Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde klamidya inklüzyon büyüme dinamiklerini görselleştirmek ve nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle sitoplazmalarında GFP gibi floresan bir proteini stabil olarak eksprese eden floresan konak hücreler oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından, konak hücreler klamidya ile enfekte edilir ve inkübasyona bırakılır.

Ardından enfekte hücreler canlı floresan mikroskobu ile görüntülenir. Son olarak, klamidya inklüzyon özellikleri mikroskop analiz yazılımı aracılığıyla nicelleştirilir; nihayetinde konak hücre içindeki klamidyal inklüzyonları görselleştirmek ve nicel sonuçlar elde etmek için inklüzyonların biyolojik parametrelerini ölçmek amacıyla canlı floresan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin, antikor temelli sayım gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, bu ters görüntüleme stratejisinin canlı hücreler üzerinde kullanılabilmesi ve ayrıca tüm klamidya türlerinin inklüzyon dinamiklerini nicelleştirmek için diğer floresan etiketlerle birlikte uygulanabilmesidir.

Ayrıca, bakterileri hücre içinde işaretleyen rutin yöntemlerin aksine, bu yaklaşım canlı hücrelerde inklüzyon membranını aydınlatır ve böylece bu patojen içeren kompartımanın önemli dinamik özelliklerini ortaya çıkarabilir. Metin protokolü plakasına göre floresan HeLa hücreleri oluşturulduktan sonra; yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı kaplar veya IFU tayini ve çok kuyucuklu tarama için 4'lü veya 24'lü kuyucuklu plakalar gibi istenen bir kültür kabına GFP HeLa hücrelerini ekin, Crich Cotus veya istenen herhangi bir diğer klamidyal suş içeren dondurulmuş bir tüpü buz üzerinde çözdürün ve istenen enfeksiyon çokluğu değerine ulaşana kadar HBSS ile seyreltin. Crich Cotus, LGV zero VL two ile statik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, kuyucuklardaki medyumu aspire edin ve GFP HeLa hücrelerini yıkamak için HBSS kullanın.

Seyreltilmiş bakterileri kuyucuklara ekleyin ve 25 °C'de iki saat boyunca inkübe edin, ardından hücreleri aspire edin ve HBSS ile yıkayın. Daha sonra büyüme medyumu ekledikten sonra, crich serovar D veya herhangi bir diğer klamidya suşu ile santrifüj destekli enfeksiyon gerçekleştirmek için hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. GFP hela hücrelerini yıkamak için HBSS kullanın ve hücrelere seyreltilmiş bakterileri ekleyin.

Ardından, enfekte hücrelerin bulunduğu kabı, bir masaüstü santrifüjdeki salınımlı kova rotorunun çok kuyucuklu plaka tutucusuna yerleştirin. Hücreleri 900 ×g ve 25 °C'de bir saat boyunca santrifüjleyin. Daha sonra kültür kaplarını bir biyogüvenlik kabini içerisinde 37 °C karbon dioksit inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin, hücreleri aspire edin, HBSS ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamı ekleyin.

Enfekte hücrelerin bulunduğu kabı 37 °C'de inkübe edin. Klamidya inklüzyonlarını görüntülemek için, klamidya ile enfekte edilmiş GFP hela hücrelerini karbondioksit inkübatöründen çıkarın ve besi yerini değiştirmek için fenol kırmızısı içermeyen RPMI ve %5 FBS kullanın. Kabı veya çok kuyucuklu plakayı, 20x veya daha yüksek büyütmeli yağlı objektifli bir ters floresan mikroskobuna yerleştirin. Görüntüleme yazılımını kullanarak, büyük siyah boşluklar içeren yeşil hücreler şeklinde görünen klamidya ile enfekte GFP hela hücrelerini tanımlayın.

Kazanım kurulum iletişim kutusunda, yazılımı yeşil kanalı ve örneğe eklenen diğer tüm kanalları kazanacak şekilde yapılandırın. Görüntüyü istenen zamanlarda elde etmek için yakalama/kaydetme düğmesini kullanın. Enfeksiyon sonrası: Klamidya ile enfekte edilmiş GFP HeLa hücrelerini inkübatörden çıkarın ve kabı bir ters floresan mikroskobuna yerleştirin.

