Toplanması ve analizi Arabidopsis Floem EDTA-kolaylaştırdı Yöntemi eksuda

Bu prosedürün genel amacı, içeriğini analiz etmek veya flom akışı içindeki bileşiklerin varlığını doğrulamak için Arabidopsis veya diğer bitkilerden flom eksüda toplamaktır. Bu, deniz elementinin sızdırmazlığını önlemek için önce taç yaprağının potasyum EDTA içinde kesilmesi ve inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, sonraki analize müdahale edebilecek ve ayrıca uzun süreli maruz kalma sırasında hücrelere zarar verebilecek kalan EDTA'yı çıkarmak için taç yaprağını iyice yıkamaktır.

Daha sonra, akış EM eksüdaları suya toplanır. Son adım, L-C-M-S-G-C-M-S jel, elektroforez ve ince tabaka kromatografisi ile müteakip analiz için numune hazırlamaktır. Sonuç olarak, EDTA ile kolaylaştırılmış hem eksüdasyonu, metabolitler ve lipitler, proteinler veya RNA'lar gibi hem içeriklerini analiz etmek ve doğrulamak için kullanılabilir.

Bitkiler olumsuz koşullardan kaçamazlar. Sonuç olarak, çevresel sinyalleri tesisler boyunca iletmek ve gelişimi değiştirerek yanıt vermek için çok verimli ve hızlı sistemlere ihtiyaç duyarlar. Bu sinyal yollarından biri, bileşimini anlamak için oldukça karmaşık olan bitki akışıdır.

Akış içeriğinin toplanması ve analizi için EDTA kolaylaştırılmış akış sedasyonunu kullanıyoruz. Başlangıçta Perilla'da kral tarafından geliştirilmiştir ve ancak diğer türler için kolayca değiştirilebilir. Prosedürü göstermek, bu prosedüre başlamadan önce laboratuvarımdan her ikisi de lisans öğrencisi olan Elena ve US olacaktır.

Grow Arabidopsis, koleksiyon gününde 12 saatlik bir fotoğraf periyodu ile büyüme odalarında dört ila altı hafta boyunca planlar. Önceden hazırlanmış 100 milimolar potasyum EDTA çözeltisi, 20 milimolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için su ile seyreltilir. Daha sonra, yedi ila 15 santimetre çapındaki iki cam tabağı yarıya kadar 20 milimolar potasyum EDTA çözeltisi ile doldurun.

Bittiğinde, 1.7 mililitre reaksiyon tüplerini 1.4 mililitre 20 milimolar potasyum EDTA çözeltisi ile doldurun. Daha sonra eşit sayıda reaksiyon tüpünü 1.4 mililitre milipor su ile doldurun. Dört ila altı haftalık bitkileri büyüme odalarından çıkardıktan sonra, rozet yapraklarını, taç yaprağının dibinde rozetin merkezine yakın bir yerde bir tıraş bıçağıyla keserek hasat edin.

Yaprakları hemen 20 milimolar potasyum EDTA içeren tabaklara yerleştirin ve peolenin kesilmiş ucu çözeltiye batırın. Üç ila dört bitkiden 15 yaprak toplandıktan sonra, kesilmiş yapraklar birbiriyle hizalanacak şekilde nazikçe üst üste istifleyin. Yaprakların tabanını yeniden kesin ve yaprakları yavaşça yuvarlayın.

Bunu takiben, haddelenmiş yaprakları eksüda toplama için 20 milimolar potasyum EDTA içeren reaksiyon tüplerinden birine yavaşça yerleştirin. Karanlık çizgide, ıslak kağıt havlularla büyük, sığ bir tabağın dibi. Yaprak dolu reaksiyon tüpleri ile rafı tabağa yerleştirin ve havalandırma için yarıkları olan siyah bir plastik torbaya koyun.

Ardından eksüda toplama için tüm kurulumu bir dolaba yerleştirin. Işık hattında, ıslak kağıt havlulu şeffaf bir pleksiglas kabın dibi. Yaprak dolu reaksiyon tüplerinin bulunduğu rafı kabın içine yerleştirin ve kapatın.

Rafı kaptan çıkardıktan bir saat sonra yaprakları reaksiyon tüplerinden çıkarın. Tüm EDTA'yı çıkarmak için yaprakları damıtılmış suyla iyice yıkayın. Yaprakları hemen kırlangıçlı su içeren reaksiyon tüplerine aktarın ve rafın nemlendirilmiş kaptan çıkarılmasını takiben eksüdaların toplanması için nemlendirilmiş kaplara geri koyun.

Beş ila sekiz saat sonra, yaprakları tüplerden çıkarın, ardından akış eksüdalarını sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Ertesi gün daha fazla analiz için, lipit analizine hazırlanırken numuneleri çözdürün. Daha sonra iki ila üç numune çekin ve birleşik çözeltiye eşit miktarda kloroform ve metanol ekleyin.

Karışımı birkaç saniye girdaplayın. Ardından, numuneyi 400 g'da dört dakika santrifüjleyin. Bittiğinde, bölmeyi üst faz ile üç kez daha tekrarladıktan sonra alt organik fazı bir cam tüpte toplayın, birleşik organik fazları bir nitrojen akışı altında kurutun ve ince tabaka kromatografisi ve LCMS analizine tabi tutun.

