Name: Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin, ultrason rehberliğiyle minimal invaziv mesane kanser ksenogratları oluşturmayı. Bu yöntem, hayrefahrefarelerde tümör büyümesini hızlı ve hassas bir şekilde izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, küçük hayvan ultrason görüntüleme platformu kullanımı konusundaki talimatlar için tümör hücre hatları ve Ben deeley viral iletimini gerçekleştirmek için Eliana Beraldi kabul etmek istiyorum. Bu proje Alman Vakfı Sistemi tarafından desteklenmiştir (DFG; JA 2117/1-1: 1), Kanada Kanser Topluluğu Araştırma Enstitüsü ve Vancouver Kıyı Sağlığı Araştırma Enstitüsü&#39;nden bir mentored Hekim Bilimci Ödülü. Ultrason görüntüleme platformu Yenilik Kanada Vakfı tarafından finanse edildi.

Bütün hayvan prosedürleri Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (CCAC) esaslarına göre gerçekleştirilmiştir. Protokol British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (: A10-0192 Protokol Numarası) tarafından onaylanmıştır. 1.. Hücre Hatları hazırlanması <ol><li> DNA parmak izi 7 ile ilgili insan mesane kanseri hücre çizgilerinin kimliğini teyit edin. </li><li> Biyolüminesans ile ksenograft tümörlerinin büyüme analizi için, ateş böceği lusiferaz geni taşıyan bir 3 lentiviral yapısı ile transfekte hücre çizgileri. </li><li> Çözülme ve nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı içinde mevcut olan hücre çizgileri (DMEM) genişletmek. Passage hücreler en az 3&#39;lü ama 3 ay aşan kültür kez kaçının. </li></ol> 2. Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması <ol><li> Matrigel çözülme. C&#39;nin altında tutunJelin artan viskozite önlemek için, 4 ° C. </li><li> % 70 bir izdiham hücreleri Trypsinize ve normal büyüme ortamında askıya. </li><li> Bir hemositometreyle veya otomatik hücre sayıcı ile hücre sayısını. </li><li> 200 x g, 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu dönerler. Süpernatant kaldırmak. </li><li> (8-15 x 10 6 / ml) kullanılan hücre hattı bağlıdır ve arzu edilen büyüme kinetikleri olan arzu edilen hücre konsantrasyonu elde etmek amacıyla, DMEM (% 10 FBS) ve Matrigel (1:1 oranında) uygun hacim. Tümör hücre süspansiyonu enjekte edilen hacim 40 ul olacak. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme (P1000) ile iyice karıştırın, süspansiyon hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. </li></ol> 3. Hayvanların hazırlanması Not: nedeniyle Adım 4.7 &#39;de transüretral kateterizasyon için potansiyel ihtiyaca, dişi farelerde, bu hayvan modelinde tercih edilen cinsiyet bulunmaktadır. <ol><li> Evi fareler, kurumsal ve ulusal hayvan bakımı gu göreidelines. Fareler ile ilgili tüm deneyler için etik kurul onay almak. </li><li> % 3 izofluran / oksijen karışımı ile fareler anestezi. Hayvanların uygun anesthetization (ayak tutam örneğin tepkisizlik) onaylayın. </li></ol> 4. Deneysel Setup <ol><li> Düz sert bir plastik malzemeden [Şekil 2] &#39;e sahip her türlü mesane stabilizasyon kesin. Dikkatle kayışı incelemek ve farelere uygulamadan önce herhangi bir keskin kenarları kaldırmak. </li><li> Vital bulguların sürekli izlenmesi ile küçük hayvan görüntüleme platformu [Şekil 1 I] ısıtılmış görüntüleme masasına hayvana binmek. [Şekil 1 III] bir lastik bant ile alt ekstremite düzeltmek. </li><li> % 2 klorheksidin glukonat ile karın dezenfekte ve steril ucu pamuklu cildinizi silin. </li><li> Mesane stabilizasyon askısı ile mesaneyi [Şekil 2 II] hareketsiz. Böylece, bir kaçırmaAdım 5.6 &#39;içi