Name: Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Öğrenin, fotoablasyonla kontrollü depolimerizasyon için segment mikrotübüller hazırlama yöntemini. GFP etiketli proteinlerin uç izleme davranışlarını analiz ederek mikrotübül dinamiklerini hücre biyolojisinde inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bir protokol geliştirme ve reaktiflerin sağlanması için rakamları, N. Gudimchuk ve P. Zakharov görüntüleri sağlamak için, N. Dashkevich, N. Gudimchuk ve A. Korbalev yeniden akışı odaları tasarımı ve üretimi için yardımcı olmak için FI Ataullakhanov teşekkür etmek istiyorum Metin düzenleme ve ipuçları ve tartışmalar için Grishchuk laboratuarında diğer üyeleri ile yardım için digoksigenin etiketli mikrotübül tohum, A. Potapenko hazırlamak. Bu çalışma ile desteklenmiştir NIH hibe R01 GM-098389 ve Kimmel Scholar olduğunu ELG Pennsylvania kas Enstitüsü, bir pilot hibe, RFBR 12-04-00111-a, 13-04-40190 H hibe ve 13 ile -04-40188-H, Bilimleri Başkanlık Hibeler Russian Academy FI Ataullakhanov için (Moleküler Sistem Entegrasyonu ve Molekül ve Moleküler Hücre Biyolojisi programları Mekanizmaları), NIH JR McIntosh GM R01 GM033787 hibe ve Dmitry Zimin Hanedanı Vakfı doktora sonrası bursu için VAV

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birçok tek molekül tahliller günümüzde rutin büyük ölçüde non-spesifik protein yapışmasını azaltmak için özel olarak işlenmiş lamelleri kullanın. Biz burada açıklamak prosedür Howard laboratuarda 32 geliştirilen orijinal protokol bir değişiklik olduğunu ve lamelleri Silanizing bile floresan kullanmayın DIC-tabanlı boncuk deneyleri ile çabaya değer olduğunu bulmak. Bu tür lamelleri ile monte Chambers daha temiz yüzeyler göstermektedir, ve çözünür mikrotübül bağlama proteini varlığında elde edilen sonuçlar çok ...

Mikrotübüller hücre mimarisi yüksek hücre motilite, hücre bölünmesi ve hücre içi ulaşım 1 için önemli olan hücre iskeleti yapısını muhafaza edilir. Bu dinamik polimerler GTP varlığında tübülin ikinci montaj ve kendiliğinden büyüme ve 2 kısalma arasında geçiş yapma. Mikrotübüller (çapı sadece 25 nm) kontrast ışık mikroskobu ile mikrotübülleri gözlemlemek için kullanılmalıdır geliştirmek için bu nedenle özel optik teknikler çok ince. Bu polimerler ile önceki iş diferansiyel girişim kontrast (DIC) 3 kullanılarak dinamik davranışlarını inceledi. In vitro çalışmalar, bu ve benzeri tipik bir deney koşulları altında, mikrotübüller, sadece nadiren depolimerizasyon için felaket ve geçiş tabi olduğunu ortaya kez her 5-15 dakika (bu frekans 28-32 ° C &#39;de incelenmiştir 7-15 mM çözünür tubulin konsantrasyonu için ) 4. Farklı teknikler böylece induc ileri sürülmüştürkontrollü bir şekilde e mikrotübül depolimerizasyonu. Mikrotübül kısalma burada açıklandığı gibi, uzak çözünür tubuline 5,6 yıkayan bir lazer ışını 7 mikrotübülleri kesme veya segmentli mikrotübülleri 8 ile tetiklenebilir. Parçalara mikrotübülleri, hem de davranışsal geçiş polimerleri kullanan önceki çalışma, bu kromozom, veziküller ve protein-kaplanmış boncuklar gibi küçük hücre içi yüklerin, katı yağ mikrotübül 9-13 uçlarında hareket edebilir bulmuştur. Bu olgu mitotik hücrelerde kromozom hareketleri için bir doğrudan etkisi olduğu düşünülen ve altta yatan mekanizmalar etkin soruşturma 14-16 halen olmasıdır. Son zamanlarda, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi dahil floresan-tabanlı teknikler, dinamik mikrotübül ile hareketliliği incelemek için istihdam edilmiştir 17-24 sona erer. Bu