Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Bu prosedürün genel amacı, uzun süreli in vivo ışık sayfası mikroskopisi için bir zebra balığı embriyosunu sabitlemektir. Bu işlem, öncelikle florlanmış etilen propilen veya FEP tüpünün temizlenmesi ve Metilselüloz ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ilgili zebra balığı embriyosu kaplanır.

Ardından embriyo önce eritilmiş agaroza, daha sonra ise kaplanmış FEP tüpe aktarılır. Son olarak, tüpün alt kısmı bir aros tıpa ile kapatılır ve monte edilen embriyonun yönelimi dikkatlice kontrol edilir. Nihayetinde, in vivo ışık sayfası mikroskopisi aracılığıyla, zebra balığı embriyolarının birkaç gün boyunca yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle, herhangi bir rahatsızlık verilmeden gelişimini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Mevcut tekniklere göre temel avantaj, süper zebra balığı embriyolarını artık sadece birkaç saat değil, birkaç gün boyunca gözlemleyebiliyor olmamızdır. Bu yöntem, ışık sayfası mikroskobisi kullanarak zebra balığının uzun vadeli embriyogenezi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, küçük deniz organizmaları gibi diğer küçük organizmalara da uygulanabilir.

Ayrıca optik projeksiyon tomografisi, geniş alan mikroskopisi veya konfokal mikroskopi gibi diğer mikroskopi teknikleriyle de kullanılabilir. Bu yöntemde yeni olan kişiler, protokolün zaman açısından kritik bazı adımlar içermesi ve embriyonun nihai konumunu belirlemenin belirli bir uzmanlık gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bir FEP tüpü hazırlamak için öncelikle, tüpü bir molar sodyum hidroksit ile defalarca yıkayarak temizleyin. Ardından tüpü, 0,5 molar sodyum hidroksit ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca ultrasonik banyoda bekletin.

Polimer tüpü, distile deiyonize su içeren küçük bir kaba aktarın ve yıkayın. Ardından, tüpü yeni bir santrifüj tüpüne aktarmadan önce %70 etanol ile yıkayın. Etanol ile ultrasonik banyoda temizleyin.

Tüpü küçük bir kap içindeki distile deiyonize su ile durulayarak temizlemeden önce 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, temiz FEB tüpünü üç santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin ve gerekirse onları düzeltin. Temizlenmiş tüpleri, distile deiyonize suyla doldurulmuş yeni bir 50 mililitrelik tüp içinde saklayın.

Trica stok çözeltisini hazırlayın. Metin protokolüne uygun olarak %3 Metilselüloz ile hem %1,5 hem de %0,1 Aros hazırlayın. %1,5 agarro'yu eritip yaklaşık iki milimetre kalınlığında bir tabaka oluşturacak şekilde bir Petri kabına dökün.

Seçilen floresan geni pozitif eksprese eden zebra balığı embriyolarını istenen evrede toplayın ve bir stereoskop altında taze E3 ortamı içeren yeni bir kaba aktarın. İki adet keskin pens kullanarak, bir pensle korionu tutun ve ikinci pensle korionu yırtıp çekerek embriyoları dikkatlice soyun ve çok katmanlı montaj işlemini gerçekleştirin. Eldivenli ellerle, künt uçlu bir kanülü şırıngaya takın.

Kanülü, temizlenmiş bir FEP tüp parçasının bir ucuna yaklaşık üç milimetre derinliğinde dikkatlice yerleştirin. Ardından, FEP tüpün boşta kalan ucunu %3 Metilselüloza daldırın ve tüpü solüsyonla doldurun. Daha sonra, metilselülozu boşaltmak için şırıngaya yavaşça bastırarak E three medium kullanın; daldırma ve boşaltma adımlarını tekrarlayın.

Bu sırada, bir ısıtıcı blokta, 0.1%aros'tan bir alikotu 70 °C'ye kadar ısıtın. Reaksiyon tüpünü, 38 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı bloğa aktarmadan önce kısa süre vorteksleyin. Isıtma işleminden sonra, tüpün kısa bir süre soğumasını bekleyin ve final konsantrasyonu 133 ila 200 mg/L olacak şekilde trica ekleyip vorteksleyin.

Yine, cam pastör pipeti kullanarak, kaplanmış bir embriyoyu önceden ısıtılmış aros içeren reaksiyon tüpüne, mümkün olduğunca az E three aktararak transfer edin. FEP tüp ve bağlı şırınga ile, embriyoyu almadan önce az miktarda aros çekin ve tüpü tamamen aros ile doldurun.

Embriyo, başı açıklığa bakacak şekilde tüpün herhangi bir ucuna yerleştirilmelidir. İçeriğin sızmasını önlemek için tüpü, ağzını tıkayacak şekilde yatay konumda tutun. Kanülden kesip çıkarmak için bir jilet kullanın.

Ardından tüpü dik tutarak ucunu yavaşça 1,5% agaroza tamamen batırın ve hafifçe döndürün. Kurumayı önlemek için, görüntüleme öncesinde monte edilmiş örneği E3 ortamı ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde saklayın. FEP tüp içindeki balığın düz konumlandırıldığını ve ardından görüntüleme için başının doğrudan tıpanın üzerinde durduğunu doğrulayın.

Görüntüleme odasının içindeki ortama trica ekleyin. Burada, vaskülatür gelişimini gözlemlemek amacıyla iki gün boyunca görüntülenen, döllenmeden bir gün sonraki transgenik K-G-R-L-G-F-P zebrafish embriyosu gösterilmektedir.

Zebrafish, montaj ortamı ile kısıtlanmaz ve normal bir şekilde gelişebilir. Örneğin, başı yükselir. Kuyruk uzar ve vasküler tomurcuklanma engelsiz bir şekilde görülür.

Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında ve tüm malzemeler hazır olduğunda 10 dakika içinde tamamlanabilir. Tüm ana adımları herhangi bir gecikme olmaksızın gerçekleştirmeyi unutmayın. Kirler nihai görüntü kalitesini bozabileceğinden tüm çözeltileri temiz tutun.