Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, neer menenjit bakterisinin insan kan damarlarını in vivo olarak enfekte ettiği mekanizmaları incelemektir. Bu, önce insan derisinin immün yetmezliği olan bir fareye aşılanması ve böylece insan dermal kan damarlarının sokulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, insanlaştırılmış fareler bakterilerle enfekte edilir.

Enfeksiyonun daha sonra önceden belirlenmiş bir süre boyunca ilerlemesine izin verilir. Son adımda, enfeksiyonun sonucunu değerlendirmek için kan ve doku örnekleri alınır. Sonuç olarak, insan damarlarındaki enfeksiyonun ilerlemesini incelemek için histoloji, immünofloresan ve kan ve doku analizinin bir kombinasyonu kullanılır.

Bu tekniğin hücre kültürü modelleri veya hayvan modelleri gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, ilk kez bu enfeksiyonlar sırasında meydana gelen tipik klinik patolojiyi gözlemleyebilmemizdir. Toplama işleminden mümkün olan en kısa sürede, insan derisi yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve ardından iyi temiz bir yüzeye, tercihen bir akış başlığının altına düz bir şekilde yatırın. Ardından, cildin üst kısmından 200 ila 400 mikrometre dilimler kesmek için önceden ayarlanmış bir kalınlığa sahip bir dermatom kullanın.

Dilimlerin bütünlük açısından kontrol edin ve ardından bunları ikiye iki santimetre kareler halinde kesin. Kareleri PBS'ye yerleştirin ve ardından cerrahi olarak hazırlanmış anestezi altı ila sekiz haftalık, ciddi kombine immün yetmezliği olan bej farenin traşlı alanını %70 etanol ile temizleyin. Greft bölgesine lokal anestezik uyguladıktan sonra, alttaki damar sistemini bozmamaya dikkat ederek, greft parçalarından biraz daha küçük bir alanda fare derisinin yüzeysel tabakasını dikkatlice çıkarmak için kavisli makas kullanın.

Greftin kurumasını önlemek için hızlı hareket ederek, insan derisi dilimlerinden birini greft yatağının üzerine yerleştirin ve epidermal tarafın yukarı baktığından emin olun. Dokunun kenarını hizalayın ve doku tutkalı ile sabitleyin. Daha sonra insan derisinin geri kalanını dikkatlice greft yatağına yerleştirin ve her bir kenarın etrafına az miktarda doku yapıştırıcısı yerleştirin.

Greft yatağını büyütmek yerine her zaman insan derisini boyutuna göre kesin. Her köşenin sabitlendiğini onayladıktan sonra, alanı bir iyot solüsyonu ile temizleyin ve hayvanın solunumunun etkilenmemesine dikkat ederek, yastık tarafı greftin üzerine sıkıca ancak sıkı olmayan bir yara bandı uygulayın, ardından yara bandını pansuman bandı ile sabitleyin ve hayvanın ılık bir yüzeyde iyileşmesine izin verin. Uyandıktan sonra, bakteri enjeksiyonu bir gece boyunca plaka kültürünü sıvı kültüre yeniden aşılayana kadar hayvanı kafesine geri koyun.

Enfeksiyonun sabahı, bakteriler istenen konsantrasyona ulaştığında, hücreleri mililitre başına birimler oluşturan 10 ila yedinci koloni haline getirin. Daha sonra anesteziden sonra, aşılanmış farelerin ayak parmağı ile sedasyonunu onaylayın. Hayvanları sıkıştırın ve bir ısı yastığına yerleştirin.

Hayvanın gözlerine göz merhemi sürün ve ardından ip. Her fareye tuzlu su içinde sekiz miligram insan transferi enjekte edin. Daha sonra her hayvan için kuyruğun ucunu kesin ve enfeksiyondan önce kanın steril olduğunu doğrulamak için kuyruktan küçük bir damla kanı bir agar plakasına yayın.

Daha sonra retroorbital enjeksiyon yoluyla intravenöz olarak 100 mikrolitre bakteri kültürü enjekte edin. Birkaç dakika sonra kuyruğun ucunu tekrar kesin ve bu kan örneğini taze agar plakalarına da yayın. Enfeksiyondan hemen sonra kan kolonisi oluşturan birimleri oluşturmak için kuyruğu doku yapıştırıcısı ile kapatın ve ardından bakteri aşısını seyreltin ve uygun antibiyotiklerle agar plakalarına yayın.

Enfeksiyondan altı saat sonra inokulum kolonisi oluşturan birimleri oluşturmak için, fare kuyruklarının her birinden küçük bir miktar daha kan çekin ve ardından altı saatte koloni oluşturan birimleri oluşturmak için kan damlalarını gösterildiği gibi seyreltin ve plakalayın. Daha sonra organ kolonisi oluşumunu gerçekleştirmek için tüm plakaları gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Enfekte hayvanların birim sayıları.

