Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak Chlamydia Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde klamidyal inklüzyon büyüme dinamiklerini görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, ilk önce sitoplazmalarında GFP gibi bir floresan proteini kararlı bir şekilde ifade eden floresan konak hücrelerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, konakçı hücreler klamidya ile enfekte edilir ve inkübe edilmesine izin verilir.

Daha sonra enfekte olmuş hücreler canlı floresan mikroskobu ile görselleştirilir. Son olarak, klamidya inklüzyon özellikleri mikroskop analiz yazılımı ile ölçülür, sonuçta konak hücre içindeki klamidyal inklüzyonları görselleştirmek ve kantitatif sonuçlar için inklüzyonların biyolojik parametrelerini ölçmek için canlı floresan mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin antikor bazlı sayım gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, bu ters görüntüleme stratejisinin canlı hücreler üzerinde ve ayrıca tüm klamidyal türlerin inklüzyon dinamiklerini ölçmek için diğer floresan etiketlerle işbirliği içinde kullanılabilmesidir.

Ayrıca, hücrelerdeki bakterileri etiketleyen rutin yöntemlerin aksine, bu yaklaşım canlı hücrelerdeki inklüzyon zarını aydınlatır ve böylece bu patojen içeren bölmenin önemli dinamik özelliklerini ortaya çıkarabilir. Floresan hela hücreleri oluşturulduktan sonra, metin protokol plakasına göre, GFP Hela hücreleri, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı tabaklar gibi istenen bir kültür kabı üzerinde 4 IFU tayini ve çok kuyulu tarama için 24 oyuklu plakalar, crich cotus içeren donmuş bir tüpü veya buz üzerinde istenen herhangi bir klamidyal suşu çözer ve HBSS'de istenen enfeksiyon çokluğuna seyreltir. Crich Cotus ile statik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, LGV zero VL iki, ortamı kuyulardan aspire eder ve GFP hela hücrelerini yıkamak için HBSS'yi kullanır.

Kuyucuklara seyreltilmiş bakteri ekleyin ve iki saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin, hücreleri aspire edin ve HBSS ile yıkayın. Daha sonra, büyüme ortamı ekledikten sonra, hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve crich'ten serovar D'ye veya başka bir klamidyal suşa santrifüj destekli bir enfeksiyon gerçekleştirin. GFP hela hücrelerini yıkamak ve hücrelere seyreltilmiş bakteri eklemek için HBSS kullanın.

Ardından, enfekte olmuş hücrelerin tabağını, bir tezgah üstü santrifüjde sallanan bir kova rotorunun çok kuyulu bir plaka tutucusuna yerleştirin. Hücreleri bir saat boyunca 900 kez G ve 25 santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra kültür kaplarını bir saat boyunca 37 santigrat derece karbondioksit inkübatörüne bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin, hücreleri aspire edin, HBSS ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamı ekleyin.

Enfekte olmuş hücrelerin tabağını 37 santigrat derecede inkübe edin. Klamidya inklüzyonları görselleştirmek için, klamidya ile enfekte GFP hela hücrelerini karbondioksit inkübatörden çıkarın ve fenol kırmızısı ve% 5 FBS içermeyen RPMI kullanın Ortamı değiştirmek için, çanağı veya çok kuyulu plakayı 20 x veya daha yüksek yağ objektifine sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. Görüntüleme yazılımı kullanarak, büyük kara delikler içeren yeşil hücreler olarak görünen klamidya ile enfekte GFP hela hücrelerini tanımlayın.

Alım kurulumu iletişim kutusunda, yazılımı yeşil kanalı ve örneğe eklenen diğer kanalları alacak şekilde yapılandırın. Görüntüyü istenen zamanlarda elde etmek için eğik çizgi kaydı yakala düğmesini kullanın. Enfeksiyon sonrası. Klamidya ile enfekte GFP hela hücrelerini inkübatörden çıkarın ve çanağı bir invertör floresan mikroskobu üzerine yerleştirin.

