Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Bu prosedürün genel amacı, ortotopik mesane kanseri ksenogreftlerini hızlı, hassas ve minimal invaziv bir yöntemle oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili tümör hücre hattının genişletilmesi ve tümör hücrelerinin Matrigel içinde süspansiyona getirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hayvan görüntüleme platformuna yerleştirilir ve mesane ultrason yardımıyla görüntülenir.

Ardından, mesanedeki mukoza ve kas tabakaları salin enjeksiyonu ile birbirinden ayrılır. Son olarak, tümör hücresi matrigel süspansiyonu yapay olarak oluşturulan bu boşluğa enjekte edilir. Nihayetinde, ultrason görüntüleme ve biyolüminesans aracılığıyla tümör büyümesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, primer ksenogreftlerin inoklasyonu için laparotomi kullanımı gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı; bu yaklaşımın hızlı, kesin ve minimum düzeyde invaziv olmasıdır. Bu tekniklerin etkileri, oto ksenogreftlerin yeni tedavilerin preklinik çalışmaları için altın standart olması nedeniyle mesane kanserinin teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır. Enjeksiyon basamaklarının öğrenilmesi oldukça zor ve su yolu çok ince olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu prosedürün gösterilmesi faydalı olacaktır.

Igor Mosca'nın bir araştırma asistanı ve Wolfgang Yeager'ın bir doktora sonrası araştırmacısı bulunmaktadır. Her ikisi de ürologdur. İlgili insan mesane kanseri hücre hatlarının kimliklerini doğruladıktan sonra, bu çalışma için hücre hatlarını transfect etmek amacıyla, xenograft tümörlerin biyolüminesans büyüme analizini yapmak üzere ateş böceği lusiferaz geni taşıyan bir lentiviral konstrükt kullanın.

Prosedüre başlamaya hazır olduğunuzda, mevcut hücre hatlarını genişletmek için %10 FBS içeren DMEM çözündürün ve kullanın; 37 °C'de, nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde inkübe edin. Çözündürme sonrası enjeksiyon için hücre süspansiyonu hazırlamak amacıyla, matrigel ve buz üzerinde tutulan tripsin kullanarak %70 konfluense ulaşmış hücreleri normal büyüme ortamı ile süspande edin, ardından hücreleri sayın ve süspansiyonu 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hayvan başına 40 µL hacminde enjeksiyon yapmak için istenen hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde eşit hacimlerde uygun miktarda DMEM-FBS ve MATRIGEL ekleyin.

İyi bir şekilde karıştırın ve herhangi bir düz, sert plastik malzeme kullanarak hava kabarcığı oluşmasını önleyin. Bir mesane stabilizatörü kesin, kayışı dikkatlice inceleyin ve farelere uygulamadan önce tüm keskin kenarları giderin. Dişi fareleri oksijen içinde %3 isoflurane ile anesteziye tabi ettikten ve ayak parmağı sıkıştırma testi uyguladıktan sonra.

Yeterli sedasyon sağlamak için hayvanı, küçük hayvan görüntüleme platformunun ısıtmalı görüntüleme masasına yerleştirin ve yaşamsal bulgularını bir lastik bant yardımıyla sürekli olarak izleyin. Alt ekstremiteleri sabitleyin ve steril bir pamuklu çubukla cildi silmeden önce abdomeni dezenfekte etmek için %0,5 klorheksidin glukonat kullanın. Ardından, intramural enjeksiyon sırasında mesanenin kaymasını önlemek için mesane stabilizasyon kayışını kullanarak mesaneyi immobilize edin.

Ardından, alt karın bölgesine steril ultrason jeli uygulayın. Ultrason tarama başlığını cilde yavaşça ilerletin ve mesaneyi ultrason ekranında görüntüleyin. Mesane boşsa, mesane duvar katmanlarını birbirinden ayırmak için transüretral 24 gauge anjiyo kateteri ile 50 µL ılık PBS kullanarak mesaneyi doldurun.

