Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein moleküllerinin ve protein kaplı boncukların hareketlerini depolimerize edici mikrotübüllerin uçlarıyla incelemektir. Bu, temiz boyutlu bir kapak kızağı ile yeniden kullanılabilir bir akış odasının monte edilmesiyle elde edilir. Daha sonra mikrotübüller tohumlar örtü kızağına tutturulmuş olarak hazırlanır ve mikrotübülleri çekirdeklendirmek için kullanılır, bunlar daha sonra foto tahrip edilebilir kapaklarla geçici olarak stabilize edilir.

Daha sonra GFP etiketli proteinler veya protein kaplı boncuklar akış odasına sokulur ve segmentli mikrotübüllere bağlanır. Mikro küvet depolimerizasyonu daha sonra foto ablasyon ile kapakların çıkarılmasıyla tetiklenir. Etiketli proteinlerin, depolimerize edici mikrotübüllerin uçlarıyla hareket eden uç izleme davranışı gösterip göstermediğini belirlemek için görüntüler CH ile analiz edilir.

Bu tekniğin en büyük avantajı, yüksek zamansal ve özel çözünürlükte mikrotübül izasyonunun tetiklenmesine izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Protokol, ultrasonik frezeleme kullanılarak akış odası hazırlığı ve montajı ile başlar.

Normal mikroskop slaytlarını iki oluğa sahip olacak şekilde değiştirin. Olukları 14 milimetre aralıklarla yapın. Kare 22 milimetre kapak kızakları kullanılarak monte edilen odalar için en uygun olan bir milimetre verin veya alın.

Ardından, slayttaki her oluğa 100 milimetre uzunluğunda bir polietilen tüp yerleştirin ve olukların iç uçlarında yaklaşık beş milimetre çıkıntı bırakın. Tüpleri olukların içine siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitleyin ve tüpleri tamamen olukların içine gömün. Olukları dökmeden dikkatlice epoksi yapıştırıcı ile doldurun.

Bir gün kurumasını bekleyin. Ertesi gün. Katılaşmış yapıştırıcıyı, her bir bağlantı bölgesinin distal ucundan üç ila dört milimetre uzakta kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın.

Slaytın merkezine yakın parçaları çıkarma. Borular oluklarında kalmalı ve kesikler boru açıklıkları ile düz yüzeyler yapmalıdır. Ardından, bir şırıngayı suyla doldurun ve tüplerin düzgün çalışıp çalışmadığını test edin.

Sıvı serbestçe akarsa, olukların dış uçlarına yaklaşık beş milimetre çapında bir damla epoksi yapıştırıcı koyun ve yaklaşık bir gün kurumasını bekleyin. Tamamlanan akış odaları bu nedenle dayanıklıdır ve aylarca tekrar tekrar kullanılabilir. Bu üç saatlik protokol 12 kapak fişi hazırlar.

Bir çeker ocak, bir seramik kapak kayar tutucusu, üç adet 15 mililitrelik boyama kavanozu ve kapaklı 1 250 mililitrelik cam kavanoz gerektirir. Boyama kavanozları, bir yığın halinde dört, normal 1 numara 22 milimetre kapak fişine sığmalıdır. Seramik tutucuda önceden temizlenmiş ve kurutulmuş 12 adet lamel ile başlayın.

Kavanozu artı bir itici silen solüsyonu ile doldurun ve slaytları yavaşça indirin. Kavanozu kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Düzgün bir örtü kayma uygarlığını sağlamanın en kritik adımı, örtü kızaklarının Selene çözeltisinde inkübasyonu sırasında herhangi bir su izinden kaçınmaktır.

Bu adım, mikro tüp tohumlarının sıkı bir şekilde bağlanması için gereklidir. Daha sonra bir protokolde, kapak fişleri hazır olduğunda, seramik tutucuyu kavanozdan çıkarın. Daha sonra kapak fişlerini Teflon kaplı cımbız kullanarak seramik tutucudan metanol yüklü boyama kavanozlarına tek tek aktarın.

