prf ile copurified ve (Şekil 2A ve 2B) antikorları ve kütle spektrometre analizi ile tespit edildi. AvrPto ve 35S: AvrPtoB (Şekil 2A) Bu efektör 35S yapıları ile birlikte eksprese olduğunda Prf ile copurified Pto SDS-PAGE jeli üzerinde daha yavaş göç bulundu. Her iki efektör proteinler Prf etkileşen Pto (Şekil 2A) ve daha yavaş göç neden oldu. Bu fosfataz 44 ile işlenerek çıkarılabilir olabilir gibi Pto bu efektör tanıma bağımlı yavaş göç önce fosforilasyon atfedilmiştir. Pto yavaş göç katkıda fosforilasyon bölgelerini tespit etmek için, kütle spektrometresi analizi Prf copurifying Pto tabi tutuldu. Pto yüksek ifadesi ve İmmünoblotların ile kolay tespiti rağmen biz peptidleri c almak olabilirPto dizinin sadece% 57 overing ve herhangi bir fosforilasyon bölgelerini (Şekil 2B) tanımlamak için başarısız oldu. Daha sonra, anti-FLAG. N. ile Pto proteini hedef stratejileri değişti Prf-3HA ve 35S: Pto-FLAG, ya da 35S olmayan: AvrPto ve 35S: benthamiana WT bitkilerin geçici olarak 35S ile dönüştürülmüştür. AvrPtoB Prf-kompleks ile serbest formda hem de içeren Pto protein, toplam miktarı, immüno-çökeltildi anti-FLAG M2 agaroz ve SDS-PAGE fraksiyonasyon, in-jel triptik sindirim ve kütle spektrometrik analizi (Şekil 2C) tabi ile. Bu yaklaşımla onun dizisinin yaklaşık olarak% 80 ve bilinmeyen bir 100 kDa proteinini kapsayan etkileşim Pto peptidler belirlenmiştir. Biz, Pto peptidler 187-202 ve 188-202 (Tablo 1) için tek ve çift fosforilasyon bir dizi tanımlanır. Ser ve Thr-198-199, baskın fosforilasyon bölgeleri, ancak diğer pho idisphorylation siteler de tespit edildi (Tablo 1). Ser ve Thr-198-199 ile ilgili en önemlisi çift fosforlama sadece efektör protein (Tablo 1) ya da varlığında tespit edilmiştir. Yakın zamanda Pto fosforilasyon benzer bir dizi tanımlanır ve 47 sinyal için çift fosforilasyon olayın önemini gösterilen. Burada tarif edilen protokol izlenerek biz hedef proteinin fosforilasyon durumu dinamik değişiklikleri tespit etmek mümkün oldu. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Şekil 1. Genel deney tasarımı. Hedef protein immüno-çökeltme (IP) için geçici Nicotiana benthamiana veya kararlı biçimde Arabidopsis thaliana, in planta etiketlendi ve ifade edilir. Protein çıkarılması ardındanHedef protein, bir afinite matrisi ile imüno-çökeltilir. Proteinler, elektroforez ile bir akrilamid jeli üzerinde ayrılır. Jel bantlar eksize edilir. Proteinler, jel bantları çıkarıldı ve kütle spektrometreye tabi tutulur. Fosforilasyon siteleri ve etkileşim proteinler tanımlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Şekil 2. Prf ve Pto immunopresipitasyon. A). Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonrası infiltrasyon Prf anti-FLAG yakınlık matrisi kullanılarak immünopresipite edildi. ImmuPrf, AvrPtoB ve Pto için noblots (IB) yapıldı. Pto immunoblot panelinin altındaki oklar ile belirtildiği gibi, AvrPto ve AvrPtoB) Pto. Bir B yavaş göç neden olur. Yapı 35S: Prf-FLAG geçici 38-12 hattı (35S: Pto) olarak ifade edilmiştir boş vektör (EV) ile birlikte, 35S: AvrPto veya 35S: AvrPtoB. Üç gün sonra infiltrasyonu Prf anti-FLAG agaroz kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde ayrıldı. Jel, Coomassie Parlak Mavisi (CCBB) ile görünür Prf ile boyanmış, Pto ve AvrPtoB proteinler bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Kütle spektrometresi ile tespit Pto ve Prf dizilerin yüzdesi peptid kapsama belirtilir. C) verdi. Yapıları 35S: Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici 35S ile birlikte ifade edildi: AvrPtoB, 35S: AvrPto veya N boş vektör (EV) benthamina. Üç gün toplam tutarı