Name: Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Öğrenin fare kardiyomiyosit izolasyonu ve fizyolojik analiz yöntemlerini. LOR perfüzyonu ile yetişkin fare kalplerinden hücre izolasyonu, kontraktilite ve kalsiyum geçişleri değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hücre ve Gelişim Biyolojisi çekmesi ekipman Bölümü kullanımı Marc Wozniak. Vanderbilt Üniversitesi Hücre Görüntüleme Paylaşımlı Kaynak. Bu çalışma DMB için ERP AHA hibe 12PRE10950005, DMB için AHA hibe 11GRNT7690040, NIH hibe R01 HL037675 tarafından desteklenmektedir. DMB Kardiyovasküler Araştırma Gladys P. Stahlman Başkanıdır.

Hayvanları kapsayan tüm işlemler uygun hayvan kullanımı ile onaylanmasını sağlayın ve vücut bakımı. 1. Advance Stok Tamponlar hazırlayın <ol><li> 2 L&#39;stok Ca2 + içermeyen Tyrode (Tablo 1) hazırlayın. NaOH ile 7.4 &#39;e pH ayarlayın. </li><li> 2 L&#39;stok ve 1.2 mM Ca2 + Tyrode (Tablo 2) hazırlayın. NaOH ile 7.4 &#39;e pH ayarlayın. </li></ol> Deney gününde 2. Perfüsvonun, Transferi ve Sindirim Tamponlar hazırlayın <ol><li> Ca 2 + Tyrode (Tablo 3), 150 ml perfüzyon tamponu hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre içinden süzme. </li><li> 35 ml hazırlayın Ca 2 + bedelsiz &quot;Tampon A&quot; &quot;Tampon B&quot; (Tablo 5) içeren (Tablo 4) ve 25 ml Ca 2 +. 0.2 mikron filtre aracılığıyla her filtre. </li><li> 0 çözümler hazırlayın.06, 0.24, 0.6, ve karıştırma Tampon A 1.2 mM Ca 2 + ve B Tablo 6 başına. </li><li> Fare vücut ağırlığı (BW) göre 25 mi perfüzyon tamponu (Tablo 7) olarak sindirim enzimleri eritilerek 25 mi sindirim tamponu hazırlayın. Kullanılmadan önce bir 0.2 mikron filtre içinden süzme. </li></ol> 3. Deney Düzeneği <ol><li> Mevcut piyasada bulunan ya da 3 ml&#39;lik bir akış oranı izin vermek için bir peristaltik pompa, boru ve bir ısı değiştirici sargı kullanılarak, sabit bir akış Langendorff cihazına monte / 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı perfüzyon dak. Basit şematik Bell tarafından 2011 gözden sağlanan, ark 18 edilir. </li><li> Kanül dışarı akış 3 mL / dakikalık bir akış hızında 37 ° C üstünde olacak şekilde, Langendorff aparatındaki dolaşan su banyosu sıcaklığı (~ 47 ° C) ayarlayın. </li><li> Ultra saf tip I, 100 ml su, ardından 15 dakika boyunca perfüzyon sistemine,% 70 etanol ile çalıştırın. Sistemli Run perfüzyon tampon5 dakika boyunca m hava kabarcıklarını ortadan kaldırılmaktadır. </li><li> İstediğiniz bir yöntem ile tüm cerrahi aletleri sterilize. </li><li> Bir 23 G Luer adaptörü saplama ucu PE-50 boru kısa bir parça (yaklaşık 3 mm) takılarak kanül oluşturun. Boru ısı ucu aort yerleştirilmiş olacak, üzerinde bir dudak oluşturmak için. </li></ol> 4. kardiyomiyosit İzolasyon <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile, 0.2 ml heparin solüsyonu (1000 lU / ml) ile fare enjekte edilir. </li><li> 5 dakika sonra, izofluoran fare uyutmak. Tam (güçlü ayak tutam hiçbir yanıt) anestezi yaparken,% 70 etanol ile göğüs püskürtün. , Göğüs açın çabuk 4 ° C perfüzyon tamponunda aorta ve yer zarar vermemek için dikkatli olmak, kalbini kesip. Kavramak ve kalp altında kaldırmak için kavisli bir forseps kullanın. Bu ince makas ile kalbin arkasında ekleri kırpmaya alan oluşturur. </li><li> Yavaşça ince forseps iki çift aort tutup ve dikkatli bir şekilde openi çekerek kalp Cannulatekanülün dudak aort ng. Bu koroner damar yoluyla kalbin perfüzyon inhibe gibi, kanül ucu aort kapağı geçmiş ve ventrikül içine olmadığından emin olun. </li><li> Hemen kanülün dudak üzerinde aorta çevresinde 5-0 ipek sütür bir döngü bağlayarak kanüle aorta edin. </li><li> Not: 4.4 ile 4.2 mümkün olduğunca çabuk en kaliteli sindirim için tamamlanmalıdır Adımlar. </li><li> Not: Kalp daha önce perfüzyon tampon akan Langendorff cihazına takılı bir kanül üzerine direkt olarak monte edilebilir. Bununla birlikte, bir