Name: Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin mikrofabrikasyon kanalları kullanarak hücre göçünü nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem, dendritik hücrelerin hız farklılıklarını analiz ederek kontrollü ortamda davranışları detaylı şekilde değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ölçüde Institut Curie&#39;nin (CNRS UMR144) de PICT Ibisa platformu kabul. Bu çalışma hibe tarafından finanse edildi: AM.LD için Avrupa Araştırma Konseyi (Strapacemi 243.103), Dernek Nationale la Recherche (ANR-09-PİRİ-0027-PCVI), InnaBiosanté vakıf (Micemico) MP ve PM dökün. AM.LD. LD ve ERC Strapacemi genç araştırmacı hibe

Önemli not: Bu protokol, istenen mikrokanalların şeklini içeren kalıp zaten yapılmış olduğunu varsayar. Kalıbın hazırlanması hakkında daha fazla bilgi 10, daha önce yayınlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kemik iliği DH&#39;leri kültürü bilindiğini varsayar. 1.. Chip Fabrikasyon <ol><li> Plastik bir kap içinde bir ağırlık oranı 10:1 PDMS yağ ve sertleştirme maddesi karıştırın. İyice her iki bileşiği karıştırın. </li><li> Kalıp yatak mikrokanalların üzerinde karışımı döküm. Toplam yüksekliği 0.5-1 cm arasında olmalıdır. </li><li> 1 saat boyunca bir vakum kavanoz çan hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> 65 ° C&#39;de 2 saat boyunca bir fırın içinde ikinci yerleştirerek küfü içinde katılaşmaya PDMS </li><li> PDMS oda sıcaklığında sonra, bir cerrahi bıçak ile yapı etrafında büyük bir parça kesilir ve kalıbın (Şekil 1A) onu soyulabilir. </li><li> Hücreleri enjekte edilecektir delik (tipik olarak 2 mm) bir matkap ve PDMS boyutlandırmagöç (Şekil 1B) değerlendirilecek olan cam alt yemekleri boyutuna uyması için bir cerrahi bıçak ile. Devam etmeden önce, temizleme kağıdı lens kullanarak yemeğin kalan toz kaldırmak. Bu aşama 1.10 tarif cam PDMS bağlayıcı yanadır. </li><li> Yapı tarafta yapışkan bant yapıştırma ve soyma kanalları içeren resized PDMS çipi temizleyin. </li><li> PDMS toz ve küçük parçacıkların ayrılması için% 70 etanol içinde PDMS parçaları da 30 saniye sonikasyon. Temiz hava üfleme hızla sonradan onları kurutun. </li><li> 300 mTorr 30 sn boyunca hava (veya oksijen) ile (yukarı yapılar) ve PDMS kültür kaplarına aktive plazma işleme. </li><li> Sürekli olarak alt-tabaka için, PDMS sopa temas halindeki her iki yüzey aktif yerleştirin. Eğer gerekirse, polimer ve çanak (Şekil 1C) ve cam arasındaki temas zorlamak için PDMS üstüne hafifçe basın metalik forseps kullanır. </li><li> 65 ° C de fo fırında çipi inkübebağlama güçlendirmek için r 1 saat. </li></ol> 2. Mikrokanallarda Kaplama <ol><li> 1 dakika boyunca 300 mTor hava plazma tarafından tüm yapıyı etkinleştirin. Bu, bir sonraki aşamada da kanal içine sıvının girişini teşvik edecektir. </li><li> Su içinde 10 ug / ml &#39;de hızlı bir fibronektin ile çipin giriş delikleri doldurun. PEG gibi diğer alt-tabakalar kanal duvarlarına hücre yapışmasını değiştirmek için kullanılabilir. Sıvı yapının tamamı yayılır dikkat ediniz. Bu kolaylıkla normal ışık altında ya da düzenli bir aydınlık alan mikroskobu kullanarak gözle kontrol edilebilir. NOT: difüzyon zor olan çok küçük yapılarda, kanallardaki sıvı girişi, en az 15 dakika boyunca bir vakum çan kavanoz yapıyı yerleştirerek zorlanabilir. Fluoresan alt-tabakalarını kullanılabilecek kaplama verimliliğini (Şekil 2) kontrol etmek için. </li><li> Fibronektin adsorpsiyonu ya da başka kaplama subst izin vermek için, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edinkanalların duvarlarına hızı. </li><li> Bu