Name: Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak Chlamydia Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Keşfedin, canlı hücrelerde floresan proteinler kullanarak Chlamydia kapsül büyüme dinamiklerini görselleştirme ve miktarlandırma yöntemini. Bu teknik, tüm Chlamydia türleri için enfeksiyon biyolojisini gerçek zamanlı analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, sırasıyla pGFP-SW2 ve pASK-GFP-mKate2-L2 plazmitleri için Ian Clarke ve P. Scott Hefty'ye teşekkür eder. Teknik yardım için Paul Miller'a ve diğer kaynaklar için Richard Stephens'a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe AI095603 (KH) tarafından finanse edilmiştir.

Floresan ana hücre dizilerinin 1. Üretim <ol><li> / Oyuk 2 x 10 6 hücre, 6-yuvalı plakalar üzerinde gün 1. Plaka 293T hücreleri (ya da daha başka retroviral paketleme çizgisi) ~% 75 konfluent ertesi gün için. Eğer arzu edilirse, her bir retrovirüs için tabak çift kuyu kullanılır. </li><li> 2. Gün aspire hücreleri ve 2 ml ilave taze büyüme ortamı (DMEM +% 10 FBS + 2 mM L-glutamin). Lipofectamine 2000 veya benzeri bir reaktif kullanılarak ve imalatçının talimatları takip 5-8 ug retroviral vektör (GFP ihtiva eden) ve paketleme vektörünün her biri için (örn., PVSVg) ile hücrelerin transfekte. </li><li> 1 ml büyüme ortamı ile orta yerine, daha sonra 37 ° C CO2 inkübatöründe 4-6 st için DNA ile inkübe hücreleri, vb. </li><li> 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat süreyle inkübe hücreleri. </li><li> 3. Gün Plaka hedef hücreler (örn., HeLa) 10 5 hücre yaklaşık yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar üzerine / kuyu olmak ~% 50 konfluentertesi gün. Ters bir mikroskop GFP floresan izleyerek 293T hücrelerinde pozitif transfeksiyon doğrulayın. </li><li> 4. Gün Collect retrovirüs-ihtiva eden bir 0.45 mikron selüloz asetat şırınga filtre ile süpernatan bir pipet kullanılarak ve filtre 293T hücrelerinde rahatsız süpernatantlar. </li><li> HeLa hücreleri Ortamı çıkarın ve 16 ug / ml ihtiva eden 0.5 ml polybrene büyüme ortamı ilave edin. Hücrelere süzüldü retrovirüs ~ 0.5 ml ilave akıllı-damla ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri. 4 ° C &#39;de (de yinelenen, örn) kalan herhangi bir retrovirüs saklayın. </li><li> Yinelenen kuyuları seri kalan retroviral parçacıklar ile enfekte için ekstra retrovirüs adımı yineleyin 1.7 üretmek için yapılmış ise Günü 5.. </li><li> (Örneğin, 500 ug / ml neomisin) 10 cm&#39;lik bir çanak içeren seçim antibiyotik olarak 1: Gündüz 6. Geçiş HeLa hücreleri 1 transfekte edildi. </li><li> Seçim Antibiyotik varlığında tekrar büyümeye kalıt aktarımlı hücrelerin için yeterli bir süre bekleyinHücreler ayıklama antibiyotiğin daha düşük bir konsantrasyonu ile standart teknikler tarafından yayılan olabilir sonra tlc, (örn., 200 ug / ml neomisin). Not: Gerekirse Hücreler de klonal, şu anda ideal bir parlaklık için seçilmiş olabilir. </li></ol> GFP-ifade Chlamydia trachomatis &#39;in 2. Üretim <ol><li> 2x CaCl2 tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM CaCl2) ile 4SP tamponu (0.4 M sukroz, 16 mM Na 2 HPO 4) hazırlayın. </li><li> Gün 1. çözülme dondurulmuş C. trachomatis stok buz üzerinde ve hemen 50 ul 2x CaCl2 tampon içine 10 ul bakteri sulandırmak. 3 ug plazmid DNA ekleyin (örn.,, PASK-GFP-mKate2-L2), iyice karıştırın ve 25 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Bu adım sırasında, bir santrifüj tüpüne McCoy hücreleri, T-75 balon trypsinizing konakçı hücrelerin hazırlanması. 