Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, istenen tedavilerin yaralı hücrelerin onarımı üzerindeki etkisini gözlemlemek ve yaralı hücrelerin onarımına yardımcı olan hücre altı süreçleri incelemektir. Bu, yaralı hücrelerin kinetiğini ve bu boyaların girişini önleme yeteneğini değerlendirmek için sağlam hücre zarlarını geçemeyen floresan boyaların varlığında hücrelerin yaralanmasıyla elde edilir. İkinci bir adım olarak, yaralı hücre zarındaki hücre içi proteinlerin görünümünü izliyoruz, bu da ilgilenilen hücresel bir bölmenin yaralı hücre zarına kaynaşarak onarıma katılma yeteneğini tanımlar.

Daha sonra, yaralanma kinetiğini izlemek için ilgilenilen hücresel bölmelerin yaralı hücre zarı ile füzyonunu izliyoruz. Bu bölmenin tetiklenmiş füzyonu, hücre zarı hasarının onarımının, yaralı hücre yüzeyinde bir tane olmak üzere lizozomla ilişkili zar proteininin görünümünün artmasına ve yaralı hücreler tarafından lizozomal içeriğin salgılanmasının canlı görüntülenmesine dayalı olarak lizozomal ekzositoz ile ilişkili olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntemler, hücre hasarı ve onarımında önemli soruların ele alınmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, bunlar, hangi proteinlerin ve hücresel bölmelerin hücre zarındaki fokal yaralanmalara yanıt verdiğini belirlemek ve daha sonra yanıtın kinetiğini değerlendirmek için kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacılardan Aurelia D dört ve hamma stra iki olacaktır. İyileşen ve iyileşmeyen yaralı hücreleri ayrı ayrı işaretlemek.

Hücreleri, üç deney koşulu için steril örtü fişlerine tohumlayın. Hücreleri% 50'den fazla birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin, ardından C bir ve C iki'yi 37 santigrat derecede CIM ile iki kez yıkayın. C3'ü PBS ile 37 santigrat derecede yıkayın.

Ardından kapak fişlerini silikon O-ringlerin üzerine aktarın. Uygun tampona 100 mikrolitre ön ısıtma fitzy dekstran çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında kapak kaymasının üzerine 40 miligram cam boncuk ekleyerek ve kapağı manuel olarak eğerek C one ve C3'teki plazma zarına zarar verin.

Hafif yaralanma için 30 derecelik bir açıyla altı ila sekiz kez ileri geri kayar. Cam boncukların eşit şekilde yayıldığından emin olun, böylece numuneler arasındaki yaralanmaların tekrarlanabilirliğini artırmak için tekrarlanan yaralanmaları en aza indirin. Karşılaştırılacak farklı numunelerin cam boncuk yaralanmasını aynı anda gerçekleştirin ve boncukların daha fazla yuvarlanmasını önleyin.

Tüm kapak fişlerini ortam CO2'sinde 37 santigrat derece inkübatöre aktarın ve boncukların yuvarlanmasına izin vermeden onarımın beş dakika devam etmesine izin verin. Cam boncukları ve fitzy dekstranı tampon veya PBS ile yıkayarak çıkarın. Şimdi kapak fişlerini O-ringe geri yerleştirin ve 100 mikrolitre ön ısıtma lizin ekleyin.

Sabitlenebilir trissy dekstran çözeltisi Ortam CO2'de beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kapak fişlerini ön ısıtma CIM ile iki kez yıkayın ve iki PBS yıkamadan sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 PFA ile sabitleyin. Hersch boyasında iki dakika inkübe edin ve iki PBS yıkamadan sonra numuneyi montaj ortamı kullanarak bir slayt üzerine monte edin.

Daha sonra, C iki örneğinden bir epi floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin. Arka plan kırmızı ve yeşil boyama yoğunluğunu belirleyin. Ardından, tüm örnekler için kırmızı ve yeşil kanalların eşiğini almak için bu değeri kullanın.

Yeşil olan toplam hücre sayısını puanlayın. Ayrıca C, bir ve C3 örneklerinde kırmızı veya hem kırmızı hem de yeşil olan hücreleri puanlayın. Şimdi her koşul için 100'den fazla yeşil yaralı hücreyi sayın ve onarılamayan hücrelerin fraksiyonunu, yaralanan tüm hücrelerin yüzdesi olarak ifade edin.

%50'nin üzerine çıkan hücreleri önceden uyarılmış CIM ile yıkayın ve kapak fişini FM boya ile CIM'e monte edin. Sahne üstü inkübatördeki bir tutucuda 37 santigrat derecede tutuldu. Tutarlı ancak ölümcül olmayan yaralanmaya izin veren optimal gücü kullanarak hücre zarının bir bölgesini seçin.

