Sürekli Tasarımı ve İşletilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bitkinin tamamında homojen olarak veya yapısal ve metabolik dokularda farklılaşmış şekilde, karbon 13 ve azot 15 bakımından yüksek düzeyde zenginleştirilmiş bitki materyali üretmektir. Bu işlem, öncelikle bitki büyümesi için hava sızdırmaz bir hazne oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bitkiler için uygun büyüme koşullarını sürdürmek amacıyla hazne içerisindeki sıcaklık, nem ve karbondioksit seviyelerinin kontrol edilmesidir.

Ardından bitkiler, 13 C içeren hava, karbondioksit ile azot 15 içeren sulama ve gübreleme ile birlikte kapalı oda içerisinde büyütülür. Son adım, metabolik materyallerinin karbon 13 ve azot 15 bakımından daha az zenginleşmiş olması için, farklı şekilde etiketlenmiş bitkilerin hasattan haftalar önce odadan çıkarılarak etiketlemenin durdurulmasıdır. Bitki materyali hasat edildikten sonra, yapısal bitki bileşenleriyle karşılaştırmalı olarak genel izotop etiketlemesini ve etiketleme gücündeki farklılıkları ölçmek için sıcak su ekstraksiyonu ve izotop oran kütle spektrometrisi kullanılır.

Sürekli etiketlemenin, yapraktan uygulama veya tekrarlanan puls etiketleme gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, metabolik veya yapısal bileşenleri farklı şekilde etiketlenebilen, homojen olarak etiketlenmiş bitki materyali üretmesidir. Bu prosedüre başlamak için, 3,18 mm kalınlığında şeffaf akrilik duvarları ve 6,35 mm kalınlığında şeffaf akrilik bir tavanı, beyaz boyalı çelik tabanlı bir alüminyum çerçeveye monte ederek, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde etiketleme kabinini oluşturun; kabinin boyutları belirli bitki büyüme ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Burada gösterilen kabin 1,2 x 2,4 x 3,6 metre ölçülerindedir ve 40 adet 15 litrelik saksı alır; tüm ek yerlerini yeterli miktarda silikon sızdırmazlık malzemesi ile kapatarak kabinin hava sızdırmaz olduğundan emin olun.

Kapağı, sökülebilir kelebek somunlar kullanılarak sıkılıp gevşetilebilen makine vidalarına monte edin. Etiketleme odasına doğrudan komşu olan bölgede hava sızıntısını önlemek için kapağı hava sızdırmazlık fitili ile mühürleyin. Kontrol merkezini monitöre monte edin ve oda içindeki sıcaklığı, nemi ve karbondioksiti ayarlayın.

Hava sızıntısını önlemek için kamaraya giren elektrik kablolarının ve gaz borularının silikonla iyice sızdırmaz hale getirildiğinden emin olun. Işık geçirgenliğini artırmak ve gün uzunluğunu kontrol etmek için kamaraya isteğe bağlı olarak ışıklar ekleyin. Kamara sıcaklığını düzenlemek için, evaporatör bobinleri kamara içinde, kompresör ve kondenser bobinleri ise ısıyı dağıtmak amacıyla kamara dışında yer alan ticari bir split tipi klima kurun.

Ardından, hazneye küçük bir oda nem giderici yerleştirin. Nem gidericinin yanındaki zemine bir delik açın ve nem gidericiden gelen tahliye borusunu bu delikten geçirerek içi suyla doldurulmuş bir kavanoza aktarın. Bu işlem, tahliye için hava sızdırmaz bir mühür oluşturur ve basınç dengelenmesine olanak tanır; nem gidericiye bir nem sensörü ile birlikte omega eye serisi gibi programlanabilir bir kontrol cihazı bağlayarak haznedeki nemi düzenleyin.

