Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Bu prosedürün genel amacı, hücre tabanlı bir akış sitometrisi deneyi kullanarak antijenle spesifik CD8 T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini ölçmektir. Bu işlem, ilk olarak efektör CD8 T hücrelerinin ilgili peptid varlığında altı gün boyunca genişletilmesiyle gerçekleştirilir; ikinci adımda hedef CD4 T hücreleri ilgili peptid ile pulse edilir ve ardından pulse edilmemiş CD4 T hücreleri ile karıştırılır. Sonrasında, efektör CD8 T hücreleri ve hedef CD4 T hücreleri, farklı efektör-hedef oranlarında altı saat boyunca birlikte kültüre edilir.

Son adımda, peptid yüklü hedef CD4 T hücrelerinin öldürülmesi ve efektör CD8 T hücrelerinin sayısı akış sitometrisi ile nicelendirilir. Nihayetinde, litik birimler cinsinden ifade edilen antijene özgü CD8 T hücrelerinin doğal öldürme kapasitesi hesaplanabilir. Bu tekniğin, kromatin salınım testi gibi yöntemlere kıyasla temel avantajları; ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yerine otolog primer hedef hücrelerin ve gerçek hedef hücrenin kullanılmasıdır.

Buna ek olarak, efektör hücre sayıları tek hücre düzeyinde ölçülebilir. Şimdi, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi CD8 pozitif efektör hücreleri izole etme prosedürünü gösterecektir. İşleme, otolog kriyoprezerve PBMC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözerek başlayın ve ardından hücreleri 50 mL'ye kadar tam medyada yıkayın.

Sayım işleminden sonra, PBMC'leri komple medyada mililitre başına 5 milyon hücre konsantrasyonunda seyreltein ve ardından kültüre IL-2 ile ilgili peptidi ekleyin. Sonrasında, hücre süspansiyonunun bir mililitresini 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Üç günlük kültür süresinden sonra, süpernatantın yarısını taze komple medya ile değiştirin. Altı günlük kültür süresinin ardından, hücreleri steril bir rezervuara aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından hücreleri sayın ve yıkayın.

Pelleti, ayırma tamponu içerisinde mililitrede 50 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve PBMC'leri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüp içerisinde, mililitre hücre başına 50 µL oranında insan CD8 pozitif T-hücresi zenginleştirme kokteyli ile oda sıcaklığında inkube edin. 10 dakika sonra, hücreleri 150 µL/mL oranında anti-CD8 IgG konjuge manyetik partiküller ile beş dakika daha inkube edin ve ardından hücre süspansiyonunu ek ayırma tamponu ile yedi mililitreye tamamlayın. Tüpü ayırma mıknatısına yerleştirin; beş dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Ardından, hücrelerin küçük bir alikotunu %2 FBS ile desteklenmiş PBS içerisinde, CD3 ve CD8'e karşı antikorlar ile 4 °C'de 30 dakika boyunca boyayın.

Akış sitometrisi ile hücre saflığının %95 CD8 pozitif veya daha yüksek olduğunu doğrulayın. Şimdi beş adet vidalı kapaklı tüpe 225 µL komple besiyeri ekleyin ve ardından hücreleri 1'den 2'ye, 1'den 32'ye kadar seri olarak dilüe edin. CD4 pozitif hedef hücreleri izole etmek için, otolog kriyoprezerveli PBMC'lerin 37 °C su banyosunda çözülmesiyle başlayın.

Çözülmüş hücreleri, 10 mL besiyeri içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Az önce gösterildiği gibi manyetik partikül ayırma yöntemiyle CD4 eksprese eden T hücrelerini zenginleştirin ve akış sitometrisi ile CD4 pozitif T hücrelerinin %95 veya daha yüksek bir saflıkta olduğunu doğrulayın. Hücreleri saydıktan sonra, iki adet 15 mL'lik konik tüpe paylaştırın ve ardından ılık PBS ile yıkayın; peletleri PBS içinde mL başına 20 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.

Hücrelerin ışıktan korunduğundan emin olduktan sonra, CD4 pozitif T hücrelerinin yarısını taze hazırlanmış CFSE yüksek çalışma çözeltisi ile 0,2 millimolar nihai konsantrasyona, diğer yarısını ise taze hazırlanmış CFSE düşük çalışma çözeltisi ile 0,04 millimolar nihai konsantrasyona, %5CO2 içeren 37 °C'de 15 dakika boyunca boyayın. Boyama süresinin sonunda, hücreleri santrifüjle çöktürün ve markalama reaksiyonunu durdurmak için peletleri bir mililitre ılık tam besiyerinde yeniden süspande edin. CFSE düşük CD4 pozitif T hücrelerini, hücre kültürü inkübatöründe, tam besiyeri içerisinde ilgili peptidin 5 µg/mL nihai konsantrasyonu ile 45 dakika boyunca pulse edin.