5 dakika boyunca 50 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj ve supernatant atın. Resuspen1x CaCI2 tampon uygun hacimde d hücre topağı 4 x 10 7 hücre / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. </li><li> (Adım 2.2) 30 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, transformasyon karışımı borusu (toplam hacim 200 ul) ile McCoy hücreleri hazırlandı 100 ul ve 25 ° C&#39;de ek bir 20 dakika inkübe edilir. 2 ml büyüme ortamı ile bir 6-yuvalı plaka ve kaplama tek bir kuyusuna bu dönüştürülmüş hücre karışımı 100 ul ekle. 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3. Gün Lyse McCoy hücreleri C ile enfekte bükülmüş 1000 ul pipet ucu ile hücreleri, 1 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıyarak trachomatis. C. verimli hücre erimesi ve serbest bırakılması için 5 kez 1 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile süspansiyon geçmektedir trachomatis. </li><li> C ihtiva eden hücre lizatı devri 2 mi Taze kaplama MM konfluent tek tabaka ihtiva eden bir T-75 balonuna trachomatisoy hücreleri; (FBS&#39;siz) 8 ml DMEM ekleyebilir ve C izin vermek için 25 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe trachomatis hücrelerine yapışma. </li><li> Aspire hücreler 10 U / ml penisilin G ve 1 ug / ml siklohegzimid ile desteklenmiş taze büyüme ortamı eklemek. 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat boyunca balon inkübe edin. </li><li> 4. Gün hücreleri enfekte ve inklüzyonlar anormal Klamidya ihtiva ışık mikroskobu ile doğrulayın. 2&#39;den büyük mikron çapında olan kapanım içinde halka benzeri nesneler gibi standart ışık mikroskobu üzerinde parlak vakuol ve anormal Chlamydia organları olarak kapanımlar tanımlayın. </li><li> Bir süspansiyon içine hücreleri 2 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıma tarafından Gün 5. lizleyin kültürü. 2 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile 5 kez süspansiyon geçmektedir. </li><li> Bir 6-çukurlu plaka içindeki tek bir kuyuda McCoy hücreleri taze tek tabaka enfekte hücre lizatı 2 ml kullanın. 25 ° C, aspirat 2 saat süreyle lisatı ile inkübe hücreleri ve taze büyüme eklemePenisilin G ve sikloheksimid içeren ortam. </li><li> Hücrelerin genel sağlığına bağlı olarak 3-5 gün boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> Tekrarlama (anormal cisimlerin yoksun) Normal görünümlü inklüzyonlar ortaya çıkmıştır kadar 6 plaka taze kuyulara 2,9-2,10 bir veya birkaç kez, gerektiğinde, Pasajlanması kültürleri yineleyin. Şu anda kontrol etmek ters bir floresan mikroskop kullanmak C. trachomatis mKate2 (kırmızı) ifade eder. </li><li> T-150 şişelerinde yetişen enfekte McCoy veya HeLa hücrelerinden Chlamydia transformantların hasat örneğin yüksek titre klamidyal stoklarının oluşturulması için enfekte kültürler, büyütmek. </li></ol> 3. Chlamydia ile Hücreler bulaşmasını <ol><li> IFU tespit edilmesi ve çok-yuvalı tarama için, örneğin cam alt yemekler ya da oda slaytlar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, ya da 24 oyuklu plakalar için istenen kültür kabı Plaka GFP-HeLa hücreleri,. </li><li> Fro ÇözülmeC içeren zen tüp trachomatis, C. muridarum veya C örnek İçişleri Bakanlığı 1 = buz üzerinde pneumoniae ve enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) için HBSS