Name: Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, antijen-spesifik CD8+ T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini hücre bazlı akış sitometrisi ile ölçme yöntemini. Bu teknik, primer hedef hücreler kullanarak T hücre fonksiyonunu değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Florida Turizm, Ticaret ve Ekonomik Kalkınma Ofisi tarafından desteklenmiştir.

1. Efektör CD8+ T Hücrelerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>Otolog kriyoprezervasyonlu PBMC'leri (50 x 106 hücreli 2-3 şişe), kriyoviali sıvı nitrojenden 37 ° C'lik bir su banyosuna aktararak çözün.</li>
	<li>Tüpü tam RPMI (4 mM L-glutamin ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin,% 10 FBS ile desteklenmiş) ile 50 ml'ye kadar doldurarak hücreleri yıkayın. PBMC'leri sayın ve hücreleri tam RPM'de 5 x 106 / ml konsantrasyonda yeniden askıya alın.</li>
	<li>PBMC'lere spesifik peptit (5 μg/ml) ve IL-2 (10 ng/ml) ekleyin.</li>
	<li>96 derin kuyu plakasında kurulum kültürü; her oyuğa 1 ml hücre süspansiyonu tohumlayın.</li>
	<li>3 günlük kültürden sonra, hücre kültürü ortamının yarısını taze tam RPMI ile değiştirin.</li>
	<li>6 günlük kültürden sonra, tüm PBMC'leri çok kanallı pipet ile toplayın ve hücreleri steril rezervuarda transfer edin.</li>
	<li>PBMC'leri 5 ml'lik yuvarlak tabanlı tüplerde önerilen ayırma tamponunda 10x 7 7 / ml'de sayın, yıkayın ve yeniden süspanse edin. 50 μl / ml hücrelerde insan CD8 + T hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 150 μl/ml'de manyetik parçacıklar ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Ayırma tamponunu ekleyerek hücre süspansiyonunu 7 ml'ye getirin. Tüpü mıknatısın içine yerleştirerek dokunulmamış CD8 + T hücresinin immünomanyetik izolasyonuna devam edin. 5 dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken, ilgilenilen hücreleri 15 ml'lik yeni bir konik tüpe dökün. Küçük bir alikot alın ve hücreleri CD3 ve CD8'e karşı antikorlarla 1X PBS-2% FBS'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca boyayın. CD8 + T hücrelerinin saflığı daha sonra akış sitometrisi ile %95 veya daha yüksek bir saflıkta ölçülebilir.</li>
	<li>CD8 + T hücrelerini tam RPMI ile 450 μl'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>5 vidalı kapaklı tüpe 225 μl tam RPMI ekleyin.</li>
	<li>225 μl CD8 + 'yı bir sonraki tüpe aktararak seri seyreltmeleri (1: 2 ila 1: 32 arası) hazırlayın (bkz. Şekil 1 üst panel).</li>
</ol>
2. Hedef CD4+ T Hücrelerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>Otolog kriyoprezervasyonlu PBMC'leri (50 x10 6 hücreli 1 şişe), kriyoviali sıvı nitrojenden 37 ° C'lik bir su banyosuna aktararak çözün.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 10 ml RPMI içeren 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri yıkayın ve PBMC'leri 14 ml'lik yuvarlak tabanlı tüplerde ayırma tamponu ile 5 x 107 / ml'de yeniden süspanse edin. 50 μl / ml hücrelerde insan CD4 + T hücresi zenginleştirme kokteyli ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 100 μl/ml'de manyetik parçacıklar ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Ayırma tamponu ekleyerek hücre süspansiyonunu 7 ml'ye getirin. Tüpü mıknatısın içine yerleştirerek CD4 + T hücrelerinin izolasyonuna devam edin. 5 dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken, istenen hücreleri 15 ml'lik yeni bir konik tüpe dökün. Küçük bir alikot alın ve hücreleri CD3 ve CD4'e karşı antikorlarla 1x PBS-2% FBS'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca boyayın. CD4 + T hücrelerinin saflığı daha sonra akış sitometrisi ile %95 veya daha yüksek bir saflıkta ölçülebilir.</li>
	<li>CD4 + T hücrelerini sayın, iki adet 15 ml'lik konik tüpe bölün ve ılık 1x PBS'de yıkayın.</li>
	<li>Sıcak PBS'de 0,4 μM CFSE yüksekliğinde bir çalışma solüsyonu hazırlayın.</li>
	<li>10x CFSE yüksek çalışma çözeltisinin bir kısmını ılık PBS'de seyrelterek 0,04 μM CFSE düşük çalışma çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Hücreleri 20 x 106 / ml PBS'de yeniden süspanse edin (CD4 + T hücrelerinin sayısı 10 x 106 / ml'den azsa, 0.5 ml PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin) ve CD4 + T hücrelerinin yarısını bir eşit hacim ekleyerek boyayın 0.4 μM CFSE yüksek çalışma çözeltisi (nihai konsantrasyon 0.2 μM). Örneğin, 1 ml hücre için 1 ml CFSE çalışma çözeltisi ekleyin. CD4 + 'nın kalan yarısını, bir eşit hacimde 0.04 μM CFSE-düşük çalışma çözeltisi (nihai konsantrasyon 0.02 μM) ekleyerek boyayın. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 15 dakika boyayın.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, pelet hücreleri 5 dakika boyunca 1.500 rpm'de ve etiketleme reaksiyonunu söndürmek için 1 ml ılık tam RPMI'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>CFSE-düşük CD4 + T hücrelerini, tam RPMI'de 5 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda ilgilenilen peptidi ekleyerek darbeleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde 45 dakika inkübe edin.</li>
	<li>CFSE-yüksek ve CFSE-düşük CD4 + T hücrelerini tam RPMI'de yıkayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Tam RPMI'de her biri 2 x 105 hücre / ml konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.</li>
	<li>İki hedef popülasyonu 1:1 oranında karıştırın (CFSE-Yüksek: CFSE-Düşük) (bkz. Şekil 1 alt paneli).</li>
</ol>
3. Kokültür
<ol>
	<li>CD8 + T hücrelerinin her seyreltilmesinden, 100 μl'yi çift olarak yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaya tohumlayın.</li>
	<li>Karışık hedef CD4+ T hücrelerini (100 μl), 200 μl'lik bir son hacim için efektör hücrelerin her bir seyreltmesine ekleyin.</li>
	<li>Bazal apoptozu ölçmek için, yalnızca hedef hücrelerle 3 kuyu tohumlayın.</li>
	<li>Kokültürü 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde 6 saat inkübe edin.</li>
</ol>
4. Akış Sitometrisi Boyama ve Edinme
<ol>
	<li>Hücreleri V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve 37 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde 15 dakika boyunca PE konjuge pMHC tetramerleri ile boyayın.</li>
	<li>1x PBS-2% FBS'de yıkayın ve hücreleri Far Red LIVE/DEAD sabitlenebilir ölü hücre, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca ışıktan koruyarak boyayın.</li>
	<li>Hücreleri 1x PBS-2% FBS ile bir kez yıkayın ve 1x PBS'de% 2 formaldehit ile 100 μl'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Akış sitometresinde hücreler edinin.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan tahlil, CD8+ T hücrelerinin temel işlevinin ölçülmesine izin verir: sitolitik aktivite. CD8+ T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını karakterize ederken bu fonksiyonun doğru ölçümü büyük önem taşır, çünkü önceki çalışmalar bu fonksiyon ile antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sitokin sekresyonu arasında uyumsuzluk bildirmiştir10,11. Kısa kokültür inkübasyon süresi (6 saat) ve otolog hedef hücrelerin kullanımı nedeniyle, hedef hücrelerin spesifik olmayan öldürülme oranı düşüktür. Bu nedenle bu tahl...