Bunu başarmak için numuneyi darbeli lazerle 10 milisaniyeden daha kısa bir süre ışınlayın. Yaralanmadan önce başlayan ve yaralanmayı takiben üç ila beş dakika devam eden epi, floresan ve parlak alanda her iki ila 10 saniyede bir izlemek, onarmak, görüntü elde etmek için yazılım aracılığıyla lazer gücünü en yüksek gücün% 40 ila 50'sine kadar azaltın. Onarım kinetiğini ölçmek için, hücresel FM boya floresansını ölçün.

Görüntüleme sırasında yoğunluktaki değişimi hesaplayın. Her koşulda 10'dan fazla hücre için verilerin ortalamasını alın ve ortalama veya tek tek hücre değeri olarak çizin. C bir ve C iki kapak fişlerini yıkayın.

37 santigrat derecede CIM ile kültür preparatları ve C3'ü 37 santigrat derecede PBS ile yıkayın. Daha sonra numuneleri silikon O-ringler üzerine aktarın. 100 mikrolitre ön ısıtma lizin sabitlenebilir trissy dekstran ekleyin.

Daha önce gösterildiği gibi C one ve C3 üzerindeki plazma zarını yaralayın. Sonra daha fazla boncuk yuvarlanmasını önleyin. Tüm kapak fişlerini ortam CO2'sinde 37 santigrat derece inkübatöre aktarın ve onarımın beş dakika devam etmesine izin verin.

Şimdi cam boncukları ve Trixie dekstran'ı çıkarmak için, kapak fişlerini soğuk büyüme ortamında yıkayın ve cam boncukların hücreler üzerinde yuvarlanmamasını sağlayın. Kapak kızaklarını soğuk büyüme ortamı ile iki kez durulayın ve O-ringlere C, bir ve C3'e aktarın. Soğuk tam büyüme ortamına 100 mikrolitre sıçan anti-US lambası bir antikor ekleyin ve antikor bağlanmasına izin vermek için soğuk tam büyüme ortamını C ikisine ekleyin. Örtü fişlerini soğuk CIM ile üç yıkamadan sonra dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Tüm kapak fişlerini oda sıcaklığında 4 dakika boyunca %10 PFA ile sabitleyin. Ardından CIM ile üç kez durulayın. Daha sonra, tüm kapak fişlerini 100 mikrolitre bir bloke edici çözelti içinde 15 dakika inkübe edin, ardından 100 mikrolitre ofor, 4 88 anti sıçan antikoru 15 dakika boyunca inkübe edin.

PBS ile iki kez yıkayın ve iki PBS yıkamadan sonra oda sıcaklığında iki dakika boyunca lekesinde inkübe edin. Numuneleri bir slayta monte edin, ardından C iki hücresinin görüntülerini kullanarak numuneleri bir epi floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Kırmızı ve yeşil kanallardaki spesifik olmayan arka plan lekelenmesini belirleyin.

Tüm numuneler için kırmızı ve yeşil kanalları eşiklemek için bu arka plan boyama değerlerini kullanın. Yaralı hücrelerde lamba bir lekelenmesinin yoğunluğunu ölçmek için C one ve C3'ten 100'den fazla kırmızı etiketli hücreyi kullanın. Başarılı bir deneyde, C3'ten gelen lambalı boyama hücreleri, lizozomları floresan boya ile etiketlemek için C bir'den gelen hücrelerden önemli ölçüde daha düşük olacaktır, bu hücreler, fitzy dekstran içeren büyüme ortamında% 50'ye kadar birleşir

Dekstranın hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca endositoz olmasına izin verin. Hücreleri Ön ısıtma büyüme ortamı ile yıkayın ve görüntülemeden önce tüm endositoz dekstranın lizozomda birikmesine izin vermek için bir CO2 inkübatörde iki saat inkübe edin. Kapak fişini Preheat CIM'de durulayın ve CIM'de 37 santigrat derecede sahne üstü inkübatördeki bir kapak kayma tutucusuna monte edin.

Görüntüleme için kalabalık fitzy dekstran etiketli lizozomlara sahip olmayan hücreler için seçin. Bireysel lizozomların hareketi ve ekzositozu. Hücre boyunca lizozom hareketi için geniş alan görüntüleri elde edin.

Alternatif olarak, hücre yüzeyindeki hareket için çim görüntüleri elde edin ve ekzositozlarını izleyin. İlgilenilen hücrelerdeki ekzositoz dinamiklerine bağlı olarak, lizozomun hücre hasarı görüntü hücrelerine tepkisini en az iki dakika veya daha uzun süre saniyede dört ila altı kare hızında izlemek için daha önce gösterildiği gibi ışınlama yoluyla hücre zarını yaralayın. Bu toplu tahlilde, tüm yaralı hücreler işaretlenir ve yaralanmamış hücreler etiketlenmeden kalırken tamir edilemeyenler tanımlanır.