teşhir mikroskopu altında perfüzyon tamponu küçük bir şınngaya bağlanmış bir kanül üzerine kalp asılı çok başarılı olduğu bulunmuştur. Bu perfüzyon tamponu bir miktar koroner arterlerin temizlenmesi için takip ve güvenli bir şekilde kanül bağlı kalp sağlanması vasıtasıyla itilmesine izin verir. Sonra kanül perfüzyon tampon çalışan Langendorff&#39;a asılır. </li><li> Perfuse2-3 dakika boyunca 3 ml / dakikalık bir akış hızında serbest Ca2 + perfüzyon tamponu ile kalp. </li><li> Sindirim tampon enzim ve 7-10 dakika boyunca serpmek geçmek, kalp renkli yumuşak ve hafif olacak. </li><li> Not: Sindirim zaman enzim aktivitesi ve kalp büyüklüğüne göre ayarlanabilir. </li><li> Kalp palpably sarkık sonra, Tampon A (Ca 2 + bedelsiz tamponu) ile steril bir p60 çanak kanül ve yerden kalp kaldırmak. </li><li> Atriumlarm ve büyük damarları çıkarın. İsterseniz sağ ventrikül çıkarın. Forseps ile, küçük parçalar halinde ventrikül ayrı. 5 ml steril bir transfer pipet ile birkaç kez pipet başka hücreleri dağıtmak için. </li><li> 250 um naylon ağ filtre içerisinden 50 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu filtre edin. </li><li> Süspansiyon, yaklaşık 10 dakika boyunca pelet izin verin. </li><li> 0.06 mM Ca 2 + çözeltisi içine pelet aktarın. Hücreler, 10 dakika boyunca pelet izin verin. En ölü hücreler yüzer olurken Sağlıklı hücreler, pelet olacaktır. </li&gt; <li> Süpernatanı havalandırın, ve 0.24 mM Ca 2 + çözeltisine pelet aktarın. </li><li> 10 dakika inkübasyon, aspirasyon tekrarlayın ve hücreler 1.2 mM çözelti haline gelene kadar kalan iki Ca 2 + çözümleri ile aktarın. Bu noktada, hücrelerin çoğunluğunun çubuk şekilli miyositler olmalıdır. </li></ol> 5. Ölçme Kasılma ve Kalsiyum Geçişler <ol><li> Not: kontraklil ve kalsiyum geçici Hem eş zamanlı olarak ölçülebilir. </li><li> 1 mg / ml arasında bir konsantrasyonda susuz DMSO içinde yeniden süspanse edilerek Fura-02:00 çözelti hazırlayın. Fura-02:00 solüsyonu, -20 ° C&#39;de bir desikatör içinde saklanabilir. </li><li> Yük 1 ul Fura-02:00 ile suspensiyon halindeki hücreler 1 ml. Hücreler koyu 10 dakika sonra aspire yüzer oturmak için izin verin. Hücreler yıkandı ve yıkamalar arasında 10 dakika boyunca karanlıkta pelet sağlayan, Ca 2 + Tyrode çözeltisi ile iki kez yıkayın. </li><li> Isıtmalı pe sağlayan bir sahne prospektüste bir cam lamelBir miyositlerdeki alan uyarıcı ile volta rfusion / aspirasyon ve elektrot. Ters mikroskop yerleştirin sahne insert bir immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız lens petrol bir damla ekleyerek, floresan ölçümü için ayarlanmış. </li><li> 1.2 mM Ca 2 + tirod çözeltisi ısıtmalı yerçekimi perfüzyon kurmak sahnede çözelti 37 ° C ulaşır böylece. Vakum aspirasyon takın. Elektrotlar takın. </li><li> Mikroskop sistemi açın ve rasyometrik floresan ve hücre boyutlandırma veri toplama yazılımı açın. </li><li> An perfüzyon engelleme sağlıklı hücreleri yerleşmek için izin, sahne inserte Fura-02:00 yüklü hücrelerin birkaç damla ekleyin. </li><li> Istenen hücreyi bulmak için 40X objektif kullanın. Sağlıklı bir hücre çubuk şeklinde ve kendiliğinden sözleşme olmamalıdır. Bu gözle görülür ve eşit sözleşme cep 5-20 V&#39;de tempolu gerektiği zaman </li><li> Not: Fizyolojik analizi, yüksek kaliteli parçalanıp sindirilmesi gerekmektedir. Bu sağlıklı görünüyorsun ama pa yok hücrelere sahip olmaları mümkündür<html> fizyolojik analizi için de ce. Sindirim protokol, yüksek kaliteli, sağlıklı miyositleri almak için arıtma gerekebilir. Ayrıca, mutant veya hastalıklı kalpleri protokol değişiklikleri gerektirebilir. </li><li> Objektif rotasyon ve değişim diyafram böylece istenilen hücre ekran ve arka plan üzerinde yatay dizilmiş olan Ayarı görünür değil. </li><li> Miyositinin her sonuna kadar kenar algılama barlar hizalayın ve eşiği ayarlayın. Düzgün sarkomer ile hücrenin bir kısmı üzerinde sarkomer algılama hizalayın. Artık size bu bar yapabilirsiniz, sarkomer uzunluğunun daha doğru matematiksel model bu kadar uzun sarkomer iki popülasyonları üzerinde değil gibi olacaktır. </li><li> Pace hücreleri 2 Hz ve kayıt önce 10-15 saniye boyunca 5-20 V. </li><li> Kayıt izleme. Ortam ışığı iyi kalsiyum geçici kayıt için minimize edilmelidir. </li></ol> 6. Analiz <ol><li> Rasyometrik floresan ve hücre boyutlandırma veri toplama yazılımı kullanarak izlerini analiz edin. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Diğer Çalışmalar <ol><li> Fiksasyon ve immün, doğrudan ilaç etkileri, kısa vadeli kültürü ve atomik kuvvet mikroskobu değerlendirirken: Bu protokol dahil olmak üzere diğer deneyler çeşitli için kullanılabilir fazla hücreleri sağlar. </li></ol>

<ol><li>Babick, A. P., Dhalla, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Subcellular+Remodeling+in+Cardiac+Dysfunction+due+to+Congestive+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Principles+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure.</a> Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).</li>
<li>Nogami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-Related+Arrhythmias+Part+I%3A+Monomorphic+Ventricular+Tachycardias%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+and+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias.</a> Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).</li>
<li>Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohitologic+Evidence+Supports+Apoptosis%2C+IgG+Deposition%2C+and+Novel+Macrophage%2FFibroblast+Crosstalk+in+the+Pathologic+Cascade+Leading+to+Congenital+Heart+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block.</a> Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV1.2+Calcium+Channel+Dysfunction+Causes+a+Multisystem+Disorder+Including+Arrhythmia+and+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism.</a> Cell. 119, 19-31 (2004).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+Metabolism+of+Intact+Muscle+Cells+Isolated+from+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart.</a> Circulation Research. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteolin+Inhibits+Apoptosis+and+Improves+Cardiomyocyte+Contractile+Function+through+the+PI3K%2FAkt+pathway+in+Simulated+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion.</a> Pharmacology. 88, 149-158 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+Murin+Cardiomyocyte+Contractility+by+Nanomolar+%28-%29-Epigallocatechin-3-Gallate+the+Major+Green+Tea+Catechin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin.</a> Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+A+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Genetic+Manipulation+of+Adult+Cardiac+Myocytes+for+Confocal+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging.</a> J Vis Exp. (31), e1433(2009).</li>
<li>Vainio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neronostatin%2C+a+Novel+Peptide+Encoded+by+Somatostatin+Gene%2C+Regulates+Cardiac+Contractile+Function+and+Cardiomyocytes+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).</li>
<li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mechanisms+for+caspase+inhibition+protecting+cardiac+function+wth+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload.</a> Basic Research in Cardiology. , 108(2013).</li>
<li>Novaes, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Trypanosoma+cruzi+infection+on+myocardial+morphology%2C+single+cardiomyocyte+contractile+function+and+exercise+tolerance+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).</li>
<li>Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longstanding+Hyperthyroidism+is+Associated+with+Normal+or+Enhanced+Intrinsic+Cardiomyocyte+Function+despite+Decline+in+Global+Cardiac+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function.</a> PLoS One. 7, e46655(2012).</li>