İnkübasyondan sonra hem CFSE yüksek hem de düşük T-hücre popülasyonlarını yıkayın. Her iki hücre süspansiyonunu da mililitre başına 200.000 hücre olacak şekilde iki kez eksik besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, iki hedef popülasyonu bir-bir oranında (CFSE yüksek/CFSE düşük) karıştırın.

Şimdi, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 100 µL karışık hedef CD4 pozitif T hücresi ekleyin; ardından her kuyucuk başına toplam 200 µL hacme ulaşacak şekilde, her bir CD8 pozitif T hücresi süspansiyonundan birer mikrolitreyi çift örneklü olarak ekleyin. Bazal apoptozu ölçmek için üç kuyucuğu yalnızca hedef hücrelerle ekin ve ardından ko-kültürü hücre kültürü inkübatöründe altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra hücreleri VBO 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve her kuyucuğu PE konjuge peptid MHC Tetramerleri ile 15 dakika boyunca boyayın.

Hücre kültür inkübatöründe, hücreleri %2 FBS ile takviye edilmiş PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri yıkadıktan sonra ışıktan koruyarak dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca boyayın. Peletleri tekrar PBS içinde %2'lik formaldehidin 100 mikrolitresinde süspanse edin ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Ko-kültür sonrası hücreler analiz edilir ve bu nokta grafiklerinde gösterildiği gibi kapılamaya (gating) tabi tutulur.

Yüklenmemiş veya peptit yüklenmiş, canlı CFSE yüksek ve CFSE düşük hedef hücrelerin oranı, küçük bir ileri saçılım (forward scatter) ve yan saçılım (side scatter) kapısı üzerinden analiz edilir; canlı hücreler canlı-ölü negatif ve CD4 pozitif T hücreleri üzerinden kapılanır ve CFSE düşük ile CFSE yüksek hücrelerin oranını analiz etmek için CFSE'ye göre grafiğe dökülür. Ardından, ölü veya canlı efektör ve hedef hücrelerin toplam sayısını belirlemek için daha büyük bir ileri-yan saçılım kapısı oluşturulur. Altı saatlik inkübasyon sonrası CD8 pozitif, tetramer pozitif T hücreleri ve CFSE düşük CD4 pozitif T hücreleri, efektör ve hedef hücrelerin oranını analiz etmek için grafiğe dökülür.

Ardından, CD eight pozitif tetramer pozitif hücreler üzerinden kapılama yapılarak toplam efektör CD eight pozitif T hücresi sayısı belirlenir. Toplam hedef hücre sayısı ise CD four pozitif T hücreleri, CFSE düşük ve canlı-ölü pozitif ve negatif hücreler üzerinden kapılama yapılarak belirlenir. CFSE düşük ve CFSE yüksek hücrelerin hedef oranı birdir birdir.

CD4 pozitif hedef hücreler, efektör hücrelerin yokluğunda kültüre edildiğinde bu oran ciddi şekilde azalır. CFSE düşük pozitif pulse hücreler, antijene özgü CD8 pozitif efektör T hücrelerini içeren toplam CD8 pozitif T hücresi popülasyonu ile inkübe edildiğinde.

Oran azaldıkça, CFSE düşük CD4 pozitif peptid yüklü hedef hücreler canlı-ölü pozitif olmaya başlar; efektör hücrelerin seyreltilmesi sonucunda CFSE oranı ve nihayetinde canlı peptid yüklü, CFSE düşük CD4 pozitif hedef T hücrelerinin sayısı yeniden geri kazanılır. Spesifik lizis yüzdesi daha sonra logaritmik ölçekte efektör/hedef oranının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülebilir. Grafikte gösterildiği gibi, çizimden bir doğrusal regresyon hesaplanır ve trend çizgisinin denklemi litik üniteleri hesaplamak için kullanılır.

Bu değer, antijen spesifik CD8 pozitif T hücrelerinin intrinsik sitolitik kapasitesini belirlemek ve donörler arasındaki sonuçları karşılaştırmak için, 1 milyon hedef CD4 pozitif T hücresinin %30'unu öldürmek için gereken CD8 pozitif efektör T hücre sayısını ifade eder. Bu videoyu izledikten sonra, antijen spesifik CD T hücrelerinin toksik aktivitesini ölçmek için sitometrinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, kendi T hücre tipiniz için de kolayca uyarlanabilir.