enjeksiyon sırasında mesanenin kaçınılacaktır. </li><li> Alt karın steril ultrason jeli uygulayın. </li><li> Yavaş yavaş ultrason scanhead (frekansı 40 MHz) cilde [Şekil 1, IV] (45-70 ° &#39;lik bir açı ile uzunlamasına kafatası) yaklaşımı ve ultrason ekrandaki mesane [Şekil 3, I] görselleştirmek. </li><li> Mesane boş ise, bir 24 transüretral G angiocatheter boyunca 50 ul steril, ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurun. </li></ol> 5. Mesane Duvar Katmanlar Ayırma <ol><li> PBS ile doldurulur ve bir 30 G bağlı bir 1.0 ml şırınga takın, ¾ iğne şırınga kelepçeye (öne doğru yönlendirilmiş konik). </li><li> 30-45 ° &#39;lik açı sadece kasık kemiği üzerinde deriye doğru iğne (ultrason scanhead uzunlamasına eksenine göre 80-90 ° [Şekil 1]) yerleştirin. </li><li> Iğne Algılamaultrason ekranında. </li><li> Yavaş yavaş deri ve karın duvarı kasları [Şekil 3 II] delebilir. </li><li> (Şimdi posteriora yönetti) iğne 180 ° eğim çevirin. </li><li> Mukozayı penetre olmadan mesane duvarının içine iğne ucu takın, [Şekil 3 III] </li><li> Yavaş yavaş yapay alanı [Şekil 3, IV] oluşturmak için kas tabakası ve mukoza arasındaki PBS 50 ul enjekte edilir. Not: mukoza yanlışlıkla adımı 5.6 esnasında delikli ise, yavaş yavaş iğneyi geri çekin ve mukoza tabakası iğne ucu üzerinde geri çevirdi sonra PBS 50 ul enjekte. </li><li> Iğneyi. </li></ol> 6. Mesane Kanseri Hücreleri İntramural Aşılama <ol><li> Bir 30 G ile (Matrigel içinde süspansiyon haline getirilmiş kanser hücreleri ile dolu), ikinci bir 1.0 ml şırınga takın, ¾ şırınga kelepçeye iğne. </li><li> Aynı için iğne ucu kılavuzAdımda 5.7 oluşturulan PBS dolu uzay. </li><li> Bu boşluk içine hücre süspansiyonu 40 ul enjekte [3 V ve VI Şekil]. </li><li> Iğneyi. </li></ol> 7. Post-girişimsel Destekleyici Bakım <ol><li> Görüntüleme platformdan fareyi ayırın. </li><li> Anestezi kurtarma sırasında sürekli gözetim altında bir sıcak ve rahat bir ortamda hayvan tutun. </li><li> Bilinç kazanmak ve normal ambulasyonu çıkıldıktan sonra, evde kafes geri hayvan. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
<li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse%3A+the+importance+of+orthotopic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li>
<li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Kang, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Bladder+Tumor+Model+and+the+Evaluation+of+Intravesical+saRNA+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li>
<li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+transplantable+orthotopic+rat+bladder+transitional+cell+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model.</a> Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).</li>
<li>Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+phototoxicity+of+5-aminolevulinic+acid-induced+PpIX+in+an+orthotopic+rat+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model.</a> J. Urol. 153, 802-806 (1995).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+view%3A+Genetic+profiling+reveals+decades+old+cross-contamination+of+bladder+cancer+cell+line+KU7+with+HeLa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa.</a> J. Urol. (13), (2013).</li>
<li>Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+liposome-mediated+interleukin-2+gene+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model.</a> Gene Ther. 7, 844-851 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Black, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

