Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, öncelikle bitkilerde geçici veya stabil olarak ifade edilen, ilgi duyulan proteinin etiketlendiği bitki protein komplekslerinde yer alan proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlarını belirlemektir. Ardından, bitki dokusundan toplam proteinler ekstrakte edilir ve ilgi duyulan protein immünopresipite edilir. Sonrasında, immünopresipite edilen proteinler bir akrilamid jel üzerinde ayrılır; ilgili jel bandındaki proteinler ekstrakte edilir ve sindirilir.

Şimdi protein örneklerini kütle spektrometrisi için gönderin. Nihayetinde, kütle spektrometrisi sonuçları, fosforilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlardaki dinamik değişiklikleri tespit edebilir. Kinazın substrat ile in vitro inkübasyonu gibi alternatif yöntemlerin aksine, bu yöntem proteinleri planter içinde eksprese eder.

Böylece hangi kinazın fosforilasyondan sorumlu olduğunu bilmenize gerek kalmaz. Bu yöntem; stres, çevresel değişiklikler veya patojen tanımaya yanıt olarak sinyallerin nasıl iletildiği gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aktive olmuş direnç proteini komplekslerinin fosforilasyon bölgelerinin tanımlanmasının yanı sıra, bu yöntem herhangi bir bitki protein kompleksinin herhangi bir post-translasyonel modifikasyonuna geniş bir şekilde uygulanabilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, büyük miktarda ekstrakt ile çalışmaya ve protokolün daha fazla adımını tek bir günde gerçekleştirmeye alışkın olmadıkları için zorluk yaşayacaklardır. Geçici ekspresyon için, agrobacterium tohin suşlarını stasyoner fazda büyütün. Agrobakterileri 3000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek hasat edin.

Peletleri ve infiltrasyon tamponunu resüspande edin. Dört haftalık NCOA Nicotiana benthamiana bitkilerini, agrobakterilerle bir mililitrelik iğnesiz şırınga kullanarak manuel olarak veya %0,02 sürfaktan içeren vakum yöntemiyle infiltre edin; infiltrasyonu takip eden iki ila beş gün bekleyin.

İnfiltre edilmiş yaprakları hasat edin, dondurarak sıvı azot içerisinde saklayın ve minus 80 degrees Celsius'ta depolayın. Ardından, 20 gram bitki dokusunu ve sıvı azotu bir havan ve eli yardımıyla öğütün; 20 gram dokuya 80 milliliters soğuk tampon C ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözdürün.

Şimdi tam hızda, her biri 10 saniye süren üç kısa işlemle homojenize edin. Homojenatı süzün ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 G'de santrifüjleyin. Bu sırada, 100 µL uygun afinite matrisini, 500 µL soğuk bloklama tamponu D ile 4 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve 1 mL soğuk tampon D ile üç kez yıkayın. Ardından, yaprak özütünün süpernatantını uzaklaştırın ve 0,45 µm'lik bir şırınga filtresinden geçirin.

Buz üzerinde yeni bir tüpe filtreleyin. Ham ekstraktı alikotlayın. Bir immünoblot için.

Beş XSDS sayfa yükleme tamponu ekleyin, vortexleyin ve denatüre etmek için örnekleri kaynatın. Her tüpe, tampon D içinde süspansiyon halindeki 50 mikrolitre afinite matrisi ekleyin. Dört derece santigrat sıcaklıkta, hafif rotasyonla iki saat boyunca inkübe edin; afinite matrisini çöktürmek için santrifüjleyin.

Ardından, immünoblot için bağlanmamış ekstrakttan bir alikot alın. Tüpün dibinde yaklaşık 500 µL kalacak şekilde geri kalanını atın. Slurry çözeltisini geniş ağızlı bir uçla yeniden süspande edin.

Her iki tüpteki karışık süspansiyon çözeltisini tek bir 1,5 mililitrelik tüpte birleştirin. Afinite matrisini çöktürmek için bir masaüstü santrifüj kullanarak beşer saniyelik üç kısa hızlandırma (pulse) yapın ve bir mililitre soğuk tampon D ile üç ila beş yıkama yaptıktan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Fazla tampon D'yi bir şırınga iğnesiyle çekin ve sürekli çalkalama altında 200 mikrolitre uygun elüsyon tamponu ile elüsyon yapın. Üç EIT'yi tek bir tüpte toplayın.

Ardından, 30 µL adsorpsiyon reçinesi kullanarak proteinleri konsantre edin ve vorteksleyin. Beş dakika bekletip reçineyi çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın. Çöktürülen afinite matrisine veya adsorpsiyon reçinesi vorteksine 50 µL 1X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin ve bir ısı bloğu santrifüjünde 80 ila 100 °C'de 10 dakika boyunca kaynatın.