PBS ile doldurulmuş ve 30 gauge üç çeyrek inçlik bir iğneye bağlanmış 1,0 mililitrelik bir şırıngayı şırınga klemine takarak başlayın. İğneyi pubik kemiğin hemen üzerindeki deri bölgesine doğru konumlandırın. 30 ila 45 derecelik bir açıyla, deriyi ve karın duvarı kaslarını yavaşça delmeden önce iğneyi ultrason ekranında tespit edin.

Ardından, iğnenin eğimli ucunu posterior yöne bakacak şekilde 180 derece döndürün ve iğne ucunu mukozayı delmeden mesane duvarına yerleştirin. Daha sonra, yapay bir boşluk oluşturmak için iğneyi geri çekmeden önce kas tabakası ile mukoza arasına yavaşça 50 µL PBS enjekte edin. Mesane kanseri hücrelerini enjekte etmek için, kanser hücresi matrigel süspansiyonu ile doldurulmuş ikinci bir 1,0 mL şırıngayı ve 30 gauge üç çeyrek inçlik bir iğneyi şırınga klembine takın.

İğnenin ucunu PBS ile doldurulmuş boşluğa yönlendirin. Yeni oluşturulan süspansiyondan 40 µL'yi boşluğa enjekte edin. Ardından, fareyi görüntüleme platformundan çıkardıktan sonra iğneyi geri çekin.

Sürekli izleme altında, sıcak ve konforlu bir ortamda tutun. Bilinç ve normal yürüme yetisi geri kazandıktan sonra hayvanı tekrar kendi kafesine yerleştirin. Üç ardışık gün boyunca, 50 hayvana ultrason rehberliğinde üç farklı tümör hücre hattının intramural enjeksiyonu gerçekleştirilmiştir.

İnokülasyon verimli bir şekilde gerçekleştirilmiş olup, herhangi bir intra- veya post-intervensiyonel komplikasyon ile ilişkilendirilmemiştir. Tümör büyümesinin izlenmesi, ultrason görüntüleme ve biyolüminesans ile yapılmıştır. Üçüncü günde, 50 hayvanın tamamının anterior mesanesinde ultrason ile tümör saptanabilmiş ve uc.Three inokülasyonunu takip eden izlem süresince farelerin %98'inde sürekli tümör büyümesi gözlemlenmiştir.

Bir farede intraperitoneal tümör yayılımı gelişti ve ikinci bir hayvanda tümör yedinci günden sonra involüsyona uğradı. Bu, uc.Three ile inokülasyonun ardından bu yeni teknikle inoküle edilen ilk fare grubuydu. Luke uc, bir Luke ve uc.

13 Luke. Fareler sırasıyla 24, 28 ve 37. günlerde sakrifiye edildi. Xenograft tümörleri toplandı ve h ve d kesitleri aracılığıyla incelendi.

Tüm tümörler kas invaziv yapılıydı ve bazıları perivisseral yağa infiltre olmuştu, ancak komşu organlara invazyon gözlenmedi. uc'lerin %60'ı, 13 Luke ve uc'lerin %20'si. Üç Luke tümör taşıyan farede, H&E boyama ile doğrulanmış retroperitoneal lenf nodu metastazları gelişti.

Bu teknikle yeterlilik kazanıldığında, işlem üç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün gerçekleştirilebilmesi için ultrason görüntüleme konusunda deneyim sahibi olmak ön koşuldur. Tümörler bu şekilde inoküle edildikten sonra ultrason, yalnızca tümör büyümesinin zaman içindeki izlenmesine değil, aynı zamanda mikro kabarcıklar ile tümör perfüzyonunun incelenmesine de olanak tanır. Ayrıca bu yöntem, yeni deneysel ajanlarla intratümöral enjeksiyon yapılmasına da imkan sağlar.