sulandırmak. </li><li> Kullanılacak belirli Chlamydia zorlanma dayalı statik veya santrifüj destekli ya enfeksiyonları gerçekleştirin. <ol><li> C ile enfeksiyonlarında trachomatis LGV serovar L2 veya C muridarum, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkayın ve 25 ° C&#39;de 2 saat süre ile seyreltilmiş bakteri ile inkübe edin. Aspire edin ve HBSS ile yıkama hücreleri ve 37 ° C CO2 inkübatör büyüme ortamında hücrelerin inkübe edin. </li><li> C. trachomatis serovar D veya C ile enfeksiyonlarında pneumoniae, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkamak ve hücrelerin seyreltilmiş bakteri ekleyin. Bir tezgah üstü santrifüj içinde sallanan bir kova rotor eki bir multiwell plaka tutucu multiwell plaka ya da (bir multiwell plaka kapağında bant ile güvence altına) cam alt çanak yerleştirin. </li><li> 1 saat boyunca 25 ° C&#39;de 900 x g&#39;de santrifüj hücreleri. </li&gt; <li> 1 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatör santrifüj ve yerine kültür damarları çıkarın. </li><li> Aspire hücreleri biyogüvenlik kabini, HBSS ile iki kez hücreleri yıkayın ve taze besi ekleyin. 37 ° C CO2 inkübatör yerleştirin hücreleri. </li></ol></li></ol> Chlamydia İçermelerin 4. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> CO 2 inkübatör Chlamydia bulaşmış GFP-HeLa hücreleri çıkarın ve fenol + 5 kırmızı% FBS&#39;siz RPMI ile orta yerine. </li><li> 20X ya da daha yüksek yağ objektif kullanarak bir ters flüoresan mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E veya benzeri) üzerine monte hücreleri. </li><li> Büyük kara delikler (Klamidya kapanımlar) içeren yeşil hücreler: görüntüleme yazılımı (Volocity 6 veya benzeri) kullanarak, odaklanmak ve tespit Chlamydia GFP-HeLa hücreleri enfekte. </li><li> Mark görüntüleme yazılımı kullanarak ilgi Chlamydia ile enfekte olan hücreleri içeren bölgelerin xyz yerleri (Volocity 6 veya benzeri). El XY Sahne görünüm modunda süre &#39;Puanları ekleyerek&#39; Bu gerçekleştirin. Bu şekilde, xyz koordinatlar her işaretli yeri için kaydedilir. </li><li> Toplama Kurulumu iletişim kutusunda, yeşil (GFP, HeLa sitosol) ve kırmızı (mKate2, C. trachomatis) kanalları ve kanal başına yeni çerçeveler her 5 dk hızında elde etmek yazılımı yapılandırın. </li><li> Protokol &quot;Yakalama / Kaydet&quot; butonuna tıklayarak, yukarıda girilen edinimi kullanarak görüntü dizisi edinin. </li></ol> Canlı hücreler Eklenmesi Büyüme Parametrelerinin 5. kantitasyonu <ol><li> İstenilen zamanlarda enfeksiyon sonrası (örn., 24, 48 hpi) Chlamydia inkübatör GFP-HeLa hücreleri enfekte kaldırmak ve ters floresan mikroskop monte. Not: Bir yüksek NA ile 20X veya 40X hava hedefi 24-kuyucuğu için en uygun olduğunu ve 40X petrol hedefi haznesi slaytlar için tavsiye edilir. Bu eşek için her iki alt tabaka üzerinde hücreleri büyümekay. </li><li> Inklüzyonlar maksimum çapı altındadır hücrelerin Midplanes odaklanın ve net kenarları verim. </li><li> Her bir oyuğa (oyuk başına en az 10) birçok alanları için görüntüler elde; kuyular genellikle çoğaltır veya deneysel değişkenleri temsil etmektedir. </li><li> Gözle (kapanım GFP-HeLa hücrelerinde siyah bölmeleri olan), elle kapanım sayısını numaralandırmak veya otomatik olarak kapanımlar tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmaları kullanır. <ol><li> Floresan yoğunluğu ile GFP-HeLa hücreleri bul (komutunu &#39;Nesneler Bul&#39;) ve hücrelerin göreceli