Kaynatılmış afinite matrisi, 10.000 hızında iki dakika boyunca santrifüj edilir. İmmün blokaj için süpernatanttan beş µL alınır ve diğer fraksiyonlarla birlikte, fosforile proteinlerin ayrıştırılması ve kütle spektrometrisi ile tanımlanması için 10 cm uzunluğunda bir SDS-PAGE jeline yüklenir.

Kalan 45 µL'yi SDS-PAGE jeline yükleyin. SDS-PAGE jelini kolloidal Coomassie Brilliant Blue ile boyayın. Ardından jeli, tercihen gece boyunca, bol su ile yıkayarak boyasını giderin.

Şimdi temiz bir bisturi ile ilgilenilen bandı jelden kesin, jel dilimini iki ila dört milimetrelik küpler şeklinde doğrayın ve örneği bir tüpe aktarın. Jel parçalarını, boya tamamen gidene kadar %50 asetonitril ve 50 millimolar amonyum bikarbonat ile yıkayın. Ardından çözeltiyi pipetle çekerek uzaklaştırın.

Jel parçalarının çıkmamasına dikkat ederek, örneği %100 asetonitril ile beş dakika boyunca dehidrate edin ve serbest sıvıyı uzaklaştırın. Ardından, protein disülfür bağlarını indirgemek için 10 millimolar DTT ekleyin ve 56 °C'de, çalkalayarak 30 ila 45 dakika boyunca inkübe edin; sistein kalıntılarını alkilleştirmek için serbest sıvıyı şimdi uzaklaştırın.

Oda sıcaklığında, karanlıkta 20 ila 30 dakika boyunca 55 millimolar kloroasetamid ekleyin. Serbest sıvıyı uzaklaştırın, ardından jel parçalarını 10 dakika boyunca %50 asetonitril ile iki kez yıkayın. Serbest sıvıyı uzaklaştırın.

Şimdi jel parçalarını %100 asetonitril ile beş dakika boyuncayedehidre edin ve Triptik Sindirim için serbest sıvıyı uzaklaştırın. 40 µL tripsin çalışma çözeltisi kullanarak, jel parçalarının jel parçalarını kaplayacak kadar sindirim tamponu içinde 10 dakika boyunca rehidre olmasına izin verin. Sindirimi durdurmak için 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve peptidleri jel parçalarından çıkarmak için %5 formik asit ile beş ila 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın.

Ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın, peptitleri liyofilizasyon veya vakumlu konsantratör ile kurutun ve örnekleri -20 °C'de saklayın. Bu deney, nacoa hamana'dan P-R-F-P-T-O kinaz kompleksini saflaştırmaktadır. 35 SPTO eksprese eden transgenik bir NACOA hamana, 35 SPRF flag ile geçici olarak transforme edilmiş ve kompleks Anti-Flag M iki aros ile immünopresipite edilmiştir. İmmünoblotlar, antikor tespiti ve kütle spektrometrisi analizi ile belirtildiği üzere, hedeflenen PRF proteininin etkili bir şekilde immünopresipite edildiğini, hem PTO'nun hem de etkileşen efektör proteinin PRF ile birlikte saflaştırıldığını göstermektedir.

Burada strateji, PTO proteinini Anti-Flag ile hedeflemekti. PTO fosforilasyon bölgelerini belirlemek amacıyla strateji değiştirildi.

Hem PRF kompleksini hem de serbest formu içeren toplam PTO proteini miktarı, Anti-Flag M iki antikoru ile immünopresipite edilmiş ve SDS page fraksiyonlamasına, jel içi tripsin sindirimine ve kütle spektrometrik analizine tabi tutulmuş; bu işlemler, sekansının yaklaşık %80'ini kapsayan PTO peptidleri ile sonuçlanmıştır. İlginç bir şekilde, PTO peptidleri için bir dizi tekli fosforilasyon bölgesi tanımlanmıştır. Çift fosforilasyon bölgelerinin ise yalnızca efektör proteinlerin varlığında tanımlandığına dikkat edilmelidir.

Bir protein kompleksinin bileşenlerini tanımlamak ve ayrıca ilgilenilen bir proteinin translasyon sonrası modifikasyonunu tespit etmek için yeterli miktarda bitki proteini elde etmek önemlidir. Fosforilasyon gibi modifikasyonların haritalanmasının kütle spektrometrisi için makul miktarda protein gerektirdiğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürün ardından jelinizde en azından sönük bir bandın görülmesi gerekir. İmmün kompleks aktivasyonunun fonksiyonel bağışıklığa nasıl yol açtığı gibi ek soruları yanıtlamak için, kompleks bileşenlerinin tanımlanması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Organik tamponlar, bakteriler ve jiletli BBL'ler ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemler alın.