yaklaşımın avantajı sağlar: ki etkileşim incelenmesiFarklı florofor ile etiketlenmiş proteinleri kullanarak gerçek zamanlı olarak mikrotübül ve mikrotübül bağlanma proteinleri arasındaki s. Çeşitli protein kompleksleri mikrotübül uçları uzatma ve / veya katı yağ ile processively hareket bulunmuştur. Bunlar mikrotübüle bağlı proteinler Dam1 10,12,18, 19 Ska1 ve XMAP215 20, hem de kinesin motorlar Kif18A 21,22, 23 ve MCAK CENP-E 24 içerir. Bu proteinler EB1 25 gibi klasik uç-izleme proteinlerin bu temelde farklı süreçsel uç-izleme, sergilerler. EB1 ve ilişkili moleküller ortakları kararlı bir şekilde dinamik mikrotübül ayrı moleküller hızla çözünen havuz 26 ile karşılıklı, sadece yaklaşık 0.8 saniye için mikrotübül ucuna bağlı kalır, uçları ile bağlantılı kalmasını görünse de. Mikrotübül birçok mikron için biter aksine, süreçsel ucu izci, Dam1 gibi, seyahat ve mikrotübül ipuçları ile ilişkisi m sürebilirHerhangi bir saniye. Uç birleştirilmesi zaman yanı sıra izleme edilen oranı, tip-27, izleme kompleks oluşturan moleküllerin sayısına kuvvetle bağlıdır. Büyük protein toplulukları genellikle çok daha iyi uç-izci vardır. Örneğin, izole edilmiş maya kinetekor gibi kompleks düzenekleri mikrotübül bağlanmış kalabilir 28 saat için sona erer. Bazı mikrotübül bağlayıcı proteinler, örneğin Ndc80 kinetochore protein kompleksi, tek bir molekül düzeyinde biter mikrotübül ile izlemek mümkün bulundu, henüz Ndc80 boncuk kargo 19,29-31 hareketini bağlanması çok etkili olmuştur. Bu nedenle, farklı protein kompleksleri, hem de kendi biyolojik rolleri ile uç-izleme mekanizmasını anlamak için, bu tip-izleme kompleks moleküllerin sayısının bir fonksiyonu olarak, uç-izleme incelemek için, hem de belirlemek için önemlidir boncuk yük yüzeyinde toplu hareketliliğini sergilediği bu komplekslerin yeteneği. (Şekil 1A) ile deneyler hazırlamak ve yürütmek için ayrıntılı protokoller aşağıda sunmaktayız. İlk olarak, ticari olarak temin edilebilen cam slaytlar kısa bir polietilen boru (Protokol 1) bağlamak için modifiye edilir. Yeniden mikroskopi akış odası o zaman böyle bir slayt monte ve kimyasal veya plazma temizlenmiş ve Silanlanmış lamel (protokol 2) 32-34 edilir. Elde edilen hücre hacmine giriş hortumunun hacmi de dahil olmak üzere 20-25 ul (veya 15 ul kadar küçük, Protokol 1 Not: 3) &#39;dir. Ticari olarak temin edilebilen akış gözlerinden de kullanılabilir, ancak bunların hacmi proteinlerin gereksiz atık yol açan, genellikle daha büyüktür. Daha büyük bir bölme kullanılması durumunda, aşağıdaki protokol tüm çözümlerin hacim ölçekli orantılı olmalıdır. Mikrotübül tohumlar daha sonra yavaş yavaş hidroliz edilebilir GTP analoğu GMPCPP (Guanozin-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (3 protokol kullanılarak, örneğin hazırlanır, Hyman &lt;ayrıca bkzem&gt; et al. 35). Tohumlar temizlenmiş bir lamel üzerine immobilize edilir ve yüzey, daha sonra, diğer proteinlerin spesifik olmayan emilmesini önlemek için bloke edilir 32 (protokol 4 digoksigenin ile tohum immobilizasyon açıklanmaktadır). Parçalara mikrotübül Protokol&#39;ü ve sonra 5 kullanılarak hazırlanabilir. Bu yaklaşımın temel mantık GTP varlığında meydana dinamik mikrotübül polimerler GMPCPP içeren kararlı tubulin kesimleri, kısa &quot;kapaklar&quot; eklenerek geçici olarak stabilize edilebilir olmasıdır. Bu kapaklar da Rodamin etiketli tubulin içerir, bu nedenle bir 530-550 nm lazer veya cıva ark lambası (Protokol 6) 36 ile görüş alanını aydınlatarak basitçe