sonrası süzülmePto-FLAG agaroz anti-BAYRAK kullanarak immünopresipite ve SDS-PAGE çözüldü. Görünür Pto ve Pto-etkileşimli protein bantları jelden kesilip çıkarılmış ve kütle spektrometrisi ile analiz edilmiştir. Prf (oklarla gösterildiği gibi) biraz daha az görünür ise Pto ve 100 kDa Pto-etkileşimli protein bandı, koloidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB)-boyanmış jel üzerinde açıkça görülebilir. IP: İmmunopresipitasyon; IB: Immunoblot; CBB: Koomassie Parlak Mavi boyama; CCBB: Coomassie Parlak Mavi boyaması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Pto peptid 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [p T 195] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Pto peptid 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Peptidler 187-202 ve 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> İki fosforilasyon olayları ile peptidlerin yüzdesi </td><td> % 0 </td><td> % 26.9 </td><td> % 11.2 </td></tr><tr><td> Pto Dizi Kapsamı </td><td> % 78 </td><td> % 79 </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tablo 1, 35S sinyal aktivasyonu üzerine bir çift Pto peptidin fosforilasyonu:.. Prf-3xHA ve 35S: Pto-FLAG geçici em ile birlikte ifade edildiPty vektörü (EV), 35S: AvrPto ya da 35S: N. AvrPtoB benthamina. Üç gün sonra infiltrasyonu Pto-FLAG proteininin toplam miktarı, anti-FLAG afinite matrisi kullanılarak immüno-ve SDS-PAGE üzerinde çözüldü. Coomassie parlak mavi lekeli jel üzerinde Pto görülebilir bantlar kütle spektrometrisi ile çıkarıldı ve analiz edildi. Pto 0 ile özdeşleşmiş peptidler, 1 ve 2 fosforilasyon olaylarının sayısı belirtilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tamponların Tablo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L orta </td><td> Tripton </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> Maya özü </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-glikoz </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Agro-infiltrasyon tampon </td><td> MgCI2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> PH 5.5 &#39;e ayarlayın </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Asetosiringon (isteğe bağlı) </td><td> 150 uM </td></tr><tr><td> Tampon A </td><td> Tris-HCl pH 7.5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Gliserin </td><td> % 5 (v / v) </td></tr><tr><td> Tampon B </td><td> Tampon A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> % 2 (a / h) </td></tr><tr><td> Tampon C </td><td> Tampon B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Ditiyotreitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Plant proteaz önleyici kokteyl </td><td> % 1 (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Fenilmetilsülfonil florid (PMSF) </td><td> 0.5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin A </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum flüorür (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum molibdat (Na 2 MoO 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodyum ortovanadat </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Okadaik asit </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Tampon D </td><td> Tampon C PVPP&#39;nin olmadan </td><td></td></tr><tr><td> 5x SDS-PAGE yükleme tamponu </td><td> Tris-HCl pH 6.8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> % 2 </td></tr><tr><td></td><td> Gliserin </td><td> % 0.15 </td></tr><tr><td></td><td> Bromophenol Mavi </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td></td><td> DTT (kullanımdan hemen önce ekleyin) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Tampon ve medya tarifleri.