Sitolitik aktivite, CD8+ T hücrelerinin ana işlevidir, ancak bu amaç için kullanılan tahliller hantal olduğundan ve standardize edilmesi zor olduğundan hala nadiren ölçülür. Bu fonksiyonun doğru ölçümü, CD8 + T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını karakterize ederken büyük önem taşır, çünkü etkili hücre aracılı sitotoksisitenin güvenilir bir öngörücüsü henüz tanımlanmamıştır1,2. Burada, antijene özgü CD8+ T hücrelerinin hedef CD4+ T hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivitesini ölçmek için yeni bir fonksiyonel test öneriyoruz. Altın standart olan krom salınım testine alternatifler sağlamak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Burada, canlı hedef hücrelerin ölümünü ölçtüğü için tüm öldürme sürecini ortaya çıkaran hücre bazlı bir test sunuyoruz. Bu yöntem, farelerde in vivo 4,5 ve insanlarda in vitro akış sitometrisi bazlı sitotoksik test protokollerinden türetilmiştir6. Bu protokolde, toplam CD8+ T hücre popülasyonunda bulunan antijene özgü CD8+ T hücreleri efektör hücre, otolog CD4+ T hücreleri ise hedef hücre olarak kullanılır. İlgilenilen efektör CD8 + T hücreleri, MHCI / peptit tetramerleri7 kullanılarak numaralandırılır. Hedef hücrelerin ölümü, peptit yüklü/yüksüz CD4+ T hücreleri arasındaki oran ile hesaplanır. Bu yöntemin tekrarlanabilir, duyarlı, spesifik olduğunu ve toplam CD8 + T hücre popülasyonu8 içindeki efektör hücre sayısına bağlı olmadığını daha önce göstermiştik. Kokültür tahlilinde hem efektör hem de hedef hücrelerin sayısını numaralandırarak, CD8 + T hücrelerinin hedef hücreleri öldürme içsel kapasitesi hesaplanabilir ve litik birimler9 olarak ifade edilebilir.