yoğunlukları dayalı floresan eşik yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Bu sadece 5&#39;inden um 2 tutmanın büyüklüğü yönergeleri kullanarak Filtre, seçilen nesneler. Bu &#39;nüfus 1 &quot;dir. </li><li> Girdi olarak &#39;nüfusu 1&#39; kullanarak komuta &#39;Nesneler Holes doldurun&#39; uygulayın. Bu adım &#39;nüfusu 2&#39; oluşturur. </li><li> &#39;S çıkarınız&#39; nüfus 1 &#39;opulation 2 &#39;nüfusu 3&#39; olumlu olarak belirlenmiş Chlamydia kapanım, işaretli ürün olarak vermek üzere &#39;. </li><li> Örnek tutmak nesneler için, &#39;nüfus 3&#39; (&#39;Filtre Nüfus&#39; komutu) boyut filtre uygulamak 24 saat veya daha uzun süre enfekte hücrelerde kapanım için daha büyük 25 mikron 2. Bu kapanımlar çok daha küçük gibi önce 18 saat gibi erken enfeksiyon süreleri için, set boyut filtresi, 4 mikron 2&#39;den büyük nesneleri tutmak için. &#39;Kapanım&#39; olarak adlandırılan nesnelere nüfusu Boyut filtreleme sonuçları. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak, kantitatif örneğin görüntü veri, içerme numarası, inklüzyon boyutunu ve içerme çevresi hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Burada gerçek zamanlı görselleştirme ve Chlamydia kapanım analizi için floresan konakçı hücreleri üretmek için deneysel bir strateji açıklar. Bu vakuol görselleştirme yaklaşımı zamanla tek hücre hücre popülasyonlarında karşısında ya da klamidya kapanım dinamik özellikleri, aydınlatmak izlemek ve kantitatif ölçmek için güçlü yeteneği kazandırır. Klamidya kapanımlar floresan proteini etiketli hücrelerde çarpıcı iyi kolayca tespit edilir, öyle ki tanımlanır Ek immunofluorescent işleme gerek kalmadan. Ayrı...

Hücre içi bakteri Chlamydia türlerinin neden Bulaşıcı hastalıklar cinsel yolla bulaşan hastalık, pelvik inflamatuar hastalık, körlük, zatürre ve muhtemelen ateroskleroz 1-4 dahil olmak üzere küresel sağlığı üzerinde önemli bir yük, ortaya. Bir vakuol içinden, konakçı hücre ile etkileşime Chlamydia kabiliyeti (dahil olarak adlandırılır), hücre ve ev sahibi başarılı enfeksiyonu için kritik bir belirleyicidir. Içerme chlamydia büyümesini sağlayan ve dinamik Chlamydia 5 tüm 2-3 gün gelişimsel döngüsü boyunca değiştirilmiş yeni bir patojen bölme olduğunu. Klamidyalar ve zorunlu hücre içi doğası doğrudan dahil eşsiz biyoloji eğitimi için özellikle araştırma topluluğuna sayısız zorluklarla, sunar. Büyük bir handikap verimli hücre içi Klamidya veya floresan yaklaşımla kendi eklenmesi ya görselleştirmek için yetersizlik olmuşturcanlı hücrelerde es. Bir son keşif sonunda GFP C ifade oluşturmak için bir araç ortaya çıkarmıştır trachomatis 6; Ancak bu bulgu henüz dahil belirli etiketlenmesine yol açmamıştır. Bazı teknikler bakteri ve inklüzyonlar 7,8 etiketlenmesi için tarif edilmiştir, fakat bu ışıkla ağartma olmayan spesifite, geçicilik ve duyarlılık gibi bazı eksikleri vardır. Grubumuz tarafından anahtar keşif konakçı hücreleri 9 ifade GFP kullanarak içermenin aydınlatılması için yeni bir strateji kurdu. Bu strateji, rasyonel daha büyük 520 Da 10 molekülüne dahil membran iç sızdırmazlık patlatır. Hücreler stabil belirli bir sitozolik floresan proteini (örneğin, GFP veya mCherry) ifade etmek için tasarlanmıştır zaman Chlamydia inklüzyonlar floresan onların tam dışlama yoluyla kayda değer bir açıklıkla görebilir. Bu ters görüntüleme stratejisi, tüm Chl için kapanım derhal görselleştirme sağlaramydia türleri ve