yapıların nonbound tabakayı uzaklaştırmak için PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, Protokol 3 geçin veya sonraki bir kullanım (24 saat maksimum) 4 ° C&#39;de çipi saklayın. </li></ol> 3. Hücre Yükleniyor <ol><li> Plaka PBS çıkarın ve hücre ortamı ile mikrosistem doldurun. Ortam ile kanal doyurmak için 1 saat boyunca inkübe olsun. NOT: molekül inhibitörleri gibi ilaçları içeren deneyler için, doğru konsantrasyonda ilaç ihtiva eden bir ortam maddesi ile kanal Preincubate için tavsiye edilir. Ayrıca, bazı ilaçlar, etkin konsantrasyonunu azaltan PDMS yapısında çözünür olma eğilimindedir. Bazı çözümler bu sorunu 11-12 karşı ileri sürülmüştür. </li><li> Yüzer DC&#39;ler çıkarın ve kültür ortamı ile yıkama ile, yarı-yapışkan hücreleri iyileşir. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. NOT: çekirdeği görüntüleme için, Hoechst 33342 boyama in tarafından önceden elde edilebilirtam ortam içinde 200 ng / ml &#39;de boya ile 30 dakika boyunca 2 x 10 6 hücre cubating. Protokolü devam etmeden önce boyanın fazlasının ayrılması için santrifüj ile iki kez yıkanır. </li><li> 5 dakika (zaman ve hız hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir) esnasında 300 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve orta atın. 20 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için topağı seyreltin. </li><li> Plakadan ortamın fazlalığını çıkarın ve bir mikropipet kullanılarak PDMS yapısındaki giriş delikleri boşaltın. Her giriş deliği 1 x 10 5 hücre bir miktarda ulaşmak için hücre çözümü 5 ul girdileri doldurun. NOT: Yüksek hücre yoğunluğu kanalları hücrelerin temas lehine için gereklidir. Düşük hücre yoğunluğu kanal ve deney hatası içinde hücre sayısı düşük neden olabilir. </li><li> Inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin mikroçip. Deney çanak tam ortam 2 ml ilave edilir. NOT: Bütün PDMS yapısı b gerekire deney sırasında hücrelerin kurumayı önlemek amacıyla kapalı. 2 ml yeterli değilse, tamamen PDMS yapısı karşılamak için daha fazla orta ekleyin. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Mikroskop altında plakaları yerleştirmeden önce bir objektif temizleme beziyle yemekleri dış alt yüzeyini temizleyin. </li><li> Hücrelerin çok sayıda geçiş analiz etmek için, bir CO2 ve ısı donanımlı video mikroskop 10X büyütme ve geniş alan aydınlatma (Şekil 3) kullanın. Hücre izleme kolaylaştırmak için, Hoechst boyama ve UV ışığı (adım 3.2) de kullanılabilir. Göç aynı zamanda göç sırasında hücresel yapıların daha yüksek çözünürlük elde etmek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz olabilir. </li><li> 10X de zaman atlamalı mikroskobu için, beklenen hücre hızında (5 mm / dk &#39;lık bir hız ile göç eden dendritik hücreler tipik olarak 2 dakika)&#39; e uygun bir zaman frekansı seçin. Not: Burada açıklanan protokol n yaparot hücre göçü parametrelerin analizini içerir. Birkaç puan time-lapse film bilgileri ayıklamak için nasıl devam için okuyuculara tavsiye tartışma listelenmiştir. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tek deneylerde hücre sayıda göç özelliklerini incelemek için bir yöntem olarak mikro oluşan bir cihaz tarif etmektedir. Bu deneysel sistem endojen göçmen hücreler tarafından dokularda bulunan sınırlı çevresel kısıtlamalar taklit eder. Ancak, tek bir boyutta göç zorlayarak, otomatik hücre izleme ve measurables çıkarılması (Şekil 5) kolaylaştırır. Aynı zamanda cihaz floresan mikroskobu ile uyumlu olduğunu ve bu nedenle hücre motilitesini farklı aşamalarında (Şekil 4) boyunca bir or...

