C. elegans Kemotaksi Deneyi

Bir hücrenin veya organizmanın kimyasal bir uyarana yanıt olarak hareket etmesi, kemotaksi olarak adlandırılan bir davranıştır. Bu videoda, nematod C. elegans kullanılarak kemotaksi deneyi nasıl gerçekleştirilir öğreneceğiz. Ayrıca, C. elegans'ta yapılan kemotaksi deneylerinin öğrenme ve hafıza, olfaktorik adaptasyon ve Alzheimer hastalığının incelenmesinde nasıl uygulandığını tartışacağız.

Öncelikle iki farklı kemotaksi türünü ele alalım. Kimyasal bir uyarana doğru gerçekleşen harekete pozitif kemotaksi denir. Buna karşılık, organizmaların zararlı kimyasallardan uzaklaşmasını sağlayan, kimyasal bir uyaranın tersi yönündeki harekete ise negatif kemotaksi adı verilir.

Kemotaksi, organizmaların bir besin kaynağına doğru hareket etmesiyle organizma düzeyinde gerçekleşebilir. Kemotaksi aynı zamanda organizmaların içinde, hücresel düzeyde de meydana gelir. Örneğin, bağışıklık hücreleri patojenlere veya inflamasyon bölgelerine doğru göç eder. Bir başka örnekte, sperm hücreleri yumurta tarafından salgılanan bir kemo-atraktan uyarısıyla yumurtaya doğru hareket eder. Kemotaksi ayrıca, hücrelerin kimyasal bir uyarana yanıt olarak göç ederek gelişmekte olan organizmada doku ve organları oluşturduğu gelişim süreci boyunca da önemli bir işlemdir.

Doğada toprakta yaşayan C. elegans için kemotaksi, temel besin kaynakları olan bakterilerin tespiti ve onlara doğru hareket etmesi açısından önemlidir. Buna karşılık, C. elegans organizma için toksik olan ağır metaller, düşük pH'lı maddeler ve deterjanlar tarafından itilir.

Kemotaksi analizleri genellikle kemotaksi plakalarının hazırlanmasıyla başlar. Bir cetvel ve markör kullanarak, nematod büyüme besiyeri içeren 5 cm'lik bir plakayı dört eşit çeyreğe bölün. Ardından, çeyreğin merkezinin etrafına 0,5 cm yarıçapında bir daire çizin. Burası solucanlar için başlangıç noktası olacaktır. Her çeyrekte, her bir noktanın merkezden ve birbirinden eşit uzaklıkta olacağı şekilde bir noktayı işaretleyin ve etiketleyin.

Analiz için solucanlar hazırlanırken, kemotaksideki farklılıkların gelişim aşamasından kaynaklanan bir artefakt olmaması için yaşları senkronize edilmiş genç yetişkin solucanların kullanılması kritik öneme sahiptir. Solucanlar senkronize edildikten sonra, önce genç yetişkinlerin bulunduğu bir plakaya 2 ml S-basal tamponu pipetleyerek onları toplayın. Solucanları plakadan yıkamak için kabı dairesel hareketlerle sallayın ve eğin.

Ardından, solucan/S-basal çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Solucan/S-basal çözeltisini kısa süreli santrifüj ederek, süpernatantı uzaklaştırarak ve solucan peletine bir mililitre daha S-basal çözeltisi ekleyerek solucanları yıkayın. Tüpü ters çevirin ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Yıkamadan sonra, yaklaşık 100 μl dışındaki tüm S-basal çözeltisini uzaklaştırın. Sonra, bir NGM plakasına 2 μl solucan/S-basal karışımı ekleyin. Bir mikroskop kullanarak mevcut solucan sayısını sayın. İdeal olarak, 2 μl S-basal başına 50-250 arasında solucan bulunmalıdır.

Kemotaksi plakları ve solucanlar hazır olduğuna göre, kemotaksi analizine başlayabiliriz. İlk olarak, test çözeltinizden eşit hacimde, solucanlar hedeflerine ulaştığında onları felç edecek bir anestetik olan 0.5 M sodyum azid ile karıştırın. Aynı işlemi kontrol çözeltiniz için de yapın. Ardından, kemotaksi plakanızın merkezine 2 μl solucan/S-basal karışımı pipetleyin. Daha sonra, 2 μl test veya kontrol çözeltisini pipetleyerek kemotaksi plakasındaki uygun şekilde etiketlenmiş noktalara yerleştirin. Test ve kontrol çözeltileri emildikten sonra kapağı geri kapatın, plakayı ters çevirin ve 1 saatlik bir zamanlayıcı ayarlayın.