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Bu prosedürün genel amacı, öncelikle bitkilerde geçici veya stabil olarak ifade edilen, ilgi duyulan proteinin etiketlendiği bitki protein komplekslerinde yer alan proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlarını belirlemektir. Ardından, bitki dokusundan toplam proteinler ekstrakte edilir ve ilgi duyulan protein immünopresipite edilir. Sonrasında, immünopresipite edilen proteinler bir akrilamid jel üzerinde ayrılır; ilgili jel bandındaki proteinler ekstrakte edilir ve sindirilir.Şimdi protein örneklerini kütle spektrometrisi için gönderin. Nihayetinde, kütle spektrometrisi sonuçları, fosforilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlardaki dinamik değişiklikleri tespit edebilir. Kinazın substrat ile in vitro inkübasyonu gibi alternatif yöntemlerin aksine, bu yöntem proteinleri planter içinde eksprese eder.Böylece hangi kinazın fosforilasyondan sorumlu olduğunu bilmenize gerek kalmaz. Bu yöntem; stres, çevresel değişiklikler veya patojen tanımaya yanıt olarak sinyallerin nasıl iletildiği gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aktive olmuş direnç proteini komplekslerinin fosforilasyon bölgelerinin tanımlanmasının yanı sıra, bu yöntem herhangi bir bitki protein kompleksinin herhangi bir post-translasyonel modifikasyonuna geniş bir şekilde uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, büyük miktarda ekstrakt ile çalışmaya ve protokolün daha fazla adımını tek bir günde gerçekleştirmeye alışkın olmadıkları için zorluk yaşayacaklardır. Geçici ekspresyon için, agrobacterium tohin suşlarını stasyoner fazda büyütün. Agrobakterileri 3000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin.Peletleri ve infiltrasyon tamponunu resüspande edin. Dört haftalık NCOA Nicotiana benthamiana bitkilerini, agrobakterilerle bir mililitrelik iğnesiz şırınga kullanarak manuel olarak veya %0,02 sürfaktan içeren vakum yöntemiyle infiltre edin; infiltrasyonu takip eden iki ila beş gün bekleyin.İnfiltre edilmiş yaprakları hasat edin, dondurarak sıvı azot içerisinde saklayın ve minus 80 degrees Celsius'ta depolayın. Ardından, 20 gram bitki dokusunu ve sıvı azotu bir havan ve eli yardımıyla öğütün; 20 gram dokuya 80 milliliters soğuk tampon C ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözdürün.Şimdi tam hızda, her biri 10 saniye süren üç kısa işlemle homojenize edin. Homojenatı süzün ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 G'de santrifüjleyin. Bu sırada, 100 µL uygun afinite matrisini, 500 µL soğuk bloklama tamponu D ile 4 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve 1 mL soğuk tampon D ile üç kez yıkayın. Ardından, yaprak özütünün süpernatantını uzaklaştırın ve 0,45 µm'lik bir şırınga filtresinden geçirin.Buz üzerinde yeni bir tüpe filtreleyin. Ham ekstraktı alikotlayın. Bir immünoblot için.Beş XSDS sayfa yükleme tamponu ekleyin, vortexleyin ve denatüre etmek için örnekleri kaynatın. Her tüpe, tampon D içinde süspansiyon halindeki 50 mikrolitre afinite matrisi ekleyin. Dört derece santigrat sıcaklıkta, hafif rotasyonla iki saat boyunca inkübe edin; afinite matrisini çöktürmek için santrifüjleyin.Ardından, immünoblot için bağlanmamış ekstrakttan bir alikot alın. Tüpün dibinde yaklaşık 500 µL kalacak şekilde geri kalanını atın. Slurry çözeltisini geniş ağızlı bir uçla yeniden süspande edin.Her iki tüpteki karışık süspansiyon çözeltisini tek bir 1,5 mililitrelik tüpte birleştirin. Afinite matrisini çöktürmek için bir masaüstü santrifüj kullanarak beşer saniyelik üç kısa hızlandırma (pulse) yapın ve bir mililitre soğuk tampon D ile üç ila beş yıkama yaptıktan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Fazla tampon D'yi bir şırınga iğnesiyle çekin ve sürekli çalkalama altında 200 mikrolitre uygun elüsyon tamponu ile elüsyon yapın. Üç EIT'yi tek bir tüpte toplayın.Ardından, 30 µL adsorpsiyon reçinesi kullanarak proteinleri konsantre edin ve vorteksleyin. Beş dakika bekletip reçineyi çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın. Çöktürülen afinite matrisine veya adsorpsiyon reçinesi vorteksine 50 µL 1X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin ve bir ısı bloğu santrifüjünde 80 ila 100 °C'de 10 dakika boyunca kaynatın.Kaynatılmış afinite matrisi, 10.000 hızında iki dakika boyunca santrifüj edilir. İmmün blokaj için süpernatanttan beş µL alınır ve diğer fraksiyonlarla birlikte, fosforile proteinlerin ayrıştırılması ve kütle spektrometrisi ile tanımlanması için 10 cm uzunluğunda bir SDS-PAGE jeline yüklenir.Kalan 45 µL'yi SDS-PAGE jeline yükleyin. SDS-PAGE jelini kolloidal Coomassie Brilliant Blue ile boyayın. Ardından jeli, tercihen gece boyunca, bol su ile yıkayarak boyasını giderin.