Göç gelişimi, bağışıklık yanıtı, doku rejenerasyonu ve da dahil olmak üzere çok-hücreli organizmada, pek çok fizyolojik süreçler için önemli olan bir kompleks hücresel fonksiyonudur. Buna ek olarak, bu tür tümör istilası ve metastaz gibi bazı patolojik durumlar, hücre motilitesi 1 dayanır. Bu nedenlerden dolayı, hücre göçü temel ve translasyonel hem araştırma bağlamında çalışmanın önemli bir alan haline gelmiştir. In vivo, çoğu dokuların zengin hücre-dışı matris ve yüksek hücre yoğunluğu ile karakterize edilir. Hücre göçü, bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, bir kompleks kapalı bir ortamda meydana gelir. Klasik, çoğu tarihsel nedenlerden dolayı ve teknik sınırları olasılığı, hücre göçü gibi hapsi olarak dokularda bulunan çevre özelliklerinin çoğunu yeniden yok düz 2D sistemlerinde çalışılmıştır. Ayrıca, 2B motilite için gerekli olan hücre yapışması gibi faktörler, son zamanlarda necessa olmayabilir gösterdi edilmiştirrily 2B ve diğer ortamlarda hücre lokomosyonu kural mekanizmaları 2 ayrı olduğunu öne sürerek, in vivo veya jellerin içinde göç için gerekli. Çeşitli hücre dışı matris sistemleri, bileşimin 3 özelliklerini yansıtan nişan dokuların, en ünlü olmak kollajen jel, karmaşık özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Burada kapalı bir ortamda bir boyutta çalışma hücre göçünü sağlayan basit bir tamamlayıcı bir yöntem olarak mikrokanalların öneriyoruz. Bu sistemde hücreler kendiliğinden girmek içine Mikrokanallar boyunca göç. Göç eden hücreler, daha sonra, büyük olasılıkla da bir polariteye güçlendiren boru şeklinde bir geometri benimseyerek, kanal şeklini kazanır. Kanallardaki hücrelerin doğrusal hareket otomatik hücre izleme ve deneylerden elde edilen kantitatif parametrelerin çıkarma sağlar. Görüş teknik açıdan bakıldığında, bu sistem kolay ve esnektir. Coatinkanal duvarlarının g kanalların boyutu ve şekli uyarlanabilir, manipüle edilebilir ve hücreler, çok sayıda tek deneylerde analiz edilebilir. Bu sistem aynı zamanda ölçekli yukarı olabilir hücre hareketi katılan moleküllerin orta menzilli ekran analizini gerçekleştirmek. Burada açıklanan protokol hücresel bir model olarak dendritik hücreler (DC) kullanılarak standardize edilmiştir. Bu 4.. In vitro, DCler kendiliğinden kapalı ortamlarda geçiş gösterilmiştir spesifik bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve bakım katılabilir ve bu nedenle mikro 5,6 hücre hareketliliği incelemek için iyi bir model olarak bu hücreler bağışıklık sistemi için anahtar . Önemli olarak, bu sistem, T lenfositler, nötrofiller, ya da tümör hücreleri 7-9 gibi başka bir hücre tipi hareketli göçünü analiz etmek için uzatılabilir.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td> <td>GE Silikonlar</td><td>RTV615</td><td>%90 silikon bazlı ve %10 kürleyici madde paketi</td></tr><tr><td>Çekirdek numune kesici</td><td>Ted Pella Int.</td><td>Harris Tek Çekirdekli</td><td>Çap 2,5 mm</td></tr><tr><td>Cam tabanlı çanak</td><td>WPI</td><td>Florodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici</td><td>Branson Ultrasonik</td><td>Branson 200</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC 32 G</td><td>Küçük numuneler için (35 tabak). Daha büyük bir versiyonu da mevcuttur</td></tr><tr><td>Sığır plazmasından fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PoliLizin aşılı PEG (Pll-g-PEG)</td> <td>Susos</td><td>PLL (20) -g [3.5] -PEG (5)</td><td></td></tr> <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