<table><tbody><tr><td>EasySep İnsan CD4 + T Hücre Zenginleştirme</td><td>Kiti Kök Hücre</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan CD8 + T Hücre Zenginleştirme</td><td>Kiti Kök Hücre</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti - Akış Sitometrisi için</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Uzak Kırmızı CANLI / ÖLÜ sabitlenebilir ölü hücre</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Fare Anti-İnsan CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-İnsan CD4 Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-insan CD8 Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin 100x Çözelti</td><td>İnvitrojen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Altın, Isı ile İnaktive PAA</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar; Tedavi; U alt; kapaklı</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml steril polistiren, ayrı ayrı sarılmış rezervuarlar</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu U-dipli, steril 2 ml derin kuyu plakaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-2 (v126), araştırma sınıfı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Tampon, ayırma tamponu</td><td>Kök hücre</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polipropilen Konik Boru</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml yuvarlak tabanlı tüp, polipropilen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Mıknatıslı</td><td>Kök hücre</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu; Kapaklı V alt plaka</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi, ACS reaktifi, ağırlıkça %37 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml vidalı kapaklı mikrotüp, konik</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

sitotoksik aktiviteyi Ölçmek için hücre bazlı akış sitometrisi testi

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

CD8+ T hücrelerinin sitolitik aktivitesi nadiren değerlendirilir. Burada, antijene özgü CD8 + T hücrelerinin, aynı kökenli peptitleri ile yüklü CD4 + T hücrelerini öldürme kapasitesini ölçmek için yeni bir hücre bazlı testi açıklıyoruz. Hedef CD4 + T hücreleri, iki farklı CFSE konsantrasyonu ile etiketlenmiş iki popülasyona ayrılır. Bir popülasyon, ilgilenilen peptit ile nabız atarken (CFSE-düşük), diğeri nabızsız kalır (CFSE-yüksek). Darbeli ve darbesiz CD4 + T hücreleri eşit oranda karıştırılır ve artan sayıda saflaştırılmış CD8 + T hücresi ile inkübe edilir. Otolog hedef CD4+ T hücrelerinin spesifik öldürülmesi, peptit/MHCI tetramer boyaması ile tespit edilen antijene özgü efektör CD8+ T hücrelerini içeren CD8+ T hücreleri ile kokültür sonrası akış sitometrisi ile analiz edilir. Farklı efektör ve hedef oranlarında ölçülen hedef CD4 + T hücrelerinin spesifik lizisi, litik birimlerin, LU30/106 hücrelerinin hesaplanmasına izin verir. Bu basit ve anlaşılır tahlil, CD8 + T hücrelerinin hedef CD4 + T hücrelerini öldürmek için içsel kapasitesinin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Şekil 1'deki şema deneyi özetlemektedir. Saflaştırılmış CD8+ T hücreleri (efektör hücreler) 450 µl komple RPMI içinde yeniden süspanse edildi ve 225 µl CD8+ T hücresinin 225 µl besiyeri içeren bir sonraki tüpe eklenmesiyle seri dilüsyonlar gerçekleştirildi (üst panel). Saflaştırılmış CD4+ T hücreleri (hedef hücreler) sayıldı, iki tüpe ayrıldı ve protokolde açıklandığı üzere iki farklı CFSE konsantrasyonu ile (yüksek ve düşük) boyandı. CFSE-low CD4+ T hücreleri ilgili peptit ile pulse edildi ve CFSE-high ...

