Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

Bu prosedürün genel amacı, drosophila'nın sıcaklık tercihini belirlemektir. Bu, önce sineklerin ve sıcaklık kontrollü bir alüminyum tabanın etrafına monte edilen aparatın hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Aparatta sıcaklıklar belirlendikten sonra, bir sinek kohortu yüklenir ve yarım saat sonra sıcaklık tercihleri puanlanır.

Sonuç olarak, tahlil çok çeşitli deneysel koşullarla kullanılabilir. Örneğin, sıcaklık tercihinin sirkadiyen ritimleri. Bu yöntem, hedef ritimler alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Sıcaklık tercihinin bu hedef ritimleri, lokomotif aktivitesininkinden farklı mekanizmalar tarafından kontrol edildiğinden, bu davranış testi, lokomotif aktivite yaklaşımları kullanılarak daha önce tanımlanmayan yeni moleküler ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasına yol açacaktır. Bu yöntem aynı zamanda sıcaklık ve ağrı hissi gibi duyusal sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına da yardımcı olabilir. Bu sıcaklık davranışsal tahlilleri çok sağlam olduğu için, bu tahlil, sıcaklık tespitinden işlemeye kadar nöral devreyi haritalamamıza izin verecek ve bu da duyusal entegrasyon hakkında daha fazla bilgi edinmemizi sağlayacaktır.

Sinekleri 1212 açık karanlık döngü ile nemlendirilmiş inkübatörlerde kaldırın. Bu protokol, zıt programlara ayarlanmış bu tür iki inkübatör gerektirir. Gece inkübatörü normal çalışma saatleri boyunca karanlık olmalıdır.

Gece döngüsü sırasında bir kuluçka makinesine erişirken, kuluçka makinesini aydınlatmak için kırmızı ışık kullanın. Her iki cinsiyetten 20 ila 30 yeni yumurtadan çıkmış sinek kohortlarını toplayın ve herhangi bir oranda, tahlilde çalıştırmadan önce iki ila üç gün boyunca kuluçka makinelerinde tutun. Test edilen her koşul için en az beş kohort gereklidir.

Bir sıcaklık tercihi test odası oluşturmak için, plakanın altındaki bir alüminyum plakaya uyacak şekilde bir pleksiglas kapak tasarlanmalıdır. Dört adet peltier cihazı yerleştirin. Peltier cihazlarının her biri, pelterlerin aşırı ısınmasını önlemek için soğuk veya sıcak sıcaklıklar üretebilen sıcaklık kontrol cihazlarına bağlanmalıdır.

Alüminyum plaka üzerindeki sıcaklıkları izlemek için su borularına, hava soğutma fanlarına ve güç kaynaklarına bir bilgisayar soğutma sistemi bağlanır. Sıcaklık probları, alüminyum plakanın kenarına gömülüdür ve sıcaklık kontrol cihazlarına bağlanır. Plakanın soğuk ve sıcak taraflarını kapakta sırasıyla 12 ve 36 santigrat dereceye ayarlayın.

Şeritlerden birinde çeşitli konumlara altı sıcaklık probu takın. Cihazı, 25 santigrat derecede ve %65 ila %75 bağıl nem arasında, çevre tarafından kontrol edilen bir odaya yerleştirin. Bu koşulları izlediğinizden emin olun.

Oda, dolaşan herhangi bir havanın sıcaklığı dengesizleştirmesini önlemek için ışık kontrolüne ve iyi hava sirkülasyonuna sahip olmalıdır. Gradyan, test alanını bir duş perdesi ile koruyun. Cihaz üzerinde tek tip ışık kullanılmalıdır, çünkü parlaklık sıcaklık tercihini etkileyebilir.

Cihazı en az 30 dakika açın. Plakanın yüzeyinde sabit bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için. Sineklerin kapağın duvarlarına veya tavanına tırmanmasını önlemek için davranış aparatının kapağını bir su itici ile kaplayın.