microfabricated kanallar hücre göç Çalışması

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Burada tarif edilen yöntem, bir boyutta kapalı alan içinde hücre göçü çalışma sağlar. Bu fiziksel kısıtlamaları ile hücrelere bir polarize fenotip empoze mikrofabrike kanalların kullanımına dayanmaktadır. Ileri ya da geri hareket: kanalların içine kez hücreler yalnızca iki olasılık var. Yön sınırlı olduğu bu basitleştirilmiş göç hücrelerinin otomatik izleme ve hücre hareketini tanımlamak için sayısal parametreler çıkarma kolaylaştırır. Bu parametreler, hareket esnasında hücre hız, yön değişimleri ve duraklar içerir. Mikro kanallar da floresan markerlerin kullanımı ile uyumludur ve yüksek çözünürlükte hücre geçiş sırasında, hücre içi organel ve yapıların lokalizasyonu incelemek için uygundurlar. Son olarak, kanalların yüzeyi kanallar ya da haptotaxis çalışma yapışkan özelliklerinin kontrol etmesine izin veren, farklı alt-tabaka ile fonksiyonalize edilebilir. Özet olarak, sistem here tarif bağımsız deneyin normalleştirme ve tekrarlanabilirlik kolaylaştırılması, geometri ve çevrenin biyo-kimyasal yapısı hem de kontrol edildiği koşullarda hücre sayıları büyük göçünü analiz etmek için tasarlanmıştır.

Her bir deneyde, PDMS yüzey çalışmanın ilgi uyarlanmış bir molekül ile kaplanır. Önce ve (adım 2.4) yıkandıktan sonra bir flüoresan molekül, PLL-PEG-g, kaplanmış Şekil 2, kanal Şekil. Böyle bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliği kontrol sağlar. Hücre Yükleme işleminden sonra, bir video mikroskobu hücre göçü takip gerçekleştirilebilir. Şekil 3A, DC hücreleri izlemek için uygun bir yoğunlukta mikro göç eden bir örneğini göstermektedir....

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kendiliğinden gerçekleşen kısıtlı hücre göçünü incelemek için mikro fabrikasyon kanallar hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle kanalları içeren polimetil SUBOXANE veya PDMS çipin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak kanallar, cihazın fonksiyonelleştirilmesini sağlayan fibronektin veya başka bir kaplama substratı ile kaplanır.Birkaç yıkama işleminin ardından, hücre göçünü incelemek için dendritik hücreler mikro sisteme yüklenir. Mikroskopi ve görüntü analizine dayalı olarak, farklı hücre tipleri veya uygulamalar için hız farklarını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin klasik iki boyutlu göç gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin geometrisi ve sınırlanmışlığı ile karşı karşıya gelmemizdir.Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, her bir adımda gereken hassasiyet nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Başlamak için, plastik bir karıştırma kabında PDMS yağı ve kürleme ajanını 10'a bir ağırlık oranında karıştırın, ardından her iki bileşikten oluşan karışımı mikro kanalların bulunduğu kalıbın üzerine tamamen dökün. Toplam yükseklik 0,5 ile 1 cm arasında olmalıdır.Bir vakum desikatöründe bir saat boyunca hava kabarcıklarını giderin, ardından PDMS'i 65 °C'deki bir fırında iki saat bekleterek kalıpta sertleştirin. PDMS oda sıcaklığına soğuduktan sonra, yapının etrafından cerrahi bir bıçakla geniş bir parça kesin ve kalıptan soyun. Daha sonra hücrelerin enjekte edileceği delikleri açın ve ardından PDMS'i, göçün değerlendirileceği cam tabanlı kaplara sığacak şekilde cerrahi bir bıçakla yeniden boyutlandırarak temizleyin.Yapışkan bantla yapı kenarlarından yapıştırılıp soyularak boyutlandırılan ve kanallar içeren PDMS çipin parçalarını, devam