Solucanların plaka üzerindeki kimyasal uyarılara yanıt vermesi için bir saat beklendikten sonra veriler analiz edilebilir. Her bir kuadrant içindeki solucan sayısını manuel olarak sayın. Eğer solucanlar test kimyasalına ilgi duyuyorsa, bu kuadrantlarda daha fazla solucan bulunacaktır. Eğer kimyasala karşı nötrlerse, her kuadrantta eşit sayıda solucan bulunacaktır.

Kemotaktik indeksi hesaplamak için bu verileri kullanın; kemotaktik indeks, test kuadrantlarındaki solucan sayısından kontrol kuadrantındaki solucan sayısının çıkarılıp toplam solucan sayısına bölünmesiyle elde edilir. +1'e yakın bir kemotaktik indeks çekimi (atraksiyon), -1'e yakın bir kemotaktik indeks ise itimi (repülsiyon) gösterir.

Bir kemotaksi deneyi kurulumunun nasıl yapılacağını öğrendiğimize göre, bu deneylerin bilimsel soruları yanıtlamak için nasıl uygulandığına bir göz atalım.

C. elegans'deki kemotaksi deneylerinin uygulama alanlarından biri öğrenme ve belleğin incelenmesidir. Örneğin, solucanlar bir kimyasal uyaranı bir besin kaynağıyla ilişkilendirmeleri için koşullandırılabilir. İyi beslenmiş solucanlar bir saat boyunca aç bırakılır ve ardından besinle birlikte butanon gibi bir kimyasal ile koşullandırılır.

Ardından, solucanlar butanon içermeyen ancak besin bulunan bir plakada tutulur. Bir kemotaksi deneyi yürütmek, solucanların butanonu besinle ilişkilendirmeyi öğrenip öğrenmediklerini belirleyecektir. Öğrenme ve bellek için hangi genlerin veya nöronların önemli olduğu gibi diğer bilgileri belirlemek amacıyla bu deneyin birçok varyasyonu gerçekleştirilebilir.

Koku adaptasyonu, duyusal nöronların bir uyarana verdikleri yanıtın zamanla azalması ve böylece hayvanın diğer, muhtemelen daha önemli uyarana yanıt vermesine olanak tanımasıyla ortaya çıkan bir fenomendir. Örneğin, belirli bir süre boyunca bir kokuya maruz kalan yabani tip C. elegans, koku adaptasyonu nedeniyle bir kemotaksi deneyi sırasında o kokuya yönelmek yerine onu görmezden gelecektir. Bu nedenle, egl-4 gibi koku adaptasyonunun genetik düzenleyicilerini ortaya çıkarmak için yüksek kapasiteli genetik taramalar gerçekleştirilebilir. Ayrıca, floresan işaretli proteinler eksprese eden transgenik solucanlar, koku adaptasyonu sırasında lokalizasyon değişiklikleri açısından gözlemlenebilir.

Son olarak, kemotaksi deneyleri C. elegans'de Alzheimer hastalığını incelemek için kullanılabilir. Bilim insanları, Alzheimer hastalığının belirgin bir özelliği olan floresan işaretli insan amiloid beta peptidini C. elegans nöronlarında eksprese edebilirler. İlginç bir şekilde, kemotaksi deneyleri, bir nöron popülasyonunda amiloid beta eksprese eden solucanların, kontrole kıyasla bir kemo-çekiciye karşı azalmış kemotaksi gösterdiklerini ortaya koymuştur. Amiloid betanın diğer nöron popülasyonlarında veya dokularda eksprese edilmesi veya herhangi bir bileşiğin amiloid beta ekspresyonunun etkilerini hafifletip hafifletemediğinin belirlenmesi dahil olmak üzere bu deneyin birçok varyasyonu gerçekleştirilebilir ve bu çalışmalar nihayetinde potansiyel bir tedaviye yol açabilir.

JoVE'nin C. elegans'ta kemotaksiye giriş videosunu izlediniz. İlk olarak, kemotaksisin ne olduğunu ve organizmalar ile hücreler için doğada neden önemli olduğunu tanımladık. Ardından, C. elegans ile bir kemotaksi deneyi nasıl gerçekleştirilir gösterdik. Son olarak, kemotaksinin öğrenme ve hafıza, koku adaptasyonu ve Alzheimer hastalığını anlamak için nasıl uygulanabileceğini tartıştık. İzlediğiniz için teşekkürler!