<li>Papanicolaou, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+heart+function+and+maintained+response+to+cardiac+stresses+in+a+genetic+model+of+cardiomyocyte-targeted+deficiency+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).</li>
<li>Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FK%2B-ATPase+a2-isoform+preferntially+modulates+Ca2%2B+transients+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes.</a> Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).</li>
<li>Touchberry, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+is+a+novel+regulator+of+intracellular+calcium+and+cardiac+contractility+in+addition+to+cardiac+hypertophy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).</li>
<li>Helmes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titin+Determines+the+Frank-Starling+Relation+in+Early+Diastole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole.</a> The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kalite kardiyomiyositlerin izolasyonu uygulama ve optimizasyon bazı düzeyi gerektirir. Bu protokol büyük ölçüde sindirim sonucunu etkileyecek önemli adımları içermektedir. Performans ve protokol giderirken bu dikkatle düşünülmelidir. Kanülasyon ve perfüzyon için kalp kaldırılması süre az, ideal olarak, beş dakikadan daha aza düşürülmesi gerekmektedir. Buz soğukluğunda tamponda kalp fare çıkarılması ve kesme ve kanüle sonra buz soğukluğunda perfüzyon tampon maddesi içinde hemen kalp durulama da kaliteli bir sindirim şans...

Kardiyomiyositler kalp için kasılma kuvveti sağlar. Her miyosit, kasılma için gerekli olan organize hücre iskeleti ve kasılma elemanlarını içerir. Kalp sadece kardiyomiyositleri değil, aynı zamanda fibroblastları, bağ dokusunu ve Purkinje lifleri gibi modifiye miyositleri de içerir. Bu hücre tiplerinin herhangi birinde veya tümünde meydana gelen değişiklikler kalp yetmezliğinde görülebilir ve bu da kalp fonksiyon bozukluğunun nihai nedeninin belirlenmesini zorlaştırır. Başarısız bir kalbin azalmış ventriküler kontraktilitesinden önce, değişen derecelerde fibröz doku birikimi ve kardiyomiyositlerin hipertrofisi ve disfonksiyonu görülür1. Aritmiler, iletken hücrelerdeki(2) işlev bozukluğundan, kardiyak iletimi kesintiye uğratan fibrozdan3 veya kardiyomiyositlerdeki(1,4) iyon kanallarının ekspresyonundaki değişikliklerden kaynaklanabilir. Aslında, bu sorunlar genellikle karmaşık bir şekilde bir arada var olur.
Kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve incelenmesi, genel kalp fonksiyonu bağlamında tek tek miyositlerin kasılma ve elektriksel işlev bozukluğunun incelenmesine olanak tanır. Bireysel kardiyak miyositleri izole etmek için teknikler, kalbin bu 'beygir' hücresinin fizyolojisini daha iyi incelemek amacıyla 40 yıldan fazla bir süre önce geliştirildi. İlk olarak 1970 yılında gerçekleştirilen aort kanülasyonu yoluyla koroner perfüzyonun hayati gelişimi ile hücrelerin verimini ve kalitesini artırmak için izolasyon teknikleri geliştirilmiştir5. Bu makale, kardiyomiyosit izolasyonunu ve ardından oransal floresan ve hücre boyutlandırma veri toplama yazılımı kullanılarak kasılma ve kalsiyum geçişlerinin ölçümünü açıklamaktadır. Kalp hastalığının hem genetik hem de çevresel modellerinde, bu protokolün kullanılması hücre kontraktilitesi, sarkomerik kontraktilitesi ve gevşemesi, kalsiyum geçişleri ve hücre iskeleti bozulması hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu sistem genellikle ilaçların izole edilmiş kardiyomiyositler6,7 üzerindeki etkisini test etmek için kullanılır. Sistemi, yabani tip fareler ve dilate kardiyomiyopatiye yol açan bir mutasyona sahip fareler arasındaki kardiyomiyositlerin kontraktilitesini ve kalsiyum geçişlerini karşılaştırmak için kullanıyoruz.
