Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, bakterilerin in vivo ortamda insan kan damarlarına nasıl enfekte olduğunu incelemektir. Bu işlem, öncelikle immunyetersiz bir fareye insan derisi greftlenerek insan dermal kan damarlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, humanize edilen fareler bakterilerle enfekte edilir.

Ardından, enfeksiyonun önceden belirlenmiş bir süre boyunca ilerlemesine izin verilir. Son adımda, enfeksiyon sonucunu değerlendirmek için kan ve doku örnekleri alınır. Nihayetinde, insan damarlarındaki enfeksiyonun ilerleyişini incelemek için histoloji, immünofloresan ile kan ve doku analizinden oluşan bir kombinasyon kullanılır.

Bu tekniğin, hücre kültürü modelleri veya hayvan modelleri gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, bu enfeksiyonlar sırasında meydana gelen tipik klinik patolojiyi ilk kez gözlemleyebilmemizdir. Toplamadan hemen sonra, insan cilt yüzeyini %70 ethanol ile temizleyin ve ardından, tercihen bir laminar akış kabini altında, iyi temizlenmiş bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirin. Ardından, cildin üst kısmından 200 ila 400 mikrometre kalınlığında dilimler kesmek için önceden ayarlanmış kalınlığa sahip bir dermatom kullanın.

Kesitlerin bütünlüğünü kontrol edin ve ardından bunları ikiye iki santimetrelik kareler halinde daha fazla kırpın. Kareleri PBS içine yerleştirin ve ardından cerrahi olarak hazırlanmış, anestezi uygulanmış, altı ila sekiz haftalık, ağır kombine immün yetmezlikli bej bir farenin tıraşlanmış bölgesini %70 etanol ile temizleyin. Greft bölgesine lokal anestezik uyguladıktan sonra, kavisli makas kullanarak, alttaki damar yapısına zarar vermemeye dikkat ederek, greft parçalarından biraz daha küçük bir alandaki fare deri yüzeysel tabakasını dikkatlice kaldırın.

Greftin kurumasını önlemek için hızlı hareket ederek, epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde insan deri dilimlerinden birini greft yatağının üzerine yerleştirin. Dokunun kenarını hizalayın ve doku yapıştırıcısı ile sabitleyin. Ardından, her kenarın etrafına az miktarda doku yapıştırıcısı sürerek insan derisinin geri kalanını greft yatağına dikkatlice uydurun.

Greft yatağını genişletmek yerine, insan derisini her zaman uygun boyuta göre kesin. Her köşenin sabitlendiğinden emin olduktan sonra, bölgeyi iyotlu bir solüsyonla temizleyin ve yastık kısmı greftin üzerine gelecek şekilde bir bandajı sıkıca ancak çok gergin olmayacak şekilde uygulayın; bu sırada hayvanın solunumunun etkilenmediğine dikkat edin, ardından bandajı pansuman bandı ile sabitleyin ve hayvanın sıcak bir yüzeyde iyileşmesine izin verin. Hayvan uyandıktan sonra, bakteriyel enjeksiyon için gece boyu plaka kültüründen sıvı kültüre yeniden ekim yapana kadar hayvanı kafesine geri yerleştirin.

Enfeksiyonun gerçekleştiği sabah, bakteriler istenen konsantrasyona ulaştığında, hücreleri mililitrede 1 × 10⁷ koloni oluşturan birim seviyesine seyreltin. Ardından anestezi sonrası, greftlenen farelerin sedasyonunu ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle doğrulayın ve hayvanları ısıtıcı ped üzerine yerleştirin.

Hayvanların gözlerine göz merhemi sürün ve ardından ip yoluyla her bir fareye salin içinde sekiz miligram insan transferini enjekte edin. Sonrasında, enfeksiyon öncesinde kanın steril olduğunu doğrulamak için her hayvanın kuyruk ucunu kesin ve kuyruktan alınan küçük bir damla kanı agar plakasına yayın.

Ardından, bakteriyel kültürün 100 µL'sini retroorbital enjeksiyon yoluyla intravenöz olarak enjekte edin. Birkaç dakika sonra, kuyruk ucunu tekrar kesin ve bu kan örneğini de taze agar plakalarına ekimleyin. Enfeksiyonu takiben hemen kan koloni oluşturucu birimlerini belirlemek için kuyruğu doku yapıştırıcısı ile kapatın, ardından bakteriyel inokülumu seyreltin ve uygun antibiyotikler içeren agar plakalarına ekimleyin.

Enfeksiyondan altı saat sonra inokülum koloni oluşturan birimlerini belirlemek için her bir fare kuyruğundan küçük bir miktar daha kan alın, ardından altı saatteki koloni oluşturan birimlerini belirlemek için kan damlalarını az önce gösterildiği gibi seyrelterek plaklara ekin. Daha sonra, enfekte hayvanların organ koloni oluşturan birim sayımlarını gerçekleştirmek için tüm plakları %5 karbondioksit içeren 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ötanazi uygulanmış her farede orta hat boyunca bir insizyon yaparak başlayın. Ardından her hayvan için kaburgayı kesin ve kalbe bir insizyon yapın. Steril bir şırınga kullanarak kalp ve göğüs boşluğundan mümkün olduğunca fazla kan çekin ve bunu her örnek için ayrı steril tüplere aktarın.