etmeden önce toz ve küçük PDMS partiküllerini uzaklaştırmak için %70 etanol içinde 30 saniye boyunca sonike edin. Kapta kalan tozları lens temizleme kağıdı kullanarak temizleyin.PDMS'yi ve kültür kaplarını 300 Milit'te 30 seconds boyunca hava plazma işlemiyle aktive edin; gerekirse PDMS'yi substrata kalıcı olarak yapıştırmak için her iki aktive yüzeyi birbirine temas ettirin. Polimer ile kabın camı arasındaki teması sağlamak için PDMS'nin üzerine metalik pensle hafifçe bastırın. Çipi fırında 65 degrees Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin.Bağlanmayı güçlendirmek için, tüm yapıyı 300 millitorr'da bir dakika boyunca hava plazması ile aktive edin. Bu işlem, bir sonraki adımda kanallara sıvı girişini kolaylaştıracaktır. Ardından, çipin giriş deliklerini hızla su içinde 10 µg/mL konsantrasyondaki fibronectin ile doldurun.Kanal duvarlarına hücre yapışmasını modifiye etmek için polietilen glikol gibi diğer substratlar kullanılabilir. Sıvının tüm yapıya yayıldığına dikkat edin. Bu durum, normal ışık altında gözle veya standart bir parlak alan mikroskobu kullanılarak kolayca kontrol edilebilir.Ardından, fibronectin veya herhangi bir diğer kaplama substratının kanal duvarlarına emilimini sağlamak için yapıyı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Son olarak, kanallardaki ve kaptaki tüm sıvıyı uzaklaştırarak bağlanmamış substratı temizleyin ve ardından yapıyı beş dakika boyunca taze fosfat tamponlu salin veya PBS içinde bekletin. PBS'yi plakadan uzaklaştırın ve mikrosistemi hücre besiyeri ile doldurun.Görüntüleme için hücre toplamak amacıyla, kanalları besiyeri ile doyurmak için plakayı bir saat boyunca inkübe edin. Yüzeyde yüzen dendritik hücreleri uzaklaştırın ve plakayı kültür besiyeri ile yıkayarak yarı yapışkan hücreleri geri kazanın. Hücreleri saymadan önce.Bir hemositometre kullanarak hücreleri 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin ve medyumu dökün. Peleti mililitrede 20 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde seyreltin. Plakadaki fazla medyumu uzaklaştırın ve PDMS yapısındaki giriş deliklerini boşaltın.Bir mikro pipet kullanın. Ardından, her bir giriş deliğinde 1 × 10⁵ hücre miktarına ulaşmak için girişleri beş µL hücre solüsyonu ile doldurun. Mikroçipi inkübatörde 37 °C'de 30 dakika inkübe ettikten sonra, görüntüleme için deney kabına iki mL tamamlayıcı besiyeri ekleyin.Öncelikle, plakaları mikroskobun altına yerleştirmeden önce kapların dış alt yüzeyini lens temizleme mendili ile temizleyin. Çok sayıda hücredeki migrasyonu analiz etmek için, hücre takibini kolaylaştırmak amacıyla CO2 ve sıcaklık kontrollü bir video mikroskobunda 10 x büyütme ve geniş alan aydınlatması kullanın. 10 x büyütmede time-lapse mikroskopi için metin protokolünde tartışıldığı üzere Hirsch boyaması ve UV ışığı kullanılabilir.Beklenen hücre hızına göre bir zaman frekansı seçin. Dakikada beş mikron hızla göç eden dendritik hücreler için bu süre tipik olarak iki dakikadır. Her deneyde, PDMS yüzeyi çalışmanın amacına uygun bir molekül ile kaplanır.Bu şekilde, kanallar floresan bir molekülle kaplanmıştır. Yıkama öncesi ve sonrası polilizin aşılanmış polietilen glikol gösterilmiştir. Bu tür bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliğinin kontrol edilmesini sağlar; hücre yüklemesinden sonra hücre göçünü takip etmek için video mikroskobu uygulanabilir.Burada, hücrelerin takibi için uygun bir yoğunlukta, mikro kanallarda göç eden dendritik hücrelere bir örnek verilmiştir. Bu