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre tabanlı bir akış sitometrisi deneyi kullanarak antijenle spesifik CD8 T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini ölçmektir. Bu işlem, ilk olarak efektör CD8 T hücrelerinin ilgili peptid varlığında altı gün boyunca genişletilmesiyle gerçekleştirilir; ikinci adımda hedef CD4 T hücreleri ilgili peptid ile pulse edilir ve ardından pulse edilmemiş CD4 T hücreleri ile karıştırılır. Sonrasında, efektör CD8 T hücreleri ve hedef CD4 T hücreleri, farklı efektör-hedef oranlarında altı saat boyunca birlikte kültüre edilir.Son adımda, peptid yüklü hedef CD4 T hücrelerinin öldürülmesi ve efektör CD8 T hücrelerinin sayısı akış sitometrisi ile nicelendirilir. Nihayetinde, litik birimler cinsinden ifade edilen antijene özgü CD8 T hücrelerinin doğal öldürme kapasitesi hesaplanabilir. Bu tekniğin, kromatin salınım testi gibi yöntemlere kıyasla temel avantajları; ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yerine otolog primer hedef hücrelerin ve gerçek hedef hücrenin kullanılmasıdır.Buna ek olarak, efektör hücre sayıları tek hücre düzeyinde ölçülebilir. Şimdi, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi CD8 pozitif efektör hücreleri izole etme prosedürünü gösterecektir. İşleme, otolog kriyoprezerve PBMC'leri 37 °C'lik bir su banyosunda çözerek başlayın ve ardından hücreleri 50 mL'ye kadar tam medyada yıkayın.Sayım işleminden sonra, PBMC'leri komple medyada mililitre başına 5 milyon hücre konsantrasyonunda seyreltein ve ardından kültüre IL-2 ile ilgili peptidi ekleyin. Sonrasında, hücre süspansiyonunun bir mililitresini 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. Üç günlük kültür süresinden sonra, süpernatantın yarısını taze komple medya ile değiştirin. Altı günlük kültür süresinin ardından, hücreleri steril bir rezervuara aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından hücreleri sayın ve yıkayın.Pelleti, ayırma tamponu içerisinde mililitrede 50 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve PBMC'leri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüp içerisinde, mililitre hücre başına 50 µL oranında insan CD8 pozitif T-hücresi zenginleştirme kokteyli ile oda sıcaklığında inkube edin. 10 dakika sonra, hücreleri 150 µL/mL oranında anti-CD8 IgG konjuge manyetik partiküller ile beş dakika daha inkube edin ve ardından hücre süspansiyonunu ek ayırma tamponu ile yedi mililitreye tamamlayın. Tüpü ayırma mıknatısına yerleştirin; beş dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Ardından, hücrelerin küçük bir alikotunu %2 FBS ile desteklenmiş PBS içerisinde, CD3 ve CD8'e karşı antikorlar ile 4 °C'de 30 dakika boyunca boyayın.Akış sitometrisi ile hücre saflığının %95 CD8 pozitif veya daha yüksek olduğunu doğrulayın. Şimdi beş adet vidalı kapaklı tüpe 225 µL komple besiyeri ekleyin ve ardından hücreleri 1'den 2'ye, 1'den 32'ye kadar seri olarak dilüe edin. CD4 pozitif hedef hücreleri izole etmek için, otolog kriyoprezerveli PBMC'lerin 37 °C su banyosunda çözülmesiyle başlayın.Çözülmüş hücreleri, 10 mL besiyeri içeren 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Az önce gösterildiği gibi manyetik partikül ayırma yöntemiyle CD4 eksprese eden T hücrelerini zenginleştirin ve akış sitometrisi ile CD4 pozitif T hücrelerinin %95 veya daha yüksek bir saflıkta olduğunu doğrulayın. Hücreleri saydıktan sonra, iki adet 15 mL'lik konik tüpe paylaştırın ve ardından ılık PBS ile yıkayın; peletleri PBS içinde mL başına 20 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.Hücrelerin ışıktan korunduğundan emin olduktan sonra, CD4 pozitif T hücrelerinin yarısını taze hazırlanmış CFSE yüksek çalışma çözeltisi ile 0,2 millimolar nihai konsantrasyona, diğer yarısını ise taze hazırlanmış CFSE düşük çalışma çözeltisi ile 0,04 millimolar nihai konsantrasyona, %5CO2 içeren 37 °C'de 15 dakika boyunca boyayın. Boyama süresinin sonunda, hücreleri santrifüjle çöktürün ve markalama reaksiyonunu durdurmak için peletleri bir mililitre ılık tam besiyerinde yeniden süspande edin. CFSE düşük CD4 pozitif T hücrelerini, hücre kültürü inkübatöründe, tam besiyeri içerisinde ilgili peptidin 5 µg/mL nihai konsantrasyonu ile 45 dakika boyunca pulse edin.