Ardından, hava diyaframlı bir pompa aracılığıyla havayı sürekli olarak oda içerisinden çekip ER A üzerinden tekrar odaya geri gönderen bir kızılötesi gaz analizörü veya ER a kurun. Bu işlem, oda içindeki karbondioksit konsantrasyonu sürekli olarak izlenirken kapalı bir sistemin korunmasını sağlar. Daha sonra, iki saf karbondioksit gaz tüpünü karbondioksit kontrol sistemine bağlayın.

Tanklardan biri %10 atom oranında 13 C karbondioksit veya daha fazlasını, diğeri ise doğal bollukta 13 C karbondioksit içermelidir. Tank regülatörlerini 20 PSI'ye ayarlayın; regülatörlerden sonra, Ergo yazılımı ile karbondioksit enjeksiyonlarını kontrol etmek için gaz hatlarına solenoid valfler yerleştirin.

Solenoid valflerin açılıp kapanmasını, bir katı hal rölesi programı aracılığıyla ER rga'ya bağlayarak kontrol edin. Karbon dioksit konsantrasyonu oda içerisinde belirli bir değerin altına düştüğünde solenoid valflerin açılmasını tetiklemek için ergas yazılımında düşük bir alarm ve konsantrasyon üst set değerine ulaştığında valflerin kapanması için bir ölü bant (deadband) belirleyin. Solenoid valflerden sonra, iki gaz tankı hattının her birine bir dozajlama valfi takın ve bunları atmosferdeki istenen karbon 13 zenginleştirme seviyesine göre dikkatlice ayarlayın.

Burada %4,4 atom yüzdesi karbon 13 zenginleştirmesi kullanıyoruz. Çıkışları birbirine bağlayın ve son olarak hattı, etiketli karbondioksidin oda boyunca eşit şekilde dağılmasına yardımcı olmak için fanların arasındaki oda merkezine yönlendirerek sulama sistemini kurun. İlk olarak, saksı başına bir damlama sulama halkası oluşturun ve sulama borusunu oda duvarına açılan küçük bir delikten dışarıya doğru geçirin.

Ardından, oda dışına hava sızmasını önlemek için sulama borularının etrafındaki delikleri silikon derz dolgusu ile kapatın. Sulama aralıklarında hava sızmasını önlemek için sulama borularını peristaltik pompa borularına bağlayın ve üzerine küçük bir hortum kelepçesi takın; canlılığı sağlamak için saksılara dikmeden önce çimlendirin ve fideleri taze toprak bulamacı ile inoküle edin. Yararlı mikropları tanıtmak için, topraktan tanımlanmamış karbon ve azot girişini ortadan kaldırmak amacıyla saksıları topraksız bir saksı karışımıyla doldurun.

Burada kum vermikülit karışımı ve profil gözenekli seramik kullanıyoruz. Tohumlar çimlendikten sonra, fideleri minimum saksı toprağı bulunan saksılara dikkatlice şaşırtın. Ardından saksıları kamaraya yerleştirin ve her bir saksıyı bireysel bir sulama hortumu ile düzenekleyin.

Son olarak, karbon dioksit konsantrasyonu en az 200 ila 250 ppm seviyesine düşene kadar hava pompasına bir soda lime temizleyici bağlayarak dış karbon dioksiti temizleyin ve hazne kapağını mühürleyin. Hazneyi tekrar 400 ppm seviyesine doldurmadan önce, 13 C karbon dioksit tank karışımını kullanarak, doğal bolluktaki karbon dioksit kontaminasyonunu en aza indirmek için yetiştirme sezonu boyunca hazneyi kapalı tutmaya çalışın.

Öncelikle, atom yüzdesi %98 olan azot 15 potasyum nitratı, doğal bolluğa sahip azot 15 potasyum nitrat ile karıştırarak azot 15 ile işaretlenmiş bir hyland tipi gübre çözeltisi hazırlayın ve ardından bunu hookin çözeltisinin geri kalanına ekleyin. Burada gübreleme için atom yüzdesi %7 olan bir azot 15 çözeltisi kullanıyoruz. Azot 15 ile işaretlenmiş gübre çözeltisini sulama tüpleri aracılığıyla beslemek için bir peristaltik pompa kullanın.