Bu video-makale için açık erişim FUJIFILM VisualSonics, Inc tarafından desteklenmektedir

Kanser tedavisinde hemen hemen tüm büyük gelişmeler klinik deneyler başlamadan önce, hayvan modellerinde test gerektirir. Kanser hayvan modelleri ve in vivo tümör biyolojisi okumak için araştırmacılar sağlayacak gerekli araçlardır. Ortotopik ksenogref modelleri 1,2 altın standart kalır ve (hücre hatlarının seçimi açısından) en esneklik sunuyor ve en pratik yarar var devam ediyor. Gösterilen prosedür doğrultusunda% 100 bir teknik başarı oranı ile üç farklı hücre çizgilerinin ultrason eşliğinde yapılan enjeksiyon ile ksenograft tümörlerinin önceden belirlenmiş gönder US et al. 12 tarafından tarif edilen ortotopik bir model bir minimal invaziv bir modifikasyonudur. Sürekli izlem sırasında, farelerin% 98 tümör hacminde sürekli bir artış göstermiştir. Minimal invaziv tekniği yaparak biz intramural modelin mevcut sınırlamaları ele başardık. Respe yanındahayvan refahı cting, bu prosedürün azaltılmış invazivliği da cerrahi komplikasyonların sayısını azaltarak in vivo deneylerin tekrarlanabilirliği katkıda bulunmaktadır. Oldukça abdominal laparotomi ve yara kapatılması için ilgili gereksinimini önlemek için etkili zaman. Biz (1.6 ±) 3.4 dk önemli hayvan başına işlem süresini azaltmak için başardık. Ancak, bizim yeni yaklaşımın baş avantajı doğruluğu. Yüksek çözünürlüklü ultrason bize mesane duvarının mukozasının altında tuzlu enjeksiyon yarattığı boşluk görüntülemenizi sağlar. Bu enjeksiyon, bir ilk adım, ikinci bir aşamada, tümör hücre enjeksiyonu kolaylaştırır ve tümör hücre dökülme riskini en aza indirir. Bu iğne yerleştirme görselleştirmek mümkün değildir ve enjeksiyon tam derinliği ilişkin belirsizlik unsuru her zaman vardır laparotomi sonra içi enjeksiyon tekniği ile tezat. Ayrıca, katı ön duvara mesane tümör hücrelerinin aşılanmasını olarak, tümör Büyümeposterior mesane duvarına h önlenir. Daha sonra üreter deliklerinin yakınında tümör büyüme nedeniyle obstrüktif komplikasyon oranı son derece nadirdir. Bu Ekteki etkisi daha uzun büyüme ve tedavi süreleri sağlar. Ultrason eşliğinde tümör aşılama ana sınırlama yeterli teknik donanım için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu prosedürün performans olası insan kanserinin hayvan modellerinde uzmanlaşmış merkezlerine sınırlandırılacaktır. Bu, yeni bir hayvan modelleme uzmanlığı ile bu kurum ve grupların dışında araştırma grupları arasında işbirliğini teşvik etmelidir. Ultrason görüntüleme ve bazı el becerisi ile aşinalık bağımlı olmasına rağmen, bu model yetkili talimat altında öğrenmek kolaydır. Prosedüründe önemli bir adım tuzlu su ile mesane duvarı yapay bir uzay submukozal yaratılmasıdır. Bu uzay perforasyon o olmadan oluşturulduktan sonramukoza tabakası f, birkaç dakika boyunca sabit kalır. Tümör hücrelerini aşılamak için bu boşluk içine ikinci bir iğne kılavuz oldukça basittir. Submukozal alanın oluşturulması sırasında ana komplikasyon mesane lümenine iğne perforasyonudur. Submukozal alanı yaratılması, ancak hala mümkün. İğne mesane duvarı içine yavaş yavaş geri gereken ve tuzlu mukoza tabakası iğnenin ucu üzerinde döndürür sadece zaman enjekte edilir. Bu manevra sonra, submukozal alan daha az kararlı olduğunu (tuzlu su, 30-60 saniye içinde mesane lümenine dışarı çıkar) ve tümör hücrelerinin enjeksiyonu hızlı bir şekilde yapılması gerekir. Mesane lümenine tümör hücrelerinin dökülme mukoza delinmesi ile bu gibi durumlarda ortaya çıkabilir. Intramural uzaydan tümör hücrelerinin kaybı takibinde azalan tümör hacmine yol olsa da, herhangi bir intravezikal tümör alımını gözlenmiştir hiç. Başka potansiyel complication enjeksiyon kanalı boyunca periton boşluğuna tümör hücrelerinin dökülme olan. Bu 50 hayvanlarda, sadece bir intraperitoneal tümör hücresi yayılmasını görülmektedir ve bu ilk girişimleri birinde meydana geldi. Biz, çok büyük bir tümör hücresi süspansiyonu hacminin enjeksiyon için bu özellik. Bu 50-40 ul gelen hacmini azaltarak başka periton dökülmesine neden olduğu gerçeği ile desteklenmiştir. Kemirgen kadavradan mesane kanseri xenograftlarının Bu minimal invaziv aşılama eşit araştırmacı ve hayvanları hem de yararlanarak, mevcut &quot;intramural modeli&quot; yenilikçi bir modifikasyonunu temsil eder. Bu modelin avantajı, böyle bir minimal invazif şekilde ortotopik yabancı doku nakli yapılan tümör oluşturmak amacıyla, böbrek, prostat, karaciğer gibi diğer organlara adaptasyonunun ediyoruz.