havaalanı en konakçı hücreler için adapte edilebilir. Kendi programını bir göstergesi olarak, bu yöntem Chlamydia spp 9 hücresel çıkış yollarını ortaya çıkarmak ve tanımlamak için önceden kullanıldı. Burada, biz daha fazla bu yöntem gerçekleştirilir ve içerme büyüme dinamikleri hakkında önemli nicel veriler elde etmek için istismar edilebilir gösterilmektedir. Bundan başka, etkili bir şekilde pahalı antikor bazlı sayım yöntemleri yerine kullanılabilir ve bu tür Chlamydia 11 mKate2 ifade eden diğer floresan etiketler, ile birlikte de kullanılabilir. Araçlar Bu güçlü kombinasyon yaşayan konak hücrelerin içinde klamidya içerme zarının fiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & mikro; m filtreler</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Canlandırıcı</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Canlandırıcı</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Canlandırıcı</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Canlandırıcı</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 fenolsüz kırmızı</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Oda kaydırakları, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; chlamydia</em&gt; vakuol büyüme dinamikleri yaşayan hücrelerde

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia, küresel halk sağlığı üzerinde büyük bir yük oluşturmaktadır. C. trachomatis, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonun önde gelen bakteriyel nedenidir ve aynı zamanda dünyadaki önlenebilir körlüğün birincil nedenidir. Konakçı hücrelerin Chlamydia tarafından başarılı bir şekilde enfekte edilmesi için önemli bir belirleyici, bakterinin konak hücre sinyalini inklüzyon adı verilen yeni, vakuolar bir bölmeden manipüle etme yeteneğidir. Dahil etme içinden, Chlamydia 2-3 günlük gelişimsel büyümeleri için gerekli besinleri alır ve ayrıca vakuol zarının sitozolik yüzüne ve konakçı sitozole bir efektör protein paneli salgılar. Bununla birlikte, Chlamydia biyolojisi anlayışımızdaki boşluklar, bu hücre içi bölmeyi görselleştirmek ve analiz etmek için önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Son zamanlarda, GFP eksprese eden konakçı hücreleri kullanarak inklüzyonu görselleştirmek için bir ters görüntüleme stratejisi tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, inklüzyon membranının GFP gibi büyük moleküllere karşı içsel geçirimsizliğini rasyonel olarak kullanır. Bu çalışmada, klamidyal inklüzyonların daha sonra görselleştirilmesi için GFP veya mCherry eksprese eden konakçı hücrelerin nasıl üretildiğini açıklıyoruz. Ayrıca, bu yöntemin maliyetli antikor bazlı sayım yöntemlerinin etkili bir şekilde yerini aldığı, GFP eksprese eden Chlamydia gibi diğer floresan etiketlerle birlikte kullanılabileceği ve bir dizi Chlamydia türü ve suşundan inklüzyon membranı büyümesi hakkında temel nicel veriler elde etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir.

Sitosolik floresan proteinleri (örneğin GFP) ifade eden memeli hücrelerinin, canlı, enfeksiyonlu hücre kültürlerinde Chlamydia inklüzyonlar aydınlatma sağlamak için tasarlanabilir. Chlamydia enfeksiyonu üzerine, inklüzyonlar konakçı hücrelerde (Şekil 1) siyah noktalar olarak kolaylıkla görebilir. Floresan eksik kapanım netliği görünümü ve / veya tedaviler (Şekil 1) çok sayıda alanları arasında kapanım otomatik tanımlanması için istismar edilebilir. Floresan ko...