Fazla su iticisini silin ve gerekirse kapağı 25 ila 30 dakika sürmeye bırakın, yarım saat sonra çift yapışkanlı bant kullanılabilir. Alüminyum plakadaki yoğuşmayı silin. Ardından pleksiglas kapağı alüminyum plakanın üzerine yerleştirin ve altı C kelepçe ile sabitleyin.

Kapağın sızdırmaz olması çok önemlidir. Plaka ve kapak arasındaki hava sıcaklığını iyi izleyin. Probların alüminyum plakaya veya pleksiglas kapağa temas etmediğinden emin olun.

Kapağın plaka üzerinde en az 15 dakika dengelenmesine izin verin. Sonunda, alüminyum levha ve kapak arasındaki hava sıcaklığı gradyanı 18 ila 32 santigrat derece arasında değişecektir. Bir günlük davranış deneyi durumunda, sinek şişelerini günlük inkübatöründen çıkarın ve davranışsal tahlili bir gece davranışsal deneyinden hemen önce ışıkta test edin. Sinek şişelerini gece inkübatörden çıkarın.

Onları folyoya sarın ve karanlık odada kırmızı bir lambanın altındaki bir kutuya koyun. Karanlık dönemlerde yapılan deneyler için, davranışsal deneyler tamamlanana kadar oda ışıkları her zaman kapalı kalmalıdır. Bununla birlikte, aspirasyon kullanarak aydınlatma için kırmızı lambalar kullanılabilir.

Alüminyum plaka arasındaki boşluğa 20 ila 25 sinek yükleyin. Daha sonra sineklerin kaçmasını önlemek için delikleri kapak fişleri ile kapatın. Sineklerin 30 dakika hareket etmesine izin verin.

Deney tamamlandığında, ışık deneyleri için en az iki fotoğraf çekin. Karanlık deneyler için bir flaş kullanılması gerekir. Cihazın sıcaklığını kontrol edin.

Sinekleri uyuşturmak, sinekleri atmak için cihazın üstündeki deliğin yanındaki sineklere bağlı karbondioksit tüpünü çıkarmak için oda sıcaklığının yanı sıra nemi de not edin. Tekrar test edilmemelidirler. Ardından, plakadaki yoğuşma veya nemi silin.

Plakanın üzerindeki kapağı değiştirin ve hazırlık aşamasında kelepçelerle sıkın. Bir sonraki deney için sıcaklık gradyanını aşağıdaki gibi hesaplayın. İlk olarak, prob konumlarına ve kaydedilen sıcaklıklarına bağlı olarak bir cetvel kullanarak sıcaklık problarının nereye yerleştirildiğini belirleyin. Sineğin son konumunun fotoğrafında uygun konumdaki her bir sıcaklık derecesini temsil eden düz çizgiler çizin.

Ardından, her bir santigrat derece aralığı arasındaki sinek sayılarını sayın. Duvarlardaki veya kapağın tavanındaki sinekleri hariç tutun. Her şeridin her bir sıcaklık aralığındaki sineklerin yüzdesini ve ardından her koşul için tercih edilen ortalama sıcaklığı hesaplayın.

En az beş denemeden veri toplayın. Ardından, hatalarla tercih edilen ortalama sıcaklığı belirlemek için her denemenin ortalama değerlerini kullanın. 25 santigrat derecede yükselen normal sinekler, sabahları akşama göre daha düşük bir sıcaklığı tercih eder.

Gündüz sıcaklık tercihinde bir ila 1.5 derece artış ve 1.5 ila iki santigrat derece ölçüldü. Gündüzden geceye geçişte azalma görüldü. Tahlil, mutant sinekleri test etmek için de kullanılabilir.

Örneğin, yolculukta kusurlu bir mutasyon taşıyan sineklerin sıcaklık tercihinin, bir iyon kanalının kontrollerinkinden daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, sıcaklık tercihi davranış testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntem, moleküler mekanizmaların ve nöro devrelerin, ofa ve saatlerin araştırılmasına ve beynin farklı çevresel ipuçlarını ve biyolojik saatlere nasıl entegre ettiğine izin verir.