Ardından, ilgili organları çıkarın ve deri greftleri ile beraberindeki fare derisi kesitlerini hayvan başına bir adet steril platoya aktarın. Toplanan kanın 15 dakika boyunca pıhtılaşmasını bekleyin ve ardından santrifüjleyin. Sonrasında plazmayı kandan ayırın ve daha sonraki analizler için -80 °C'de saklayın.

Ardından, her biri 500 µL PBS içeren homojenizasyon tüplerini tartın. Daha sonra, diseke edilen her bir dokudan dört milimetrelik biyopsi örnekleri almak için steril bir biyopsi pançı kullanın. Biyopsileri, cilt örneği içeren her tüpe bir adet iki milimetrelik boncuk ekleyerek homojenizasyon tüplerine ayrı ayrı yerleştirin.

Kalan dokuları mikroskopi için 4%para formaldehit içerisinde dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın ve biyopsi ağırlığını belirlemek için homojenizasyon tüplerini tartın. Ardından, örnekleri 6.000 RPM hızda 30 saniye boyunca homojenize edin; homojenat bulanık hale gelene kadar deri homojenizasyon işlemini tekrarlayın. Son olarak, her tüpteki hücre süspansiyonlarını taze agar plaklarına yayın ve kültürleri 37 derece santigrat sıcaklıkta, 5%karbon dioksit ortamında gece boyunca büyütün.

Bu temsilci sonuçlarda organ koloni oluşturucu ünite sayımlarını belirlemek için, N. meningitis Serogrup C'nin GFP pozitif bir suşu kullanılmıştır.

Kan sayımları, 1x10⁶ koloni oluşturan birim bakteri IV enjeksiyonundan beş dakika sonra, kanda dolaşan ortalama 1,5x10⁵ koloni oluşturan birim/mililitre bulunduğunu göstermiştir. Altı saat sonra sayımlar ortalama 4,8x10⁴ koloni oluşturan birim/mililitreye düşmüş ve 24 saat itibarıyla ortalama sayımlar 2,4x10⁴ koloni oluşturan birim/mililitre olarak kaydedilmiştir.

Ancak 10 fareden oluşan bu grupta, beşinde saptanabilir düzeyde dolaşan bakteri bulunmazken diğer beşinde nispeten yüksek sayımlar görülmüştür. Bu grafiklerdeki çubuklar, deriden alınan her grup için CFU sayımlarının medyan değerlerini göstermektedir. Örnekler, farelerin çoğunluğunun insan derisinde önemli sayımlara sahip olduğunu göstermekte olup; altı saatte doku miligramı başına ortalama 2.1 × 10⁴ CFU ve 24 saatte doku miligramı başına 4.4 × 10² CFU saptanmıştır.

Kontralateral fare deri örneklerinde 24. saatte bakteri sayımı saptanmamış ve altıncı saatte ise sadece çok düşük sayıda saptanmıştır; bu durum, end menenjitin greftlenen dokudaki insan damarlarına olan güçlü tercihini göstermektedir. Genel olarak, örneklenen diğer organlarda bakteri sayımları çok düşük veya saptanamaz düzeydeydi, ancak iki hayvanda sayım görülmüştür ve bu durum yüksek dolaşım bakteri sayılarıyla ilişkili olabilir. Bu model, virülans faktörlerinin in vivo rolünü belirlemek için de kullanılabilir.

Örneğin, bu deneyde, fonksiyonel tip dört pilus I'den yoksun bakteriyel suşlar kullanılmıştır; bu mutant suşlarla enfekte edilen fareler, insan deri greftlerinde bakteriyel adezyon göstermemiş ve böylece tip dört pilus I'in in vivo adezyondaki kritik rolü doğrulanmıştır. Bir deri greftinin enfeksiyondan iki saat sonra çekilen bu konfokal görüntülerinde, romine konjuge lektin UEA ile boyanmış insan damarları gözlemlenebilir. Derinin epidermal-dermal sınırı net bir şekilde tanımlanabilmektedir ve enfekte eden GFP pozitif Neisseria meningitidis damarlar boyunca net bir şekilde görülebilmektedir.

H ve E boyalı bu insan deri grefti, inflamasyonu ve vasküler sızıntıların yanı sıra epidermal dermal sınıra yakın damarlarda yoğunlaşan trombozu göstermektedir. Enfeksiyondan 24 saat sonra, enfeksiyonların yaklaşık %30'unda, derideki bakteriyel adezyonlar makroskobik olarak saptanabilen purpuraların gelişmesine yol açmıştır. Dolayısıyla, bu tekniğin geliştirilmesi, konakçı-patojen etkileşimleri üzerine çalışan araştırmacıların, hastalık mekanizmalarını insan damarları bağlamında incelemelerine zemin hazırlamaktadır.