Chlamydia içeren hücresel vakuolleri (inklüzyonlar) aydınlatmak için canlı hücre floresan proteini bazlı bir yöntem tanımlanmıştır. Bu strateji, numunelerde Chlamydia enfektivitesinin hızlı ve otomatik olarak belirlenmesini sağlar ve inklüzyon büyüme dinamiklerini kantitatif olarak araştırmak için kullanılabilir.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde klamidya inklüzyon büyüme dinamiklerini görselleştirmek ve nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle sitoplazmalarında GFP gibi floresan bir proteini stabil olarak eksprese eden floresan konak hücreler oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından, konak hücreler klamidya ile enfekte edilir ve inkübasyona bırakılır.Ardından enfekte hücreler canlı floresan mikroskobu ile görüntülenir. Son olarak, klamidya inklüzyon özellikleri mikroskop analiz yazılımı aracılığıyla nicelleştirilir; nihayetinde konak hücre içindeki klamidyal inklüzyonları görselleştirmek ve nicel sonuçlar elde etmek için inklüzyonların biyolojik parametrelerini ölçmek amacıyla canlı floresan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin, antikor temelli sayım gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, bu ters görüntüleme stratejisinin canlı hücreler üzerinde kullanılabilmesi ve ayrıca tüm klamidya türlerinin inklüzyon dinamiklerini nicelleştirmek için diğer floresan etiketlerle birlikte uygulanabilmesidir.Ayrıca, bakterileri hücre içinde işaretleyen rutin yöntemlerin aksine, bu yaklaşım canlı hücrelerde inklüzyon membranını aydınlatır ve böylece bu patojen içeren kompartımanın önemli dinamik özelliklerini ortaya çıkarabilir. Metin protokolü plakasına göre floresan HeLa hücreleri oluşturulduktan sonra; yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı kaplar veya IFU tayini ve çok kuyucuklu tarama için 4'lü veya 24'lü kuyucuklu plakalar gibi istenen bir kültür kabına GFP HeLa hücrelerini ekin, Crich Cotus veya istenen herhangi bir diğer klamidyal suş içeren dondurulmuş bir tüpü buz üzerinde çözdürün ve istenen enfeksiyon çokluğu değerine ulaşana kadar HBSS ile seyreltin. Crich Cotus, LGV zero VL two ile statik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, kuyucuklardaki medyumu aspire edin ve GFP HeLa hücrelerini yıkamak için HBSS kullanın.Seyreltilmiş bakterileri kuyucuklara ekleyin ve 25 °C'de iki saat boyunca inkübe edin, ardından hücreleri aspire edin ve HBSS ile yıkayın. Daha sonra büyüme medyumu ekledikten sonra, crich serovar D veya herhangi bir diğer klamidya suşu ile santrifüj destekli enfeksiyon gerçekleştirmek için hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. GFP hela hücrelerini yıkamak için HBSS kullanın ve hücrelere seyreltilmiş bakterileri ekleyin.Ardından, enfekte hücrelerin bulunduğu kabı, bir masaüstü santrifüjdeki salınımlı kova rotorunun çok kuyucuklu plaka tutucusuna yerleştirin. Hücreleri 900 ×g ve 25 °C'de bir saat boyunca santrifüjleyin. Daha sonra kültür kaplarını bir biyogüvenlik kabini içerisinde 37 °C karbon dioksit inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin, hücreleri aspire edin, HBSS ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamı ekleyin.Enfekte hücrelerin bulunduğu kabı 37 °C'de inkübe edin. Klamidya inklüzyonlarını görüntülemek için, klamidya ile enfekte edilmiş GFP hela hücrelerini karbondioksit inkübatöründen çıkarın ve besi yerini değiştirmek için fenol kırmızısı içermeyen RPMI ve %5 FBS kullanın. Kabı veya çok kuyucuklu plakayı, 20x veya daha yüksek büyütmeli yağlı objektifli bir ters floresan mikroskobuna yerleştirin. Görüntüleme yazılımını kullanarak, büyük siyah boşluklar içeren yeşil hücreler şeklinde görünen klamidya ile enfekte GFP hela hücrelerini tanımlayın.Kazanım kurulum iletişim kutusunda, yazılımı yeşil kanalı ve örneğe eklenen diğer tüm kanalları kazanacak şekilde yapılandırın. Görüntüyü istenen zamanlarda elde etmek için yakalama/kaydetme düğmesini kullanın. Enfeksiyon sonrası: Klamidya ile enfekte edilmiş GFP HeLa hücrelerini inkübatörden çıkarın ve kabı bir ters floresan mikroskobuna yerleştirin.İnklüzyonların maksimum çapta ve verimde olduğu hücrelerin orta düzlemlerine odaklanın. Kuyuk başına en az 10 alanda net kenarlı görüntüler elde edin. Kuyuklar tipik olarak tekrarları veya deneysel değişkenleri temsil eder.