Tek tek kardiyak miyositleri incelemenin, kardiyak anatomi ve fizyolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlere göre sayısız avantajı vardır. Ekokardiyografi ve elektrokardiyografi, genel olarak kalbin kasılma fonksiyonu ve elektriksel iletimi hakkında bilgi sağlar. Bu yöntemlerin hiçbiri, tüm organın seviyesinin altındaki işlev bozukluğunun nedenini veya doğasını açıklamaz. Kenar algılama ve sarkomer uzunluk algoritmaları kullanılarak bireysel kardiyomiyositlerin kontraktilitesinin ölçülmesi, kalbin kasılma hücresindeki değişikliklerin küresel kalp disfonksiyonu içinde mevcut olduğunu gösterebilir. Kalsiyum geçişlerinin ölçülmesi, hücresel düzeyde iyon akışındaki değişikliklerin kasılma disfonksiyonu veya aritmilere etkisini gösterir.
Tüm organ çalışmalarını tamamlamanın yanı sıra, bu protokol hücre altı bileşenler için kolayca boyanabilen hücreler sağlar. Tüm kalbin doku bölümlerini boyayarak hücre iskeleti değişikliklerini görmek mümkündür; Bununla birlikte, hücrelerin yalnızca bir kesiti görselleştirilebilir. Bütün bir kardiyomiyosit, tipik doku bölümünden daha kalındır ve kardiyomiyositlerin düzeni ve uzunluğu göz önüne alındığında, tüm hücreleri tek bir bölümde görmek zordur. İzole edilmiş kardiyomiyositler hemen tespit edilebilir ve çeşitli hücre iskeleti elemanları ve iyon kanalları için boyanabilir. Konfokal görüntüler, hücrenin tam kalınlıkta z-yığınları halinde derlenebilir. Ek olarak, izole edilmiş kardiyak miyositlerin boyanması, t-tübüller olarak bilinen zar istilaları gibi bölümlerde görselleştirilmesi imkansız olan bileşenlerin boyanmasına izin verir.
Kardiyak miyositlerin kültürlenmiş hücre hatları mevcuttur, bunların bazıları kardiyak miyositlere benzer transkripsiyonel profillere ve fenotipik özelliklere sahiptir. HL-1 hücre hattı gibi bazıları, bazı sarkomerik organizasyonları ve ilkel kasılma yeteneklerini bile korur8. Bu niteliklere rağmen, kültürlenmiş hücreler kardiyomiyositlerin "kutu araba" şeklinden ve t-tübül yapısından yoksundur ve daha az sarkomerik organizasyona sahiptir. Bu bileşenler, in vivo kardiyomiyositlerin işlevi için gereklidir. Ek olarak, kültürlenmiş hücrelerin kullanılması genetik manipülasyona izin verir, ancak in vivo fizyolojik manipülasyona izin vermez. İzole edilmiş kardiyomiyositler, hücresel organizasyonlarını çalışmak için yeterince uzun süre korurlar, ancak yine de kolayca görüntülenir ve hatta transdüksiyonyaparlar 9. 
İzole kardiyomiyositler son derece çok yönlüdür ve çeşitli deneysel koşullardan hücreleri aynı şekilde analiz etmek için bir substrat sağlar. Miyositlerin izolasyonu ve fizyolojik analizi, ilaçların6,7 veya küçük moleküllerin10, çevresel stres faktörlerinin11, enfeksiyon12, hastalık13 veya genetik mutasyonun14,15 kasılma ve/veya kalsiyum geçişleri üzerindeki etkisinin incelenmesi ve bir kardiyomiyosit15-17 içinde kasılma ve kalsiyum salınımının düzenlenmesinin incelenmesi dahil olmak üzere çeşitli deneyler için sayısız laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Bu stres faktörlerinden herhangi birinin uygulanmasıyla, kalp fonksiyonundaki değişiklikler, kardiyomiyositlerin kendisindeki değişikliklerin ve yara izi, iletkenlikteki değişiklikler veya hücre dışı matristeki değişiklikler gibi kalbin çevresindeki değişikliklerin herhangi bir kombinasyonuna bağlı olabilir. Bu, herhangi bir nedenden kaynaklanan kalp yetmezliği bağlamında bireysel miyosit yapısı ve işlevi ile ilgili araştırma sorularını yanıtlamak için ideal bir protokoldür.