Kanser araştırma tümör biyolojisi anlayışımızı derinleştirmek amacıyla hasta tümörlerden türetilmiş hücre hatları kullanılarak, insan kanserinin hayvan modellerinde bağlıdır. Farklı tedavi stratejileri çerçevesinde canlılarda büyüme analizi için, sıçan kadavradan mesane kanseri modelleri referans standardı 1,2 kalır. Bağışıklığı baskılanmış farelerin (ksenogref modeli) insan mesane kanser hücrelerinin aşılama intravezikal damlatılması üzerinde mesane duvarına (&quot;intravezikal modeli&quot;) 3,4,5 veya direkt enjeksiyon (&quot;intramural model&quot;) 6,7 dayanır. Her iki teknik de sıçanlarda 8,9 yapılabilir. Intravezikal sonra yeni tedavi maddeleri daha sonra intravezikal damlatılması için uygun olan mesane ürotelyal yüzeyinde tümörlerin oluşumuna neden olmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntem ile verildiği zaman güvenilir olan tümörijenik hücre çizgilerinin sayısının sınırlı olduğud Bu hücre hatları, KU7 biri, son zamanlarda HeLa 4,10 olduğu gösterilmiştir. Intravezikal de zaman nedeniyle gerekli kalma kere alıcıdır ve bu sık sık idrar, üreter ve renal pelvis 11 dahil olmak üzere, üriner sistem bitişik elemanlar, tümör büyümesini uyarmaktadır. Ayrıca, instillasyon genellikle üreterler mesane girin mesane katında tümör büyümesine yol açar, ve bu üst üriner sistem tıkanıklığı ve eşlik eden böbrek yetmezliğine neden olabilir. Sistemik tedaviler için uygun olan birincil invaziv mesane kanseri ksenograftları mesane duvarı 12 içine, tümör hücrelerinin direkt enjeksiyonu ile oluşturulur. Çok sayıda hücre çizgileri, bu modelde, yeterli büyümeye rağmen, herhangi bir sınırlamaya insizyon 13 için ihtiyaç ilişkin modelin invaziv olan. Modeli nedeniyle de hassas kas duvara hücreler enjekte teknik zorluk öğrenmek için zordurmesane. Farelerde ortotopik primer invaziv mesane kanseri zenograftlarını kurmak için yeni bir yaklaşım &quot;intramural modeli&quot; varolan eksikliklerin giderilmesi amacıyla kliniğimizde geliştirilmiştir. Biz başarıyla kurulmuş invaziv modelini değiştirmek için bu yeni tekniğin sonuçlanan ön mesane duvarına mesane kanseri hücrelerinin perkütan, ultrason rehberliğinde enjeksiyon optimize başardık. Ayrıca, biz potansiyel &quot;intramural modeli&quot; doğruluk ve tekrarlanabilirlik gelişmiş var.

<table><tbody><tr><td>Klorheksidin glukonat (%2)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin (% 0.25)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SH3004202</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga (1 ml)</td> <td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik iğne (30 G; &frac34; içinde)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Anjiyokateter (24 G)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 küçük hayvan görüntüleme platformu</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706 ultrason tarama kafası</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>Kaliper Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen ortotopik mesane ksenogratflarının minimal İnvaziv kurulması

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Ortotopik mesane kanseri ksenograftları in vivo moleküler, hücresel manipülasyonlar ve yeni tedavi ajanları araştırmak için altın standarttır. Uygun hücre hatları intravezikal damlatma (kasa invaziv olmayan büyüme model) ya da mesane duvara içi enjeksiyon ile (invaziv büyüme model) ile aşılanır. Her iki prosedür, karmaşık ve oldukça zaman alıcıdır. Ayrıca, yüzeysel modeli tümörijenik şu instilasyon olan hücre hatları eksikliği nedeniyle eksiklikleri vardır. İçi enjeksiyonu, diğer taraftan, prosedürün invaziv ve ana fare için ilişkili morbidite nedeniyle zor edilir. Akılda bu eksiklikleri ile, biz kadavradan mesane kanseri zenograftlarını oluşturmak için minimal invaziv bir yaklaşım geliştirmek için önceki yöntemleri değiştirilmiş. Ultrason eşliğinde başarıyla mesane kanseri hücre hatları UM-UC1, UM-UC3 ve UM-perkütan aşılama gerçekleştirdik50 atimik çıplak içine UC13. Biz bu yaklaşımı, etkili, kesin ve güvenli bir zaman olduğunu göstermek mümkün olmuştur. Bu teknik ile, ilk olarak bir boşluk PBS ile mesane mukoza altında oluşturulur, ve tümör hücreleri, daha sonra ikinci bir aşamada bu alana enjekte edilir. Tümör büyümesi, biyolüminesans görüntüleme ve ultrason ile düzenli aralıklarla izlenir. Ortalama tümör hacimleri çalışma süresi boyunca bizim 50 farelerin biri ama tüm giderek artmıştır. Bizim kurum olarak, minimal invaziv, hızlı ve son derece hassas bir şekilde mesane kanseri ksenogref aşılanmasını sağlayan bu yeni yaklaşım, geleneksel modeli yerini aldı.