Şimdi üç kavanozu, içinde metal veya cam bir kaide bulunan bir sonik banyonun su haznesine yükleyin. Su seviyesi, kavanozların yüksekliğinin üçte ikisinde olmalı, kavanozları 20 dakika boyunca 70 watt'ta sonikleştirmelidir. Sonikasyon sırasında, her beş dakikada bir metanol çözeltisini değiştirin.

Sonikasyon tamamlandığında, durulayın, kapak deiyonize su ile 10 kez temizlenir. Silolama düzgün çalıştıysa, kapak kızakları sudan çıkarıldığında kuru görünecektir, görünüşü ne olursa olsun, kalan suyu iyice çıkarın. Azot gazı transferi kullanılarak, kurutulmuş kapak azotla kurutulmuş sızdırmaz bir kaba kayar.

Kim, mendilleri kapak fişlerinin arasına yerleştirin. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilirler. Bu protokol bir ila iki saat, bir akış odası ve hazırlanmış G-M-P-C-P-P stabilize mikro tubial tohumlar gerektirir.

İlk önce akış odasını monte edin. Hazırlanan sürgünün ortadaki beş milimetre genişliğindeki alanı boyunca iki parça çift taraflı bant takın ve kapak fişini bandın üzerine sıkıca bastırın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, hazneyi bir tüp aracılığıyla 100 mikrolitre B rrb 80 çözeltisi ile doldurun.

Ardından, küçük bir plastik Petri kabının üzerine küçük bir damla iki renkli hızlı döküm dolgu macunu sıkın. Bir kürdan ile hızlı ve iyice karıştırın. Yeşile dönecek.

Sızdırmazlık maddesini hemen kapak kaymasının tüm kenarları boyunca uygulayın. Sızdırmazlık maddesinin kapak kızağının altına çok derine nüfuz edip etmediğini kontrol edin. Bir tüp tıkalıysa, şırınganın fişini çekin ve sızdırmazlık maddesinin sızmasını önlemek için hafif basınç uygulamak için tüpü kaldırın 10 dakika sonra, çözelti akışının kısıtlanmadığından emin olun.

Daha sonra odayı 32 santigrat derecede ısıtılmış bir mikroskop aşamasına aktarın. Çözeltinin çıkarılması için tüplerden birini bir pompaya takın. Giriş borusunun serbest ucunu ılık BRB 80 tamponlu 0,5 milimetrelik bir şişeye daldırın.

Pompayı dakikada 100 mikrolitreye ayarlayın ve gerektiğinde hava kabarcıklarını nazikçe dışarı itmek için kullanın. Bu manuel olarak da yapılabilir. Şimdi 30 mikrolitre sıcak antijen antikoru yüklemek için pompayı kullanın.

Pompayı kapatın ve beş dakika bekleyin. Tüm inkübasyonlar sırasında pompayı kapatın. Daha sonra, odaları yaklaşık 100 mikrolitre ılık b rrb 80 ile yıkayın.

Daha sonra BRB 80'de 50 mikrolitre %1 onik F1 27 perfüze edin. Silolanmış kapak kızağının hidrofobik yüzeyini tıkaması için 10 dakika bekleyin. Şimdi odaları 100 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın.

Daha sonra, pompa hızını dakikada 15 mikrolitreye düşürün ve hazneyi, motilite tamponunda bir ila 200 ila 600 arasında seyreltilmiş 30 ila 40 mikrotübül tohumu ile perfüze edin. Tohumları 15 dakika inkübe edin, ardından bağlanmamış materyali çıkarmak için hazneyi dakikada 100 mikrolitre 400 mikrolitre motilite tamponu ile yıkayın. Daha sonra, pompa hızını dakikada 30 mikrolitreye düşürün ve hazneyi önceden ısıtılmış etiketlenmemiş tübülin çözeltisi ile perfüze edin.

Bu protokolün en kritik yönleri hava kabarcıklarını önlemektir. Taze hazırlanmış tübülin çözeltilerini kullanmak ve özellikle mikro boru şeklindeki kaplama sırasında protokolün tam zamanlamasını takip etmek. Beş ila yedi dakikalık inkübasyon sırasında DIC optiği kullanarak mikro tüp büyümesini izleyin.