İnkübasyondan sonra hem CFSE yüksek hem de düşük T-hücre popülasyonlarını yıkayın. Her iki hücre süspansiyonunu da mililitre başına 200.000 hücre olacak şekilde iki kez eksik besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, iki hedef popülasyonu bir-bir oranında (CFSE yüksek/CFSE düşük) karıştırın.Şimdi, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 100 µL karışık hedef CD4 pozitif T hücresi ekleyin; ardından her kuyucuk başına toplam 200 µL hacme ulaşacak şekilde, her bir CD8 pozitif T hücresi süspansiyonundan birer mikrolitreyi çift örneklü olarak ekleyin. Bazal apoptozu ölçmek için üç kuyucuğu yalnızca hedef hücrelerle ekin ve ardından ko-kültürü hücre kültürü inkübatöründe altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra hücreleri VBO 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve her kuyucuğu PE konjuge peptid MHC Tetramerleri ile 15 dakika boyunca boyayın.Hücre kültür inkübatöründe, hücreleri %2 FBS ile takviye edilmiş PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri yıkadıktan sonra ışıktan koruyarak dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca boyayın. Peletleri tekrar PBS içinde %2'lik formaldehidin 100 mikrolitresinde süspanse edin ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Ko-kültür sonrası hücreler analiz edilir ve bu nokta grafiklerinde gösterildiği gibi kapılamaya (gating) tabi tutulur.Yüklenmemiş veya peptit yüklenmiş, canlı CFSE yüksek ve CFSE düşük hedef hücrelerin oranı, küçük bir ileri saçılım (forward scatter) ve yan saçılım (side scatter) kapısı üzerinden analiz edilir; canlı hücreler canlı-ölü negatif ve CD4 pozitif T hücreleri üzerinden kapılanır ve CFSE düşük ile CFSE yüksek hücrelerin oranını analiz etmek için CFSE'ye göre grafiğe dökülür. Ardından, ölü veya canlı efektör ve hedef hücrelerin toplam sayısını belirlemek için daha büyük bir ileri-yan saçılım kapısı oluşturulur. Altı saatlik inkübasyon sonrası CD8 pozitif, tetramer pozitif T hücreleri ve CFSE düşük CD4 pozitif T hücreleri, efektör ve hedef hücrelerin oranını analiz etmek için grafiğe dökülür.Ardından, CD eight pozitif tetramer pozitif hücreler üzerinden kapılama yapılarak toplam efektör CD eight pozitif T hücresi sayısı belirlenir. Toplam hedef hücre sayısı ise CD four pozitif T hücreleri, CFSE düşük ve canlı-ölü pozitif ve negatif hücreler üzerinden kapılama yapılarak belirlenir. CFSE düşük ve CFSE yüksek hücrelerin hedef oranı birdir birdir.CD4 pozitif hedef hücreler, efektör hücrelerin yokluğunda kültüre edildiğinde bu oran ciddi şekilde azalır. CFSE düşük pozitif pulse hücreler, antijene özgü CD8 pozitif efektör T hücrelerini içeren toplam CD8 pozitif T hücresi popülasyonu ile inkübe edildiğinde.Oran azaldıkça, CFSE düşük CD4 pozitif peptid yüklü hedef hücreler canlı-ölü pozitif olmaya başlar; efektör hücrelerin seyreltilmesi sonucunda CFSE oranı ve nihayetinde canlı peptid yüklü, CFSE düşük CD4 pozitif hedef T hücrelerinin sayısı yeniden geri kazanılır. Spesifik lizis yüzdesi daha sonra logaritmik ölçekte efektör/hedef oranının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülebilir. Grafikte gösterildiği gibi, çizimden bir doğrusal regresyon hesaplanır ve trend çizgisinin denklemi litik üniteleri hesaplamak için kullanılır.Bu değer, antijen spesifik CD8 pozitif T hücrelerinin intrinsik sitolitik kapasitesini belirlemek ve donörler arasındaki sonuçları karşılaştırmak için, 1 milyon hedef CD4 pozitif T hücresinin %30'unu öldürmek için gereken CD8 pozitif efektör T hücre sayısını ifade eder. Bu videoyu izledikten sonra, antijen spesifik CD T hücrelerinin toksik aktivitesini ölçmek için sitometrinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, kendi T hücre tipiniz için de kolayca uyarlanabilir.