Bu yöntem, hem lokalize proteinleri ve gelişime veya strese yanıt olarak seviyelerindeki değişiklikleri tanımlamak için yeterli phem eksüdasının toplanmasına izin verir. Bazı durumlarda, araştırmacılar proteinlerin bozulmasını önlemek için proteinaz inhibitörleri kullanmak isteyebilirler. Burada gösterildiği gibi, proteinler çok düşük miktarda bulunur, ancak seviyeleri sonraki proteomik deneyler için yeterince yüksektir.

LCMS veya batı lekesi analizi için kullanılan kabakgillerdeki bulgular, STEM'in kesilmesinin su potansiyel dengesinin bozulmasına ve ardından su akışına ve alasttan olası kirleticilere yol açtığını göstermektedir. Bununla birlikte, bir ila sekiz saat arasında değişen süreler için toplama, OpSys akışı M protein profilini ve bileşimini etkilemez. Toplanan protein miktarı ve bulunan proteinlerin paterni, türler ve tedaviler arasında değişir.

Sonuç olarak, protein sinyalleri görselleştirilebilir, tanımlanabilir ve takip edilebilir. mRNA ve mikroRNA'lar da bu yöntemle flom eksüdalarında tanımlanabilir. Bununla birlikte, MR'nin bozulmasını önlemek için RNA inhibitörü ile tedavi gereklidir. Uzatılmış eksüdasyon süresi boyunca NA.

C elementleri fonksiyonel kloroplast içermediğinden, rubis, küçük veya büyük alt birim mRNA'lar negatif kontrol olarak kullanılabilirken, ubikitin konjuge enzimi gibi bilinen pH flu m lokalize mRNA'lar pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Benzer şekilde, şekerler veya küçük metabolitler GCMS veya LCMS kullanılarak analiz edilebilir. Hem eksüdaların, neredeyse tüm glikolitik yol dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyonel enzim içerdiği belirtilmelidir.

Bu nedenle, birkaç zaman noktasının kullanılması, eksüda toplama sırasında metabolik süreçleri ortaya çıkarabilir. Tüm eksüdalarda, sukroz en bol bulunan metabolittir. Bu, bir saatlik bir koleksiyondan sonra en belirgindir.

Bununla birlikte, beş saat sonra, sükroz / fruktoz oranı biraz azalır. Aynı eksüda bir saat boyunca toplanır ve daha sonra dört saat daha tezgahta bırakılırsa, sükroz/fruktoz oranı çok daha büyük ölçüde azalır. Hem eksüdalardaki aktif enzimlerin oda sıcaklığında sakarozun bozulmasına yol açtığını düşündürmektedir.

Ek olarak, beş saat boyunca sürekli toplamanın sakaroz-fruktoz oranında sadece hafif bir azalma göstermesi, moleküllerin refakatçi hücrelerden deniz elementlerine hem yüklemesi ve taşınmasının, sistem canlılığını kaybedene kadar eksüdasyon sırasında devam edebileceği bulgularıyla tutarlıdır. Phem eksüdalarındaki lipitler ve buna bağlı olarak uzun mesafeli lipit sinyalizasyonu, bitki biliminde oldukça yeni bir ilgi alanıdır. Hidrofobik yapıları nedeniyle, lipitler yalnızca düşük konsantrasyonlarda bulunur ve çözündürme için diğer moleküllere bağlanabilir.

Yine de EDTA kolaylaştırılmış eksüdasyon, çeşitli bitki türlerinden akışı ve lipitleri görselleştirmek ve tanımlamak için yeterli materyalin toplanmasına izin verir. Burada gösterildiği gibi, ince tabaka kromatografisi kullanılarak birkaç lipit türünü ayırmak mümkündür. LCMS, farklı lipid türlerinin tanımlanmasına ve farklı genotiplerin veya tedavilerin lipid profillerindeki değişikliklerin izlenmesine olanak tanır.

Bu, bitki gelişimi ve stres tepkisi sırasında lipitlerin rolünün incelenmesine izin verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse üç saat kadar kısa bir sürede yapılabilir. Bununla birlikte, çoğu örnek için beş ila sekiz saatlik bir toplama süresi öneririz.

Bu durumda, yaprak hasadının sabahın erken saatlerinde başlaması önerilir. Bu prosedür diğer bitkiler için değiştirilebilir ve yeni akış bileşiklerinin keşfedilmesine veya doğrulanmasına yol açabilir. Bu prosedürü denerken, EDTA'yı çıkarmak için ilk saatten sonra PDL'leri iyice izlemeyi ve diğer hücrelerin içeriğiyle kontaminasyonu önlemek için yaprakları sıkmamayı unutmamak önemlidir.

Ek olarak, eldiven giymek, numunelerinizi cildinizden bulaşabilecek kontaminantlardan da korur Kontaminasyonu önlemek için protein, RNA veya metabolit numuneleri için uygun kontrolleri kullanın. Önerilen kontroller metin protokolünde listelenir. Bu yöntem, bitki akışının bileşimi hakkında yeni bilgiler edinmemizi sağladı.

Eksüda formunda, zeminin sulu ortamında beklenmeyen birkaç lipit tanımlayabildik. Bu, bizi ve diğerlerini, şimdi heyecan verici yeni bir alan implant araştırmasına dönüşen uzun mesafeli lipid sinyalizasyonu kavramını tanıtmaya yöneltti.