Mikrotübüller genellikle yaklaşık 10 mikron büyür, çözeltiyi savaş öncesi Rumine Tubulin Karışımı ile hızlı bir şekilde değiştirir ve sekiz ila 10 dakika daha fazla inkübasyon süresi sağlar. Türbülans ve nükleotidlerin yanı sıra çözünür mikro tübül parçalarını çıkarmak için hazneyi dakikada 20 mikrolitrede 100 mikrolitre motilite tamponu ile iyice yıkayın. Daha sonra, odayı ısıtılmış bir GFP etiketli protein veya protein kaplı boncuk çözeltisi ile perfüze edin ve GFP ile etiketlenmiş olan maya kinetico bileşeni DAM'ın görüntülenmesine devam edin, bakteri hücrelerinden saflaştırıldı ve uç izleme testleri için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı.

Bu tür proteinler, bir mikro tübülün depolimerize edici ucu ile izlenir ve örtü kayması bağlı tohuma doğru sabit bir şekilde hareket eder. Bu proteinler, karşılık gelen bir grafikte eğik bir çizgi olarak görünür ve daha sonra uç izleme kompleksindeki protein moleküllerinin sayısını belirlemek için analiz edilebilir. Bu analiz metin protokolünde detaylandırılmıştır.

Buna karşılık, uç izi bırakamayan proteinler, sökme mikro ucunda floresan sinyalinde bir zenginleşme göstermezler. Bu, insan NDC 80 GFP proteini ile görülür. Protein kaplı boncuklar ve mikrotübüller arasındaki bağlanma genellikle oldukça güçlüdür, bu nedenle mikroskopi odasına boncuklar eklendiğinde, segmentli kapak kayması bağlı mikrotübüllere kolayca bağlanırlar.

Boncuk takibi işlemsel olduğunda, birçok gözlem yapılabilir. Bir mikrotübüle bağlanan boncuklar, mikrotübüller büyüme bölgelerinin etrafında hafifçe dönerken yay benzeri bir hareket gösterdi. Dengeleyici kapak yandığında, tohum ve boncuktan distalde yalnızca bir kırmızı segment görülebiliyorsa, boncuk bir mikro tübüle tutturulur.

Kapak genellikle, kapak ağartılana kadar boncuk hareketini takiben görülebilir Ağartmadan kısa bir süre sonra boncuk hareketi, mikrotübül oryantasyonu ile tutarlı görünür. Mikro tüp kısaldıkça ve boncuk tohuma doğru hareket ettikçe, ark benzeri salınımların genliği azalır. Boncuklar stabil mikrotübüllere kalıcı bağlantılar oluşturamazsa.

Lazer yakalama, artı uç yönelimli kinesin SE E'nin farklı protein yapılarına sahip boncuklar kullanılabilir, bu teknik, boncukları bir TP varlığında segmentli mikro tubial duvarlara fırlatmak için gerekli olmuştur. Bu boncuklar, bir grafik üzerinde kapaklı mikro tüp artı uçlara doğru hızla hareket etti. Bu hareket, kapak tahrip edildikten sonra kapağa doğru yönlendirilen eğik bir çizgi ile sonuçlandı. Kesilmiş casus proteini ile kaplanmış boncuklar, yeşil okla gösterildiği gibi mikro tübülden ayrılmıştır.

Buna karşılık, tam uzunlukta B proteinine sahip boncuklar, ters yönde hareketi sürdürebilir. Bu, mikrotübüllerin artı veya eksi ucuna zıt yönlerdeki hareket nedeniyle chm grafiğinde zikzak bir desen olarak görülür. Bu videoyu izledikten sonra, mikro tüp sökme ile yönlendirilen hareketleri incelemek için akış odalarının nasıl hazırlanacağını ve segmentli mikrotübüllerin nasıl büyütüleceğini iyi anlamış olmalısınız.