kaldırılabilir. Ucu-izleme sinyalinin floresan yoğunluğu daha sonra dikkate mikroskop alan aydınlatma (Protokol 7) ve eşitsizliği alarak sökmeden mikrotübül uçları ile seyahat moleküllerin sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. Benzer bir yaklaşım kullanılabilir27 (Protokol 8) &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mikrotübüllerin depolimerizasyon ve protein-kaplanmış boncuklar arasındaki etkileşimi incelemek için. Bazı proteinler kolayca bölümlere mikrotübül duvarlara bağlanırlar, ancak lazer cımbız da böylece onun bağlanmasını destekleyerek, mikrotübül duvarına yakın boncuk tutmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tablo 1. Mikroskopi ve diğer ekipmanlar.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>DIC ve epifloresan görüntüleme yapabilen diğer mikroskop modelleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Yağ 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Objektif ısıtıcı</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Floresan filtre küpü</td><td>Chroma</td><td>49004 veya 49008 41017 veya 49020</td>, <td>Rhodamine floresan için optimize edilmiştir&nbsp; GFP floresan için optimize edilmiştir</td></tr><tr><td>Edinme yazılımı</td><td>ücretsiz MicroManager Moleküler Cihazlar</td><td>uygulanamaz MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ diğer yazılımlar görüntü elde etmek ve parçacık izleme</td></tr><tr><td>EMCCD kamerası</td> için kullanılabilir <td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Son derece hassas EMCCD kamera</td></tr><tr><td>Yakalama lazeri</td><td>IPG Fotonik</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>1.064 nm lazer, 10 W</td></tr><tr><td>Floresan uyarma lazerleri</td><td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Safir 488 LP Safir 552 LP</td><td>yeşil floroforların uyarılması kırmızı floroforların uyarılması</td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Ticari akış odaları</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 veya RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası</td><td>Cole Palmer Harvard Aparatı</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Her iki pompa da gerekli sıvı akış hızını sağlar, ancak peristaltik bir pompa çok yavaş hızda titreyebilir. Bir şırınga pompası ile akış, çok çeşitli oranlar için daha tutarlıdır, ancak bu pompanın ataleti vardır.</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 2. Mikroskopi odası hazırlığı.</güçlü></td></tr><tr><td>Yeniden kullanılabilir odalar için modifiye mikroskop slaytları</td><td>Colorado'nun Hassas Cam Üflemesi</td><td><güçlü> şemaları kullanarak slaytlarda özel sipariş www.precisionglassblowing.com Sonic yuvaları Şekil 1</güçlü></td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>Kimlik 0.58 mm, OD 0.965 mm; Monte edilmiş hazneyi pompaya ve atık kabına bağlamak için bu tüpleri kullanın</td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>ID 0.28 mm, OD 0.61 mm; Yeniden kullanılabilir hazneyi yapmak için bu tüpleri kullanın</td></tr><tr><td>Düzenli mikroskop slaytları</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Diğer benzer slaytlar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>Diğer benzer lameller kullanılabilir</td></tr><tr><td>Silikon dolgu macunu</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SILIKON DOLGU MACUNU 5 DK KÜR</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Veya diğer üreticilerin siyanoakrilat yapıştırıcısı</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 3. Lamel temizleme ve kaplama.