<html> Üç farklı tümör hücre çizgileri (UM-UC1 luc, UM-UC3 ve luc UM-UC13 luc) İntramural enjeksiyon üç gün üst üste ultrason eşliğinde 50 hayvanlara uygulandı. Aşılama verimli gerçekleştirildi (süresi 5.7 dakika / hayvan ortalama) ve herhangi bir intra-ya da post-girişimsel komplikasyonlar ile ilişkili değildi. Tümör büyümesinin izlenmesi ultrason görüntüleme ve biyolüminesans ile gerçekleştirildi. 3. gün bir tümör 50 hayvanların ön mesane [Şekil 4, I] &#39;de ultrason ile tespit edilebilir. Farelerin% 98 takip dönemi boyunca sabit tümör büyüme gösterdi [Şekil 4 ve 5]. UM-UC3 luc&#39;un Aşılama sonrası, bir fare periton tümör yayılmasını ve ikinci bir hayvan [Tablo 1] gündüz 7. sonra involuted tümör geliştirdi. Bu, bu yeni teknik ile aşılanmış farelerin ilk grup oldu. nt &quot;&gt; fareler gün # 24 # 28 öldürüldü, ve 37. sırasıyla UM-UC3 Luc, UM-uc1 Luc ve UM-UC13 Luc, aşılama sonra. Xenograftlarında tümörleri hematoksilen ve eosin üzerinde toplandı ve incelendi (H &amp; E ) bölümler. Tüm tümörler kas invaziv ve bazı perivezikal yağ içine sızmış, ama komşu organlara invazyonu [Şekil 6. I]. UM-UC13 luc tümörü taşıyan farelerin% 60 ve UM-UC3 Luc taşıyan farelerin% 20 gözlendi tümörler boyama [Şekil 6 II] H &amp; E tarafından teyit edildi retroperitoneal lenf nodu metastazı geliştirdi. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Şekil 1. Görüntü ve deney düzeneği şematik. Fare ısıtılmış ameliyat masasında (I) üzerine monte edilir ve &lt;(anestezi altında tutulanstrong&gt; II)% 3 izofluran / oksijen karışımı ile. Alt ekstremite, bir lastik bant (III) ile sabitlenir. Derinin (45-70 ° &#39;lik bir açı ile kafatası uzunlamasına hizalama) ultrason scanhead (IV) yaklaşan sonra, mesane (V) ultrason ekranında görüntülenmiştir. Bir 30 G iğne (VI) ile bir şırınga 30-45 ° &#39;lik bir açı (ultrason scanhead uzunlamasına eksenine göre 80-90 ° olarak) olarak cilde yönlendirilmektedir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Şekil 2. Mesane immobilizasyon. Ölçüler ve mesane sabitleme kayışı (I) oluşturmak için çizim kayış alt karın eklenmiş ve mesane (II) immobilize edilir. Böylece bir kaçırma<html> içi enjeksiyon sırasında mesane önlenir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Şekil 3,. Ultrason ekran (I) ile ilgili en mesane tümör hücrelerinin İçi aşılama. Görselleştirme. Deri ve karın duvarı kasları perforasyonu (II). Mukoza nüfuz olmayan mesane duvara iğne ekleme (III). Kas tabakası ve yavaş enjeksiyondan sonra mukoza arasındaki PBS (50 ul), (IV). Intramural yapay oluşturulan alana (V, VI) Matrigel&#39;de asılı tümör hücreleri. 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. . Ultrasonla takibi ultrason ile sürekli takip tümör hacminde önemli artış gösterdi (I: gün içerisinde 3. II: Gün # 7, III: gün # 13). <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Şekil 5,. Biyolüminesans ile takip biyolüminesans ile. Sürekli izlem çalışma süresi boyunca parlaklığından sürekli artış gösterdi. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Şekil 6,. Ksenogreft tümör ve lenf nodu metastazı Histoloji. Temsili xenograftlarının tu arasında toto H &amp; E bölümünde<html> mor komşu organlara (I) içine işgali olmadan kas içine invaziv büyüme göstererek. UM-UC13 luc tümörü taşıyan farelerin% 60 ve UM-UC3 luc tümörleri sunulan retroperitoneal lenf nodu metastazı (II) taşıyan farelerin% 20. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Aşılanmış hücre çizgisi </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC13 luc </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Farelerin sayısı </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Enjekte edilen hacim, uL </td>idth: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Hücre sayısı, mutlak </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5,5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Hayvan başına zaman, dak </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.4 (± 1.6) </td><td style="width:64px;"> 7.7 (± 3.7) </td><td style="width:64px;"> 6.8 (2.9 ±) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tümör insidansı </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (% 98) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> , 20 (% 100) </td><td style="width:64px;"> 14 (% 93) </td><td style="width:64px;"> 15 (% 100) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Lenf nodu metastazı </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (% 20) </td><td style="width:64px;"> 9 (% 60) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Takip (gün) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [tedaviden önce] </td><td style="width:64px;"> 28 [tedaviden önce] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tümör hacmi (uL) </td><td style="width:64px;"> 4 gün </td><td style="width:64px;"> 11.6 (± 1.3) </td><td style="width:64px;"> 12.5 (± 1.7) </td><td style="width:64px;"> 14.4 (± 1.3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowaçıklıklı = &quot;2&quot; style = &quot;height: 61px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> ucu </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (72,4 ±) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (66,1 ±) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78.3 (13.4 ±) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> takip </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Tümör lüminesans (fotonlar / sn) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 4 gün </td><td style="width:64px;"> 4.6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2.0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5,8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (9.4 x 10 7 ±) </td><td style="width:64px;"> (3.7 x 10 7 ±) </td><td style="width:64px;"> (1.3 x 10 ± 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;height: 67px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> ucu </td><td style="width:64px;"> 1.9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1.4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1.5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> takip </td><td style="width:64px;"> (4.0 x 10 9 ±) </td><td style="width:64px;"> (2.3 x 10 9 ±) </td><td style="width:64px;"> (1.9 x 10 9 ±) </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ultrason eşliğinde tümör hücresi enjeksiyonu - prosedürü ve sonuçları.