İnklüzyonların maksimum çapta ve verimde olduğu hücrelerin orta düzlemlerine odaklanın. Kuyuk başına en az 10 alanda net kenarlı görüntüler elde edin. Kuyuklar tipik olarak tekrarları veya deneysel değişkenleri temsil eder.

Ölçümler sekmesi altında GFP HeLa hücrelerini bulmak için "nesneleri bul" (find objects) komutunu kullanın ve yeşil kanalı seçin. Eşik yoğunluğunu, hücrelerin göreceli yoğunluklarına göre ayarlayın. İnklüzyonların veya siyah kompartmanların ve GFP HeLa hücrelerinin sayısını gözle manuel olarak sayın veya inklüzyonları otomatik olarak tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmalarını kullanın.

Yalnızca beş kare mikrometreden büyük olanları tutarak seçili nesneleri filtreleyin. Bunu popülasyon bir olarak adlandırın. Bu popülasyonu kullanarak, nesnelerdeki boşlukları doldur komutunu uygulayın; bu adım popülasyon ikiyi oluşturur.

Pozitif işaretli klamidya inklüzyonlarını tanımlayan popülasyon üçü elde etmek için, popülasyon birini popülasyon ikisinden çıkarın. Popülasyon üçe boyut filtresi uygulamak için filtre popülasyon komutunu kullanın. Örneğin, 24 saat veya daha uzun süre enfekte olmuş hücrelerdeki inklüzyonlar için 25 square micrometers'tan büyük nesneleri tutun; erken enfeksiyon süreleri için ise boyut filtresini 4 square micrometers'tan büyük nesneleri tutacak şekilde ayarlayın.

Bu inklüzyonlar çok daha küçük olduğundan, boyut filtresi inklüzyonlar olarak tanımlanan bir nesne popülasyonu ile sonuçlanır. İnklüzyon sayısı, inklüzyon boyutu ve inklüzyon çevresi gibi kantitatif verileri görüntülerden hesaplamak için görüntüleme yazılımını kullanın. Klamidya enfeksiyonu sonrası inklüzyonlar, siyah noktalar ve konak hücreler veya konak hücreler içindeki floresan protein eksprese eden klamidyalar olarak kolayca görülebilir; bu netlik, çok sayıda görüş alanı ve/veya tedavi boyunca otomatik tanımlama için kullanılabilir.

Bu grafikte gösterildiği üzere, temel bir uygulama alanı, hem zaman alan hem de maliyetli olan immunofloresan prosedürlere olan ihtiyacı ortadan kaldıran, canlı enfekte hücrelerdeki klamidya inklüzyon oluşturma birimlerinin belirlenmesidir. Bu görüntüleme yaklaşımının bir diğer önemli özelliği, herhangi bir klamidya türüne veya suşuna kolaylıkla uygulanabilmesidir. Bu örnekte, dört klamidya türü veya suşundan biriyle enfekte edilmiş GFP hela hücrelerinin zaman seyri analizi, bu türlerin ve suşların her biri için gerçekleştirilmiştir.

Belirtilen zamanlarda inklüzyonlar işaretlendi ve ortalama alanları, çevre uzunlukları ve hücre başına düşen sayıları hesaplanmak üzere analiz edildi. Bu özellikler, konak hücre ile nasıl etkileşime girdikleri de dahil olmak üzere, klamidya inklüzyonlarının biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada, enfeksiyondan 48 saat sonra başlayarak 125 dakika boyunca beşer dakikalık aralıklarla alınan zaman ayarlı görüntülerden oluşturulmuş, GFPC, Tracom L ile enfekte edilmiş m cherry hela hücrelerinin bir videosu gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, bu ters görüntüleme tekniğinin yalnızca Chlamydial inklüzyonlarını görselleştirmek için değil, aynı zamanda inklüzyon alanı çevresi ve hücre başına inklüzyon sayısı gibi inklüzyon dinamiklerini nicelendirmek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, daha geleneksel görselleştirme tekniklerine kıyasla maliyet etkindir ve tüm klamidya türleri ve suşları ile çalışır.