</güçlü></td></tr><tr><td>Moleküler Elekler, Sınıf 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı Boyama Kavanozu</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Lamel Seramik Tutucu</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silan</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoksigenin AB</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 4. Tohumların ve segmentli mikrotübüllerin hazırlanması.</td></tr><tr><td></td><td>beyinlerinden saflaştırılmış tübül Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Saflaştırma protokolleri için bakınız 49&ndash; 51 Etiketsiz domuz tübülini</td></tr><tr><td>Etiketli tübülin</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)</td><td>Rodamin etiketli domuz tübülini Tubulin, referansta olduğu gibi herhangi bir amin reaktif boya ile etiketlenebilir52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquot ve -70 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vazelin, lanolin ve parafin kütlece 1: 1: 2'de</td><td>referansa bakınız9</td><td></td></tr></tbody></table>

sökme mikrotubul saplı tarafından driven hareketleri eğitim için segment mikrotübüller hazırlanması

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Mikrotübül depolimerizasyonu, in vitro olarak, farklı protein kompleksleri ve protein-kaplanmış boncuklar taşımak için kuvvet sağlayabilir. Altında yatan mekanizmalar, hücre bölünmesi sırasında mikrotübül bağımlı kromozom hareketleri hayati bir rol oynadığı düşünülmektedir, ancak ilgili proteinler ve onların rolleri kötü tanımlanır. Böylece, saflaştırılmış bileşenler ve tanımlanmış biyokimyasal ortamı kullanılarak in vitro bu hareketliliği incelemek için hangi ile analizi geliştirilmesi için, artan bir ihtiyaç vardır. Mikrotubuller Ancak, doğal olarak istikrarsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Biz burada açıklamak protokolleri photoablatable kapaklarını stabilize ile yapılır kesimli mikrotübüllerde yararlanmak. Bu tür kesimli Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül ucunda hareketlilik çalışmaları yardımcı olmak, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir. Bu teknik, ca için kullanılabilirDinamik mikrotübül uçları processively hareket floresan etiketli protein kompleksleri, moleküllerin sayısının kantitatif analiz iken yapılmalıdır. Bu, bir sinyal-gürültü oranı ve diğer sayısal floresan tahlilleri optimize etmek için, lamelleri çözünür floresan etiketli proteinlerin spesifik olmayan emilmesini azaltmak için tedavi edilmelidir. Ayrıntılı yöntemler, dikkate floresan aydınlatma eşitsizliği almak ve eşit Gauss uyum kullanarak tek bir fluorofor yoğunluğunu belirlemek için sağlanır. Son olarak, ilerleyici yük hareketi etti mikrotübül depolimerizasyonu için farklı motor ve fonksiyonları ilgilendirmeyen proteinlerin yeteneği bakış açıları sağlayan, protein kaplı mikroboncuk mikrotübüle bağlı hareketleri çalışma segmente mikrotübül kullanılmasını tarif eder.

Mikrotubulu depolymerizing izlemeyi Protein biter. Maya kinetochore bileşen Dam1 kadar depolymerizing mikrotübülün en uç-tracker 14 biter. GFP ile etiketlenmiş bu 10 alt birim kompleksi kolaylıkla ifade edilen ve bakteri hücrelerinin 18,38 saflaştırılmıştır, bu nedenle uç izleme deneyi için pozitif bir kontrol olarak kullanılmasını tavsiye edilebilir. Bir mikrotübülün depolymerizing ucuyla izleyen bir floresan proteini sürekli lamel bağlı tohum (Video 3) doğru hare...