Birincil invaziv kadavradan mesane kanseri zenograftlarını aşılamak için kurulan teknik laparotomi ve mesane seferberlik gerektirir. Bu prosedür, fareler üzerinde önemli morbidite uğratan teknik açıdan zor ve zaman alıcıdır. Bu nedenle perkütan yaklaşım ultrason rehberlik kullanarak, yüksek hassasiyet geliştirdi.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Bu prosedürün genel amacı, ortotopik mesane kanseri ksenogreftlerini hızlı, hassas ve minimal invaziv bir yöntemle oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili tümör hücre hattının genişletilmesi ve tümör hücrelerinin Matrigel içinde süspansiyona getirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hayvan görüntüleme platformuna yerleştirilir ve mesane ultrason yardımıyla görüntülenir.Ardından, mesanedeki mukoza ve kas tabakaları salin enjeksiyonu ile birbirinden ayrılır. Son olarak, tümör hücresi matrigel süspansiyonu yapay olarak oluşturulan bu boşluğa enjekte edilir. Nihayetinde, ultrason görüntüleme ve biyolüminesans aracılığıyla tümör büyümesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, primer ksenogreftlerin inoklasyonu için laparotomi kullanımı gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı; bu yaklaşımın hızlı, kesin ve minimum düzeyde invaziv olmasıdır. Bu tekniklerin etkileri, oto ksenogreftlerin yeni tedavilerin preklinik çalışmaları için altın standart olması nedeniyle mesane kanserinin teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır. Enjeksiyon basamaklarının öğrenilmesi oldukça zor ve su yolu çok ince olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu prosedürün gösterilmesi faydalı olacaktır.Igor Mosca'nın bir araştırma asistanı ve Wolfgang Yeager'ın bir doktora sonrası araştırmacısı bulunmaktadır. Her ikisi de ürologdur. İlgili insan mesane kanseri hücre hatlarının kimliklerini doğruladıktan sonra, bu çalışma için hücre hatlarını transfect etmek amacıyla, xenograft tümörlerin biyolüminesans büyüme analizini yapmak üzere ateş böceği lusiferaz geni taşıyan bir lentiviral konstrükt kullanın.Prosedüre başlamaya hazır olduğunuzda, mevcut hücre hatlarını genişletmek için %10 FBS içeren DMEM çözündürün ve kullanın; 37 °C'de, nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde inkübe edin. Çözündürme sonrası enjeksiyon için hücre süspansiyonu hazırlamak amacıyla, matrigel ve buz üzerinde tutulan tripsin kullanarak %70 konfluense ulaşmış hücreleri normal büyüme ortamı ile süspande edin, ardından hücreleri sayın ve süspansiyonu 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hayvan başına 40 µL hacminde enjeksiyon yapmak için istenen hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde eşit hacimlerde uygun miktarda DMEM-FBS ve MATRIGEL ekleyin.İyi bir şekilde karıştırın ve herhangi bir düz, sert plastik malzeme kullanarak hava kabarcığı oluşmasını önleyin. Bir mesane stabilizatörü kesin, kayışı dikkatlice inceleyin ve farelere uygulamadan önce tüm keskin kenarları giderin. Dişi fareleri oksijen içinde %3 isoflurane ile anesteziye tabi ettikten ve ayak parmağı sıkıştırma testi uyguladıktan sonra.Yeterli sedasyon sağlamak için hayvanı, küçük hayvan görüntüleme platformunun ısıtmalı görüntüleme masasına yerleştirin ve yaşamsal bulgularını bir lastik bant yardımıyla sürekli olarak izleyin. Alt ekstremiteleri sabitleyin ve steril bir pamuklu çubukla cildi silmeden önce abdomeni