Diğer tekniklere göre sayısız avantajı olmasına rağmen, izole kardiyomiyositlerin fizyolojik analizi her araştırma sorusu için ideal değildir. İzolasyon terminal bir prosedürdür, bu nedenle kardiyomiyositler farenin yaşamında yalnızca bir kez değerlendirilebilir. Bu, kohortlar kullanılarak ve hastalık gelişimi boyunca tek tek fareleri feda ederek veya izolasyondan önce klinik olarak önemli kalp yetmezliği olup olmadığını belirlemek için fareyi izleyerek kısmen üstesinden gelinebilir. Bu protokol kardiyomiyosit disfonksiyonunun meydana gelip gelmediğini belirleyebilse de, ek deneysel bilgi olmadan bu disfonksiyonun kalp yetmezliğinin temel nedeni olduğu sonucuna varılamaz. Kardiyomiyosit disfonksiyonunun kendisinin kalpteki diğer değişikliklere ikincil olması mümkündür. Bu zorluklara rağmen, kardiyomiyositleri incelemek, özellikle diğer deneylerle birleştirildiğinde, kalpteki işlev bozukluğunun doğasını belirlemede değerli bilgiler sunar. 
Aşağıdaki protokol, Vanderbilt Üniversitesi'nden Dr. Chee Lim tarafından sağlanan bir protokolden uyarlanmıştır. Kontraktilite ve kalsiyum akışı verileri, kalpleri genetik veya çevresel manipülasyonla karşılaştırmada yüksek oranda tekrarlanabilir ve yararlı olmasına rağmen, izolasyonun kendisi optimizasyon gerektiren tekniğe bağlı bir protokol olmaya devam etmektedir. Kalbin fareden çıkarılması ile kalbin aort kanülasyonu yoluyla perfüze edilmesi arasındaki süreyi en aza indirmek, kaliteli bir sindirim için çok önemlidir. Ek olarak, sindirim süresi ve enzim konsantrasyonu en yüksek kalitedeki miyositler için optimize edilebilir. Optimizasyon gerektirebilecek adımlar, optimizasyon önerileriyle birlikte aşağıda belirtilmiştir.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Bilim</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO 4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2 &middot; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td></td><td>Sigma G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Bütandion-monoksit (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz B</td><td>Roche Teşhis</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche Teşhis</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>İzofloran</td><td>Butler Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO ve susuz</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix hücre hızı ve floresan analiz sistemi</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu; m naylon örgü filtre</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G Luer-saplama adaptörü</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 boru</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve fizyolojik analizi

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Kalbin beygir hücresi olan kardiyomiyositler, kanı pompalamak için kullanılan kasılma kuvvetini oluşturan zarif bir şekilde organize edilmiş hücre iskeleti ve kasılma elemanları içerir. Bireysel kardiyomiyositler ilk olarak 40 yıl önce kalp kasının fizyolojisini ve yapısını daha iyi incelemek için izole edildi. Teknikler, koroner perfüzyon yoluyla enzimatik sindirimi içerecek şekilde hızla gelişmiştir. Daha yakın zamanlarda, izole edilmiş miyositlerin kontraktilitesini ve kalsiyum akışını analiz etmek, kalp yetmezliğinin hücresel ve hücre altı analizinde hayati bir araç sağlamıştır. Ekokardiyografi ve EKG'ler sadece organ düzeyinde kalp hakkında bilgi verir. Kardiyomiyosit hücre kültürü sistemleri mevcuttur, ancak hücreler, kalpte miyosit fonksiyonu için gerekli olan organize sarkomerler ve t-tübüller gibi fizyolojik olarak gerekli yapılardan yoksundur. Burada sunulan protokolde, kardiyomiyositler