Ölçümler sekmesi altında GFP HeLa hücrelerini bulmak için "nesneleri bul" (find objects) komutunu kullanın ve yeşil kanalı seçin. Eşik yoğunluğunu, hücrelerin göreceli yoğunluklarına göre ayarlayın. İnklüzyonların veya siyah kompartmanların ve GFP HeLa hücrelerinin sayısını gözle manuel olarak sayın veya inklüzyonları otomatik olarak tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmalarını kullanın.Yalnızca beş kare mikrometreden büyük olanları tutarak seçili nesneleri filtreleyin. Bunu popülasyon bir olarak adlandırın. Bu popülasyonu kullanarak, nesnelerdeki boşlukları doldur komutunu uygulayın; bu adım popülasyon ikiyi oluşturur.Pozitif işaretli klamidya inklüzyonlarını tanımlayan popülasyon üçü elde etmek için, popülasyon birini popülasyon ikisinden çıkarın. Popülasyon üçe boyut filtresi uygulamak için filtre popülasyon komutunu kullanın. Örneğin, 24 saat veya daha uzun süre enfekte olmuş hücrelerdeki inklüzyonlar için 25 square micrometers'tan büyük nesneleri tutun; erken enfeksiyon süreleri için ise boyut filtresini 4 square micrometers'tan büyük nesneleri tutacak şekilde ayarlayın.Bu inklüzyonlar çok daha küçük olduğundan, boyut filtresi inklüzyonlar olarak tanımlanan bir nesne popülasyonu ile sonuçlanır. İnklüzyon sayısı, inklüzyon boyutu ve inklüzyon çevresi gibi kantitatif verileri görüntülerden hesaplamak için görüntüleme yazılımını kullanın. Klamidya enfeksiyonu sonrası inklüzyonlar, siyah noktalar ve konak hücreler veya konak hücreler içindeki floresan protein eksprese eden klamidyalar olarak kolayca görülebilir; bu netlik, çok sayıda görüş alanı ve/veya tedavi boyunca otomatik tanımlama için kullanılabilir.Bu grafikte gösterildiği üzere, temel bir uygulama alanı, hem zaman alan hem de maliyetli olan immunofloresan prosedürlere olan ihtiyacı ortadan kaldıran, canlı enfekte hücrelerdeki klamidya inklüzyon oluşturma birimlerinin belirlenmesidir. Bu görüntüleme yaklaşımının bir diğer önemli özelliği, herhangi bir klamidya türüne veya suşuna kolaylıkla uygulanabilmesidir. Bu örnekte, dört klamidya türü veya suşundan biriyle enfekte edilmiş GFP hela hücrelerinin zaman seyri analizi, bu türlerin ve suşların her biri için gerçekleştirilmiştir.Belirtilen zamanlarda inklüzyonlar işaretlendi ve ortalama alanları, çevre uzunlukları ve hücre başına düşen sayıları hesaplanmak üzere analiz edildi. Bu özellikler, konak hücre ile nasıl etkileşime girdikleri de dahil olmak üzere, klamidya inklüzyonlarının biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada, enfeksiyondan 48 saat sonra başlayarak 125 dakika boyunca beşer dakikalık aralıklarla alınan zaman ayarlı görüntülerden oluşturulmuş, GFPC, Tracom L ile enfekte edilmiş m cherry hela hücrelerinin bir videosu gösterilmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, bu ters görüntüleme tekniğinin yalnızca Chlamydial inklüzyonlarını görselleştirmek için değil, aynı zamanda inklüzyon alanı çevresi ve hücre başına inklüzyon sayısı gibi inklüzyon dinamiklerini nicelendirmek için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, daha geleneksel görselleştirme tekniklerine kıyasla maliyet etkindir ve tüm klamidya türleri ve suşları ile çalışır.

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Kaynak: Chetrit, D. ve diğerleri.  Legionella pnömofila nokta/icm salgı sisteminin mekansal ve zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografi uygulanıyor. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, floresan olarak işaretlenmiş patojenik bakterilerin hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. Agarose pedleri önce hazırlanır ve yapıştırıcı bir çerçeve içine yerleştirilir. Hücreleri hareketsiz hale getirmek için pedde floresan protein ifade eden genetik olarak...

Flüoresans Etiketlenmiş Bakterilerin Örnek Hazırlanması ve Görüntülemesi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Keşfedin, canlı hücrelerde floresan proteinler kullanarak Chlamydia kapsül büyüme dinamiklerini görselleştirme ve miktarlandırma yöntemini. Bu teknik, tüm Chlamydia türleri için enfeksiyon biyolojisini gerçek zamanlı analiz eder.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak Chlamydia Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde (Video) | JoVE Journal

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak

Daha fazla video keşfet