dezenfekte etmek için %0,5 klorheksidin glukonat kullanın. Ardından, intramural enjeksiyon sırasında mesanenin kaymasını önlemek için mesane stabilizasyon kayışını kullanarak mesaneyi immobilize edin.Ardından, alt karın bölgesine steril ultrason jeli uygulayın. Ultrason tarama başlığını cilde yavaşça ilerletin ve mesaneyi ultrason ekranında görüntüleyin. Mesane boşsa, mesane duvar katmanlarını birbirinden ayırmak için transüretral 24 gauge anjiyo kateteri ile 50 µL ılık PBS kullanarak mesaneyi doldurun.PBS ile doldurulmuş ve 30 gauge üç çeyrek inçlik bir iğneye bağlanmış 1,0 mililitrelik bir şırıngayı şırınga klemine takarak başlayın. İğneyi pubik kemiğin hemen üzerindeki deri bölgesine doğru konumlandırın. 30 ila 45 derecelik bir açıyla, deriyi ve karın duvarı kaslarını yavaşça delmeden önce iğneyi ultrason ekranında tespit edin.Ardından, iğnenin eğimli ucunu posterior yöne bakacak şekilde 180 derece döndürün ve iğne ucunu mukozayı delmeden mesane duvarına yerleştirin. Daha sonra, yapay bir boşluk oluşturmak için iğneyi geri çekmeden önce kas tabakası ile mukoza arasına yavaşça 50 µL PBS enjekte edin. Mesane kanseri hücrelerini enjekte etmek için, kanser hücresi matrigel süspansiyonu ile doldurulmuş ikinci bir 1,0 mL şırıngayı ve 30 gauge üç çeyrek inçlik bir iğneyi şırınga klembine takın.İğnenin ucunu PBS ile doldurulmuş boşluğa yönlendirin. Yeni oluşturulan süspansiyondan 40 µL'yi boşluğa enjekte edin. Ardından, fareyi görüntüleme platformundan çıkardıktan sonra iğneyi geri çekin.Sürekli izleme altında, sıcak ve konforlu bir ortamda tutun. Bilinç ve normal yürüme yetisi geri kazandıktan sonra hayvanı tekrar kendi kafesine yerleştirin. Üç ardışık gün boyunca, 50 hayvana ultrason rehberliğinde üç farklı tümör hücre hattının intramural enjeksiyonu gerçekleştirilmiştir.İnokülasyon verimli bir şekilde gerçekleştirilmiş olup, herhangi bir intra- veya post-intervensiyonel komplikasyon ile ilişkilendirilmemiştir. Tümör büyümesinin izlenmesi, ultrason görüntüleme ve biyolüminesans ile yapılmıştır. Üçüncü günde, 50 hayvanın tamamının anterior mesanesinde ultrason ile tümör saptanabilmiş ve uc.Three inokülasyonunu takip eden izlem süresince farelerin %98'inde sürekli tümör büyümesi gözlemlenmiştir.Bir farede intraperitoneal tümör yayılımı gelişti ve ikinci bir hayvanda tümör yedinci günden sonra involüsyona uğradı. Bu, uc.Three ile inokülasyonun ardından bu yeni teknikle inoküle edilen ilk fare grubuydu. Luke uc, bir Luke ve uc.13 Luke. Fareler sırasıyla 24, 28 ve 37. günlerde sakrifiye edildi. Xenograft tümörleri toplandı ve h ve d kesitleri aracılığıyla incelendi.Tüm tümörler kas invaziv yapılıydı ve bazıları perivisseral yağa infiltre olmuştu, ancak komşu organlara invazyon gözlenmedi. uc'lerin %60'ı, 13 Luke ve uc'lerin %20'si. Üç Luke tümör taşıyan farede, H&amp;E boyama ile doğrulanmış retroperitoneal lenf nodu metastazları gelişti.Bu teknikle yeterlilik kazanıldığında, işlem üç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün gerçekleştirilebilmesi için ultrason görüntüleme konusunda deneyim sahibi olmak ön koşuldur. Tümörler bu şekilde inoküle edildikten sonra ultrason, yalnızca tümör büyümesinin zaman içindeki izlenmesine değil, aynı zamanda mikro kabarcıklar ile tümör perfüzyonunun incelenmesine de olanak tanır. Ayrıca bu yöntem, yeni deneysel ajanlarla intratümöral enjeksiyon yapılmasına da imkan sağlar.