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein moleküllerinin ve protein kaplı boncukların hareketlerini depolimerize edici mikrotübüllerin uçlarıyla incelemektir. Bu, temiz boyutlu bir kapak kızağı ile yeniden kullanılabilir bir akış odasının monte edilmesiyle elde edilir. Daha sonra mikrotübüller tohumlar örtü kızağına tutturulmuş olarak hazırlanır ve mikrotübülleri çekirdeklendirmek için kullanılır, bunlar daha sonra foto tahrip edilebilir kapaklarla geçici olarak stabilize edilir.Daha sonra GFP etiketli proteinler veya protein kaplı boncuklar akış odasına sokulur ve segmentli mikrotübüllere bağlanır. Mikro küvet depolimerizasyonu daha sonra foto ablasyon ile kapakların çıkarılmasıyla tetiklenir. Etiketli proteinlerin, depolimerize edici mikrotübüllerin uçlarıyla hareket eden uç izleme davranışı gösterip göstermediğini belirlemek için görüntüler CH ile analiz edilir.Bu tekniğin en büyük avantajı, yüksek zamansal ve özel çözünürlükte mikrotübül izasyonunun tetiklenmesine izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Protokol, ultrasonik frezeleme kullanılarak akış odası hazırlığı ve montajı ile başlar.Normal mikroskop slaytlarını iki oluğa sahip olacak şekilde değiştirin. Olukları 14 milimetre aralıklarla yapın. Kare 22 milimetre kapak kızakları kullanılarak monte edilen odalar için en uygun olan bir milimetre verin veya alın.Ardından, slayttaki her oluğa 100 milimetre uzunluğunda bir polietilen tüp yerleştirin ve olukların iç uçlarında yaklaşık beş milimetre çıkıntı bırakın. Tüpleri olukların içine siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitleyin ve tüpleri tamamen olukların içine gömün. Olukları dökmeden dikkatlice epoksi yapıştırıcı ile doldurun.Bir gün kurumasını bekleyin. Ertesi gün. Katılaşmış yapıştırıcıyı, her bir bağlantı bölgesinin distal ucundan üç ila dört milimetre uzakta kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın.Slaytın merkezine yakın parçaları çıkarma. Borular oluklarında kalmalı ve kesikler boru açıklıkları ile düz yüzeyler yapmalıdır. Ardından, bir şırıngayı suyla doldurun ve tüplerin düzgün çalışıp çalışmadığını test edin.Sıvı serbestçe akarsa, olukların dış uçlarına yaklaşık beş milimetre çapında bir damla epoksi yapıştırıcı koyun ve yaklaşık bir gün kurumasını bekleyin. Tamamlanan akış odaları bu nedenle dayanıklıdır ve aylarca tekrar tekrar kullanılabilir. Bu üç saatlik protokol 12 kapak fişi hazırlar.Bir çeker ocak, bir seramik kapak kayar tutucusu, üç adet 15 mililitrelik boyama kavanozu ve kapaklı 1 250 mililitrelik cam kavanoz gerektirir. Boyama kavanozları, bir yığın halinde dört, normal 1 numara 22 milimetre kapak fişine sığmalıdır. Seramik tutucuda önceden temizlenmiş ve kurutulmuş 12 adet lamel ile başlayın.Kavanozu artı bir itici silen solüsyonu ile doldurun ve slaytları yavaşça indirin. Kavanozu kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Düzgün bir örtü kayma uygarlığını sağlamanın en kritik adımı, örtü kızaklarının Selene çözeltisinde inkübasyonu sırasında herhangi bir su izinden kaçınmaktır.Bu adım, mikro tüp tohumlarının sıkı bir şekilde bağlanması için gereklidir. Daha sonra bir protokolde, kapak fişleri hazır olduğunda, seramik tutucuyu kavanozdan çıkarın. Daha sonra kapak fişlerini Teflon kaplı cımbız kullanarak seramik tutucudan metanol yüklü boyama kavanozlarına tek tek aktarın.