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Tabanlı Akış Sitometrisi Analizi

Bu video, sitokin kaynaklı öldürücü (CIK) hücrelerin kanser hücrelerine karşı sitotoksik yeteneğini ölçmek için kullanılan bir in vitro tekniği göstermektedir. Hedef kanser hücrelerinin CIK hücreleri ile birlikte kültürlenmesi üzerine, ölü kanser hücreleri bir floresan canlılık boyası kullanılarak tanımlanır ve CIK hücrelerinin sitotoksik etkisini tahmin ederek akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Sitokin ile İndüklenen Öldürücü Hücrelerin Sitotoksik Yeteneğini İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Bu video, doğal öldürücü hücrelerin floresan lekeli hedef hücrelere karşı litik aktivitesini göstermektedir. Yöntem, ölü hücreleri boyayarak ve canlı ve ölü hedef hücreleri ölçmek için bir akış sitometresi kullanarak NK hücresinin neden olduğu sitotoksisite ölçümünü mümkün kılar.

Akış Sitometrik Analizi için Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

Bu video, önceden aktive edilmiş efektör T hücreleri tarafından indüklenen kanser hücrelerinde bir apoptoz testini göstermektedir. Bu hücrelerin floresan çekirdeklerle işaretlenmiş kanser hücreleri ile birlikte kültürlenmesiyle, kaspaz ile bölünebilir bir florojenik substrat eklenir. Apoptotik kanser hücreleri, çekirdeklerinde farklı bir renk gösterecek ve bu da çift floresansa yol açacaktır. Bu ikili floresan, apoptoz geçiren kanser hücrelerinin göstergesidir.

Önceden Aktive Edilmiş CD8 + T Hücrelerinin Kanser Hücrelerine Karşı Sitotoksisitesini İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Bu çalışma, insan kan örneklerinde NK (Doğal Öldürücü) hücre sayısının ve NK hücre sitotoksisitesinin doğru ve hızlı bir şekilde belirlenmesi için gelişmiş bir iş akışını açıklar.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Öğrenin, antijen-spesifik CD8+ T hücrelerinin sitotoksik aktivitesini hücre bazlı akış sitometrisi ile ölçme yöntemini. Bu teknik, primer hedef hücreler kullanarak T hücre fonksiyonunu değerlendirmeye olanak tanır.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Daha fazla video keşfet