İnklüzyonların maksimum çap ve verimde olduğu hücrelerin orta düzlüklerine odaklanın. Net kenarlar, kuyu başına en az 10 alanda görüntü elde eder. Kuyular tipik olarak kopyaları veya deneysel değişkenleri temsil eder.

Ölçümler sekmesi altında GFP hela hücrelerini bulmak için nesneleri bul komutunu kullanın ve yeşil kanalı seçin. Eşik yoğunluğunu hücrelerin göreli yoğunluklarına göre ayarlayın. İnklüzyonların veya siyah bölmelerin ve GFP hela hücrelerinin sayısını gözle manuel olarak sayın veya inklüzyonları otomatik olarak tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmalarını kullanın.

Seçili nesneleri, yalnızca beş mikrometre kareden büyük olanları koruyarak filtreleyin. Bunu bir nüfus olarak adlandırın. Bu popülasyonu kullanarak, bu adımda ikinci popülasyonu oluşturan girdi olarak nesnelerdeki boşlukları doldurma komutunu uygulayın.

Popülasyon üç, olarak belirlenen pozitif işaretli klamidya inklüzyonları elde etmek için popülasyon bir'i popülasyon iki'den çıkarın. Üçüncü popülasyona bir boyut filtresi uygulamak için filter population komutunu kullanın. Örneğin, hücrelerdeki inklüzyonlar için 25 mikrometrekareden daha büyük nesneleri, erken enfeksiyon süreleri için 24 saat veya daha uzun süre enfekte tutmak, boyut filtresini dört mikrometrekareden daha büyük nesneleri tutacak şekilde ayarlar.

Bu kapanımlar çok daha küçük olduğundan, boyut filtresi inklüzyon olarak belirlenmiş bir nesne popülasyonu ile sonuçlanır. Görüntülerden dahil etme sayısı, dahil etme, boyut ve dahil etme gibi nicel verileri hesaplamak için görüntüleme yazılımını kullanın. Klamidya inklüzyonları ile enfeksiyon üzerine çevre, siyah noktalar ve konakçı hücreler içinde klamidya eksprese eden konakçı hücreler veya floresan protein olarak kolayca görülebilir ve bunların berraklığı, çok sayıda görüş alanı ve/veya tedavide otomatik tanımlama için kullanılabilir.

Bu grafikte gösterildiği gibi, önemli bir uygulama, canlı enfekte hücrelerde klamidya inklüzyon oluşturan birimlerin belirlenmesidir, bu da hem zaman alıcı hem de maliyetli olan immünofloresan prosedürlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu görüntüleme yaklaşımının bir diğer önemli özelliği, herhangi bir klamidya türüne veya suşuna kolayca uygulanabilmesidir. Bu örnekte, bu türlerin ve suşların her biri için dört klamidyal tür veya suştan biri ile enfekte olmuş GFP hela hücrelerinin bir zaman seyri analizi yapılmıştır.

İnklüzyonlar, belirtilen zamanlarda ortalama alanlarını, çevre uzunluklarını ve hücre başına sayılarını hesaplamak için işaretlendi ve analiz edildi. Bu özellikler, konakçı hücre ile nasıl etkileşime girdikleri de dahil olmak üzere, klamidyal inklüzyonların biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada, enfeksiyondan 48 saat sonra başlayarak, 125 dakika boyunca beş dakikalık aralıklarla çekilen hızlandırılmış görüntülerden oluşan GFPC, Tracom L iki ile enfekte olmuş m kiraz hela hücrelerinin bir videosu gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, bu ters görüntüleme tekniğini yalnızca Klamidyal inklüzyonları görselleştirmek için değil, aynı zamanda inklüzyon alanı çevresi ve hücre başına inklüzyon sayısı gibi inklüzyon dinamiklerini ölçmek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, daha geleneksel görselleştirme tekniklerine kıyasla uygun maliyetlidir ve tüm klamidyal türler ve suşlarla çalışır.