Fitzy dekstran varlığında cam boncuklar tarafından yaralanan hücreler, hücrelerin kalsiyum varlığında onarılmasına izin verildiğinde yeşil olarak etiketlenir. Yaralı hücrelerin çoğu tamir etmeyi başarır ve hücrelerin onarılmasına izin verildiğinde trissy dekstran ile işaretlenmez. Kalsiyum yokluğunda, yaralı hücrelerin çoğu da trissy dekstran tarafından kırmızı olarak etiketlenir.

Bu deney, FM boyasının hücreye girişini izleyerek hücre zarı onarımının kinetiğini değerlendirir. FM kalıbında inkübe edildiğinde, sağlam hücreler hücre içi lekelenme çok az gösterir veya hiç göstermez. Hücre zarının lokalize lazer yaralanmasını takiben, FM D hücreye girmeye ve endo zarları bağlamaya başlar, bu da lazer yaralanmasını takiben hücre zarının onarım kapasitesi kalsiyuma bağlı olduğundan FM boya floresansında ani bir artışa neden olur.

Kalsiyum varlığında yaralanan bir hücre tamir edilebilir, bu da FM boya girişinin yaralanmadan bir dakika sonra durmasına neden olur. Aksine, kalsiyum yokluğunda onarılmasına izin verilen bir hücre onarılamaz, bu da sürekli boya girişine ve dolayısıyla yaralanmadan dört dakika sonra bile FM d floresansında sürekli artışa neden olur. Böylece, hücre zarı onarımı, FM boya lekelenmesinin platosuna yol açar.

Hücre zarı onarımının olmaması, plato yapamayan sürekli boya girişine neden olur. Toplu cam boncuk yaralanması yaklaşımı, yaralanmaya yanıt olarak veziküllerin ve proteinlerin hücre yüzeyi translokasyonunu izlemek için kullanılabilir. Burada, hücreler trissy dekstran varlığında yaralanır.

Böylece, yaralanmamış hücreler kırmızı olarak etiketlenmezken, tüm yaralı hücreler kırmızı olarak etiketlenir. Birincil antikor ile tedavi edilmeyen yaralanmamış hücrelerin, hücre yüzeyi lambası bir için arka plan seviyesi etiketlemesi gösterdiğini unutmayın. Bununla birlikte, hücreler yaralandığında ve kalsiyum varlığında iyileşmesine izin verildiğinde, lizozomlar ekzositoza uğrar ve bu nedenle yaralı hücrelerin yüzeyinde bir lamba lekelenmesi seviyesi artar.

Hücre yüzeyindeki bu artış, kalsiyum yokluğunda iyileşmesine izin verilen hücrelerde çok daha düşüktür. Böylece hem yüksek hücre yüzey lambası bir boyama ile hücre sayısının ölçülmesi hem de hücre yüzey lambasının seviyesinin ölçülmesi. Bir. Bireysel yaralı hücreler üzerindeki boyama, hücrenin yaralanma ile tetiklenen lizozomal ekzositoza maruz kalma yeteneği için ölçümler sağlar.

Bu deney, bireysel lizozom füzyonunun kinetiğini, doğasını ve yerini doğrudan izler. Hücre zarı hasarına yanıt olarak, hücreler darbeli lazer tarafından yaralanır ve hücre yüzeyi lizozomları, tek tek hücrelerde lizozomların yaralanma ile tetiklenen ekzositozunun izlenmesine izin veren çim görüntüleme ile görüntülenir. Bu şekil, sol panelde faz kontrast görüntüleme ve orta panelde çim mikroskobu ile görüntülenen bir hücreyi göstermektedir.

Sağ panel, yaralanmadan 105 saniye sonra aynı hücrenin çim görüntüsünü gösterir. Burada, hücre zarına bir lizozomun alımını tetikleyen yaralanma ve ardından ekzositoz gösterilmiştir. Bu lizozom, yaralanmadan önce çim görüntüsünde görünmez, ancak yaralanmayı takiben lizozom hücre zarına ulaşır ve tespit edilebilir hale gelir.

Vezikül hücre zarına yaklaştıkça, lizozomal fitsy dex iplikçik floresansının maksimum değere ulaşmasına neden olan çim aydınlatması tarafından daha iyi uyarılır. Füzyon dökümü açıldığında, bu, lizozomal pH'ın nötralizasyonuna ve dolayısıyla uygun DExT ipliği floresansının söndürülmesine neden olur. Daha sonra, DExT ipliği vezikülden hücrenin dışına boşaltılır, bu da ZI floresansının yanal olarak yayılmasına neden olur ve vezikül floresansının lizozomların çeşitli yaralanma ile tetiklenen tepkilerini kademeli olarak azaltmasına neden olur.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin büyük fokal yaralanmalardan onarım yeteneğini nasıl izleyeceğinizi ve onarım sürecine yanıt veren ve yardımcı olan hücre altı bölmeleri ve proteinleri nasıl izleyeceğinizi iyi anlamalısınız. Yaralanmaya verilen yanıtı ve IND hücrelerinin onarımına katılımı izlemek için farklı etiket hayati etiketleme, bölmeler veya protein kullanarak daha fazla deney yapılabilir.