Langendorff perfüzyonu ile izole edilir. Kalp fareden çıkarılır, aort yoluyla bir kanüle monte edilir, sindirim enzimleri ile perfüze edilir ve hücreler artan kalsiyum konsantrasyonlarına sokulur. Kasılmayı analiz etmek için kenar ve sarkomer algılama yazılımı kullanılır ve elektriksel olarak tempolu kardiyomiyositlerin kalsiyum geçişlerini görselleştirmek için bir kalsiyum bağlayıcı floresan boya kullanılır; Hücresel değişikliklerin kalp fonksiyon bozukluğunda oynadığı rolün daha iyi anlaşılması. Geleneksel olarak kardiyomiyositler üzerindeki ilaç etkilerini test etmek için kullanılan bu sistemi, WT farelerinden ve farelerden alınan miyositleri dilate kardiyomiyopatiye neden olan bir mutasyonla karşılaştırmak için kullanıyoruz. Bu protokol, bilinen kalp fonksiyonuna ve bilinen genetiğe sahip farelerden alınan canlı hücrelerin karşılaştırılmasında benzersizdir. Genetik veya çevresel manipülasyon, enfeksiyon, ilaç tedavisi ve daha fazlası dahil olmak üzere birçok deneysel koşul güvenilir bir şekilde karşılaştırılır. Fizyolojik verilerin ötesinde, izole edilmiş kardiyomiyositler hücre iskeleti elemanları için kolayca tespit edilebilir ve boyanabilir. Kardiyomiyositlerin perfüzyon yoluyla izole edilmesi, çeşitli deneysel koşullarda kalp yetmezliğine eşlik eden veya kalp yetmezliğine yol açan hücresel değişikliklerin incelenmesinde yararlı olan son derece çok yönlü bir yöntemdir.

Kontraklil ve geçici kopyalamaları (Şekil 2) toplandığında, verileri kolayca uygun yazılım ile analiz edilir. Bütün izleme, veya bunların kısımları (Şekil 3) ortalama edilebilir. Kasılma çeşitli yollarla analiz edilebilir. Sistolik fonksiyonu için, bir kısalma zirve fraksiyonel kısalma, ya da zamanla daralma hızı ile kasılma büyüklüğünü ve daralma hızı değerlendirmek. Diyastolik fonksiyon% 50 kısalma ve gevşeme hızı zaman ile benzer şekilde analiz edilebilir. Kalsiyum geçişlerini, benze...

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Bu protokolün amaçları, bilinen genetiğe sahip yetişkin fare kalplerinden kardiyomiyositleri izole etmek için LOR perfüzyonunu kullanmak ve miyositlerin kontraktilitesini ve kalsiyum geçişlerini analiz etmektir. Heparin enjeksiyonunun ardından, kalp anestezi altındaki fareden çıkarılır. Kalp, aorta aracılığıyla perfüzyon tamponu içeren bir şırıngaya bağlı kanüle hızla monte edilir.Aort sabitlenir. Koroner arterleri temizlemek için bir dikiş ve tampon çözelti yavaşça perfüze edilir. Ardından kanül, akışkan perfüzyon tamponu içeren bir LOR aparatına monte edilir.Kalp, elle hissedilebilir derecede yumuşayana kadar kalsiyum içermeyen bir kollagenaz ve proteaz çözeltisi ile digeste edilir. Sol ventrikül, kalsiyum içermeyen tampon çözeltiye yerleştirilir ve pens ile hafif pipetleme yapılarak dağıtılır. Çözelti filtre edildikten sonra, ölü hücreleri uzaklaştırmak ve miyositlerin kalsiyum toleransını sağlamak için hücreler kademeli olarak daha yüksek kalsiyum konsantrasyonlarına tabi tutulur.Sağlıklı hücreler çubuk şekilliyken, ölü hücrelerde bu form görülmez. Miyositler daha sonra RA two A radyometrik kalsiyum bağlayıcı boya ile yüklenir ve mikroskop tablasına yerleştirilir. Analiz için,

isolation-and-physiological-analysis-of-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.

Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Antegrad Perfüzyon Yöntemi

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Öğrenin fare kardiyomiyosit izolasyonu ve fizyolojik analiz yöntemlerini. LOR perfüzyonu ile yetişkin fare kalplerinden hücre izolasyonu, kontraktilite ve kalsiyum geçişleri değerlendirilir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Daha fazla video keşfet