Her ötenazi faresinde orta hat kesisi yaparak başlayın. Sonra her hayvan için kaburgayı kesin ve kalpte bir kesi yapın. Kalp ve göğüs boşluğundan mümkün olduğunca fazla kan çekmek için steril bir şırınga kullanın ve her numune için ayrı steril tüplere dağıtın.

Daha sonra, ilgilenilen organları çıkarın ve ardından deri greftlerini ve fare derisinin eşlik eden bölümlerini hayvan başına bir steril plakaya aktarın. Toplanan kanın 15 dakika boyunca pıhtılaşmasına izin verin ve ardından döndürün. Daha sonra plazmayı kandan çıkarın ve daha sonra analiz etmek için eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Ardından, her biri 500 mikrolitre PBS içeren homojenizasyon tüplerini tartın. Daha sonra, diseke edilen her dokudan dört milimetre biyopsi örneği almak için steril bir biyopsi zımbası kullanın. Biyopsileri tek tek homojenizasyon tüplerine, her tüpte bir deri örneği içeren iki milimetrelik bir boncuk ile yerleştirin.

Kalan dokuları mikroskopi için dört santigrat derecede% 4 para formaldehit içinde saklayın ve biyopsi ağırlığını belirlemek için homojenizasyon tüplerini tartın. Daha sonra numuneleri 6.000 RPM'de 30 saniye boyunca homojenize edin ve homojenat tünene kadar cilt homojenizasyonunu tekrarlayın. Son olarak, hücre bulamaçlarını her tüpten taze agar plakalarına yayın ve kültürleri gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede büyütün.

Bu temsili sonuçlarda organ kolonisi oluşturan birim sayımlarını belirlemek için. N menenjitinin GFP pozitif bir suşu. Serogrup C kullanıldı.

Kan sayımları, altı koloni oluşturan bakteri birimine bir kez 10 kez IV enjeksiyonundan beş dakika sonra, kanda dolaşan mililitre başına ortalama 1.5 kez 10 ila beşinci koloni oluşturan birim olduğunu gösterdi. Altı saat sonra, sayımlar ortalama 4.8 kez 10 ila dördüncü koloni oluşturur ve 24 saat boyunca mililitre başına birimler oluşturur. Ortalama sayımlar 2.4 kat 10 ila dördüncü koloni idi ve mililitre başına birimler oluşturuyordu.

Ancak bu 10 fare grubunda, beşinde saptanabilir dolaşımdaki bakteri yoktu, diğer beşi ise nispeten yüksek sayılara sahipti. Bu grafiklerdeki bu çubuklar, deriden alınan her grup CFU sayımı için medyan değerleri gösterir. Örnekler, farelerin çoğunluğunun insan derisinde önemli sayımlara sahip olduğunu, altı saatte miligram doku başına ortalama 2.1 kez 10 ila dördüncü CFU ve 24 saatte miligram doku başına ikinci CFU'ya 4.4 kez 10 kez olduğunu göstermektedir.

Kontralateral fare derisi örnekleri, 24 saatte hiç bakteri sayımı göstermedi ve altı saatte sadece çok düşük bir sayı sergiledi, bu da aşılanmış dokudaki insan damarlarına son menenjit için güçlü bir tercih olduğunu gösterdi. Genel olarak, örneklenen diğer organda bakteri sayıları çok düşüktü ve tespit edilemedi, ancak iki hayvan sayımlar gösterdi, bu da dolaşımdaki yüksek bakteri sayıları ile ilişkili olabilir. Bu model aynı zamanda in vivo olarak virülans faktörlerinin rolünü belirlemek için de kullanılabilir.

Örneğin, bu deneyde, fonksiyonel tip dört hap I'den yoksun bakteri suşları, bu mutant suşlarla enfekte olmuş farelerde kullanıldı, bu da insan derisi greftlerinde bakteriyel yapışma göstermedi, bu da tip dört hap I'in in vivo yapışmada oynadığı önemli rolü doğruladı. Bir deri greftinin bu konfokal görüntülerinde, enfeksiyondan iki saat sonra, lektin UEA konjuge romin ile boyanmış insan damarları gözlenebilir. Derinin epidermal dermal sınırı açıkça tanımlanabilir ve enfekte edici GFP pozitif ve menenjit damarlar boyunca açıkça görülebilir.

Bu h ve e lekeli insan derisi grefti, iltihaplanma ve vasküler sızıntıların yanı sıra epidermal dermal sınıra yakın damarlara konsantre olan trombozu gösterir. Enfeksiyondan 24 saat sonra Enfeksiyonların yaklaşık% 30'unda, derideki bakteriyel yapışıklıklar makroskopik olarak saptanabilir purpura gelişimine yol açmıştır. Bu nedenle, bu tekniğin geliştirilmesi, araştırma ve konakçı patojen etkileşimlerinde yer alan araştırmacıların, insan damarları bağlamında hastalık mekanizmalarını incelemelerinin yolunu açmaktadır.