minimally-invasive-establishment-murine-orthotopic-bladder

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fare mesane duvar enjeksiyon orthotopically mesane kök hücre ve kanser biyolojisi incelemek için yararlı bir yaklaşımdır. Bu hassas mikrocerrahi yöntemi dikkatli tekniği ve uygulamaları ile hakim olabilir.

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Kateterizasyon, yerel koterizasyon ve yanık sitelerine karsinom hücreleri sonraki yapışma ile minimal invaziv bir moda dişi farelerde mesane tümörleri kurulur.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

Ultrason ve bioluminescent görüntüleme ile intravezikal teslim Sarna ve izleme tümör büyümesinin antitümör etkileri değerlendirmek için ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmak.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

Bu video, ürotelyal hücreli karsinom ilerlemesini incelemek için kullanılabilecek deneysel bir ksenogreft murin modeli oluşturma prosedürünü açıklar.

Hasta Kaynaklı Tümör Ksenogreftleme: Ürotelyal Hücreli Karsinomun Değerlendirilmesi için Deneysel Fare Modeli Oluşturma Tekniği

Bu videoda, organ ortamının gelişmekte olan tümörler üzerindeki rolünü incelemek için kültürlenmiş mesane tümörü organoidlerinin murin mesanesine ortotopik transplantasyonunu açıklıyoruz.

Mesane Tümörü Organoid Modeli: Mesane Organoidlerinin Alıcı Murin Mesanesine Ortotopik Transplantasyonu İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kanser hücrelerini bir fare modelinin mesanesine iletmenin intravezikal prosedürünü açıklıyoruz. Bu prosedür, terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabilecek bir ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmaya yardımcı olur.

Ortotopik Mesane Tümörünün Fare Modelinde Modellenmesi: Kanser Hücrelerinin Murin Mesanesine İntravezikal Uygulanması İçin Bir Prosedür

Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murin mesane kanserinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin üç boyutlu in vitro kültürünü oluşturmak için ayrıntılı deneysel adımlar sağlar. Paslanma, genetik mühendislik ve tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonlarını içeren kültür yöntemleri tanımlanmıştır.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

Öğrenin, ultrason rehberliğiyle minimal invaziv mesane kanser ksenogratları oluşturmayı. Bu yöntem, hayrefahrefarelerde tümör büyümesini hızlı ve hassas bir şekilde izlemeyi sağlar.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Daha fazla video keşfet