amaçla hem faz kontrast hem de hersch boyaması kullanılabilir. Teknik ayrıca, daha yüksek çözünürlükte floresan konfokal mikroskopi ile de uyumludur ve life act GFP eksprese eden göç eden dendritik hücrelerdeki polimerize aktin dinamiğinde gösterildiği gibi organellerin veya hücresel yapıların takibi için kullanılabilir.Göç eden dendritik hücrelerde analiz edilen hücre motilitesinin kantifikasyonuna bir örnek burada gösterilmiştir. Wild type veya Y 27 632 dihidroklorür uygulanmış dendritik hücrelerden elde edilen kuvvet, ilacın hücre kontraktilitesi ve migrasyonunun iyi karakterize edilmiş bir inhibitörü olduğunu göstermekte ve hızdaki değişiklikleri tespit etme yeteneğini doğrulamak için kullanılmıştır. Hücrenin konumunu ve boyutunu zamanın bir fonksiyonu olarak çıkarmak için kog daha ileri düzeyde analiz edilebilir; bu da hücre migrasyonunu tanımlayan farklı parametrelerin çalışılmasına olanak tanır.Göç hızı, yerel olarak geliştirilen bir yazılım kullanılarak çekirdek konumunun görüntülenmesiyle takip edilmiştir. Dendritik hücreler, dakikada yaklaşık altı mikron olan bir ortalama hıza sahiptir. İlaçla tedavi, bu hücrelerin hızını önemli ölçüde azaltmaktadır.Bu örnek, tek bir deneyde çok sayıda hücrenin miktar tayinine olanak tanıyan tekniğin gücünü ve sistemin ilaç tedavileri tarafından indüklenen farkları tespit etmedeki yararlılığını göstermektedir. Burada gösterilen teknik, geliştirilmesinin ardından doğru şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra üç saat içinde tamamlanabilir. Bu teknik, migrasyon alanındaki araştırmacıların hücre lokomosyonunu kontrollü ve sınırlı ortamlarda incelemesinin önünü açmıştır.

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Hücre göçü, insan gelişiminin ve yaşamının önemli bir parçasıdır. Hücre göçünü değiştirebilecek mekanizmaları anlamak için, mevcut tahlillerin modern difüzyon odası sınırlamalarının üstesinden gelmeye izin veren bir 3D kollajen matrisinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel bir gradyan difüzyon sistemi sunuyoruz.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Elektrotaksi çalışmasında kullanılmak üzere birçok mikroakışkan cihaz geliştirilmiştir. Yine de, bu çiplerin hiçbiri, hücreler üzerindeki eşzamanlı kimyasal ve elektrik alan (EF) etkilerinin verimli bir şekilde incelenmesine izin vermez. Elektrotaksi araştırmalarında kullanılmak üzere daha iyi kontrol edilen bir arada bulunan EF ve kimyasal stimülasyon sunan polimetilmetakrilat bazlı bir cihaz geliştirdik.

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Kimyasal ve oksijen gradyanlarının kontrolü hücre kültürleri için esastır. Bu makale, hücre göçü çalışmaları için kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonlarını güvenilir bir şekilde üretebilen ve karmaşık enstrümantasyon olmadan biyolojik laboratuvarlarda pratik olarak kullanılabilen bir polidimetilsiloksan-polikarbonat (PDMS-PC) mikroakışkan cihazını bildirmektedir.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Granül hidrojellerin arayüzü içinde ve içine 3D hücre göçünün kantitatif değerlendirmesi için bir protokol burada sunulmaktadır.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Öğrenin mikrofabrikasyon kanalları kullanarak hücre göçünü nicel olarak incelemeyi. Bu yöntem, dendritik hücrelerin hız farklılıklarını analiz ederek kontrollü ortamda davranışları detaylı şekilde değerlendirmeyi sağlar.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Daha fazla video keşfet