Sulama hortumlarını UNC klemplerle sabitleyin ve gübrei, talebe ve deneysel tasarıma göre tekil bitkilere farklı miktarlarda dağıtın. Ardından, gübreyi sulama hortumlarından temizlemek için hortumlar üzerinden su pompalayın. Gübre israfını en aza indirmek için eklenen toplam sıvı miktarı, saksıların su tutma kapasitesini aşmamalıdır.

Hücre hava sızıntısını gidermek için gübreleme ve sulama sonrası tüm hortumları kelepçeleyin. Yapısal ve metabolik bileşenlerin farklı şekilde etiketlenmesi için, bitkileri hasattan bir ila üç hafta önce etiketleme hücresinden çıkarın. Tekdüze şekilde etiketlenecek bitkileri hasada kadar hücre içinde tutun.

Senesansı indüklemek için, hazır olduğunuzda sulamayı kesin. Bitkileri önce yer üstü biyokütlesini budayarak hasat edin.

Yer üstü biyokütle hasat edildikten sonra, kökleri saksı karışımından ayırmak için saksı karışımını ve kökleri altı milimetrelik bir elek üzerine boşaltın. Ardından, kalan saksı materyallerini temizlemek için kökleri iki milimetrelik bir elek üzerinde durulayın. Köklerle birlikte topaklanmış olabilecek saksı karışımını temizlemek için gerektiğinde cımbız kullanın ve ardından köklerin, gelecek deneylere hazırlık amacıyla havada kurumasını sağlayın.

Üç büyüme sezonu boyunca, oda sıcaklığı kontrol merkezinde ayarlandığı şekilde 26 ve 29 °C arasında, nem %36 ve %56 arasında ve karbondioksit konsantrasyonları 360 ve 400 ppm arasında başarıyla tutulmuştur. Burada, Andra Pogon Girard di'nin 2011 büyüme sezonuna ait temsili sonuçlar gösterilmektedir. Gece solunumu sırasında meydana gelen karbondioksit birikiminin büyüyen bitkilere zarar vermediği ve gün doğumundan sonra hızla absorbe edildiği görülmektedir.

Hedeflenen %7 atom yüzde azot-15 içeren Höglind çözeltisi aracılığıyla yapılan azot-15 işaretlemesi, %6,7 atom yüzde azot-15 ile yüksek derecede işaretlenmiş bitki materyali üretmiştir; hedeflenen azot-15 işaretlemesindeki hafif seyrelme, saksı karışımındaki bazı doğal bolluktaki azottan veya doğal toprak inokülasyonundan kaynaklanmış olabilir. Hedeflenen %4,4 atom yüzde 13C karbondioksit kullanılarak yapılan karbon-13 işaretlemesi, %4,46 atom yüzde karbon-13 ile sonuçlanmıştır. Homojen olarak işaretlenmiş bitki materyalinin tamamı boyunca, hasattan 7, 14 veya 22 gün önce kameradan çıkarılan farklı şekilde işaretlenmiş bitkiler, karbon-13 ve azot-15 açısından anlamlı bir fark göstermiştir.

Sıcak su ekstraktları olarak elde edilen metabolik bileşenlerdeki ve sıcak su ekstrakt kalıntıları olarak elde edilen yapısal bileşenlerdeki içerik, metabolik ve yapısal bitki materyallerinin farklı şekilde işaretlendiğini göstermektedir. Geliştirilmesinin ardından, sürekli çift izotop işaretleme, biyojeokimya alanındaki araştırmacıların bitki bileşenlerinin çevredeki kaderini ve dönüşümünü makro ve nano ölçekte keşfetmelerinin önünü açmıştır.