Şimdi temiz bir bisturi ile ilgilenilen bandı jelden kesin, jel dilimini iki ila dört milimetrelik küpler şeklinde doğrayın ve örneği bir tüpe aktarın. Jel parçalarını, boya tamamen gidene kadar %50 asetonitril ve 50 millimolar amonyum bikarbonat ile yıkayın. Ardından çözeltiyi pipetle çekerek uzaklaştırın.Jel parçalarının çıkmamasına dikkat ederek, örneği %100 asetonitril ile beş dakika boyunca dehidrate edin ve serbest sıvıyı uzaklaştırın. Ardından, protein disülfür bağlarını indirgemek için 10 millimolar DTT ekleyin ve 56 °C'de, çalkalayarak 30 ila 45 dakika boyunca inkübe edin; sistein kalıntılarını alkilleştirmek için serbest sıvıyı şimdi uzaklaştırın.Oda sıcaklığında, karanlıkta 20 ila 30 dakika boyunca 55 millimolar kloroasetamid ekleyin. Serbest sıvıyı uzaklaştırın, ardından jel parçalarını 10 dakika boyunca %50 asetonitril ile iki kez yıkayın. Serbest sıvıyı uzaklaştırın.Şimdi jel parçalarını %100 asetonitril ile beş dakika boyuncayedehidre edin ve Triptik Sindirim için serbest sıvıyı uzaklaştırın. 40 µL tripsin çalışma çözeltisi kullanarak, jel parçalarının jel parçalarını kaplayacak kadar sindirim tamponu içinde 10 dakika boyunca rehidre olmasına izin verin. Sindirimi durdurmak için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve peptidleri jel parçalarından çıkarmak için %5 formik asit ile beş ila 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın.Ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın, peptitleri liyofilizasyon veya vakumlu konsantratör ile kurutun ve örnekleri -20 °C'de saklayın. Bu deney, nacoa hamana'dan P-R-F-P-T-O kinaz kompleksini saflaştırmaktadır. 35 SPTO eksprese eden transgenik bir NACOA hamana, 35 SPRF flag ile geçici olarak transforme edilmiş ve kompleks Anti-Flag M iki aros ile immünopresipite edilmiştir. İmmünoblotlar, antikor tespiti ve kütle spektrometrisi analizi ile belirtildiği üzere, hedeflenen PRF proteininin etkili bir şekilde immünopresipite edildiğini, hem PTO'nun hem de etkileşen efektör proteinin PRF ile birlikte saflaştırıldığını göstermektedir.Burada strateji, PTO proteinini Anti-Flag ile hedeflemekti. PTO fosforilasyon bölgelerini belirlemek amacıyla strateji değiştirildi.Hem PRF kompleksini hem de serbest formu içeren toplam PTO proteini miktarı, Anti-Flag M iki antikoru ile immünopresipite edilmiş ve SDS page fraksiyonlamasına, jel içi tripsin sindirimine ve kütle spektrometrik analizine tabi tutulmuş; bu işlemler, sekansının yaklaşık %80'ini kapsayan PTO peptidleri ile sonuçlanmıştır. İlginç bir şekilde, PTO peptidleri için bir dizi tekli fosforilasyon bölgesi tanımlanmıştır. Çift fosforilasyon bölgelerinin ise yalnızca efektör proteinlerin varlığında tanımlandığına dikkat edilmelidir.Bir protein kompleksinin bileşenlerini tanımlamak ve ayrıca ilgilenilen bir proteinin translasyon sonrası modifikasyonunu tespit etmek için yeterli miktarda bitki proteini elde etmek önemlidir. Fosforilasyon gibi modifikasyonların haritalanmasının kütle spektrometrisi için makul miktarda protein gerektirdiğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürün ardından jelinizde en azından sönük bir bandın görülmesi gerekir. İmmün kompleks aktivasyonunun fonksiyonel bağışıklığa nasıl yol açtığı gibi ek soruları yanıtlamak için, kompleks bileşenlerinin tanımlanması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Organik tamponlar, bakteriler ve jiletli BBL'ler ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemler alın.

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Öğrenin, bitki protein komplekslerinde çeviri sonrası değişiklikleri immünopresipitasyon ve kütle spektrometrisi kullanarak nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, fosforilasyon sitelerinin tespitini kolaylaştırır.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Daha fazla video keşfet