Şimdi üç kavanozu, içinde metal veya cam bir kaide bulunan bir sonik banyonun su haznesine yükleyin. Su seviyesi, kavanozların yüksekliğinin üçte ikisinde olmalı, kavanozları 20 dakika boyunca 70 watt'ta sonikleştirmelidir. Sonikasyon sırasında, her beş dakikada bir metanol çözeltisini değiştirin.Sonikasyon tamamlandığında, durulayın, kapak deiyonize su ile 10 kez temizlenir. Silolama düzgün çalıştıysa, kapak kızakları sudan çıkarıldığında kuru görünecektir, görünüşü ne olursa olsun, kalan suyu iyice çıkarın. Azot gazı transferi kullanılarak, kurutulmuş kapak azotla kurutulmuş sızdırmaz bir kaba kayar.Kim, mendilleri kapak fişlerinin arasına yerleştirin. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilirler. Bu protokol bir ila iki saat, bir akış odası ve hazırlanmış G-M-P-C-P-P stabilize mikro tubial tohumlar gerektirir.İlk önce akış odasını monte edin. Hazırlanan sürgünün ortadaki beş milimetre genişliğindeki alanı boyunca iki parça çift taraflı bant takın ve kapak fişini bandın üzerine sıkıca bastırın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, hazneyi bir tüp aracılığıyla 100 mikrolitre B rrb 80 çözeltisi ile doldurun.Ardından, küçük bir plastik Petri kabının üzerine küçük bir damla iki renkli hızlı döküm dolgu macunu sıkın. Bir kürdan ile hızlı ve iyice karıştırın. Yeşile dönecek.Sızdırmazlık maddesini hemen kapak kaymasının tüm kenarları boyunca uygulayın. Sızdırmazlık maddesinin kapak kızağının altına çok derine nüfuz edip etmediğini kontrol edin. Bir tüp tıkalıysa, şırınganın fişini çekin ve sızdırmazlık maddesinin sızmasını önlemek için hafif basınç uygulamak için tüpü kaldırın 10 dakika sonra, çözelti akışının kısıtlanmadığından emin olun.Daha sonra odayı 32 santigrat derecede ısıtılmış bir mikroskop aşamasına aktarın. Çözeltinin çıkarılması için tüplerden birini bir pompaya takın. Giriş borusunun serbest ucunu ılık BRB 80 tamponlu 0,5 milimetrelik bir şişeye daldırın.Pompayı dakikada 100 mikrolitreye ayarlayın ve gerektiğinde hava kabarcıklarını nazikçe dışarı itmek için kullanın. Bu manuel olarak da yapılabilir. Şimdi 30 mikrolitre sıcak antijen antikoru yüklemek için pompayı kullanın.Pompayı kapatın ve beş dakika bekleyin. Tüm inkübasyonlar sırasında pompayı kapatın. Daha sonra, odaları yaklaşık 100 mikrolitre ılık b rrb 80 ile yıkayın.Daha sonra BRB 80'de 50 mikrolitre %1 onik F1 27 perfüze edin. Silolanmış kapak kızağının hidrofobik yüzeyini tıkaması için 10 dakika bekleyin. Şimdi odaları 100 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın.Daha sonra, pompa hızını dakikada 15 mikrolitreye düşürün ve hazneyi, motilite tamponunda bir ila 200 ila 600 arasında seyreltilmiş 30 ila 40 mikrotübül tohumu ile perfüze edin. Tohumları 15 dakika inkübe edin, ardından bağlanmamış materyali çıkarmak için hazneyi dakikada 100 mikrolitre 400 mikrolitre motilite tamponu ile yıkayın. Daha sonra, pompa hızını dakikada 30 mikrolitreye düşürün ve hazneyi önceden ısıtılmış etiketlenmemiş tübülin çözeltisi ile perfüze edin.Bu protokolün en kritik yönleri hava kabarcıklarını önlemektir. Taze hazırlanmış tübülin çözeltilerini kullanmak ve özellikle mikro boru şeklindeki kaplama sırasında protokolün tam zamanlamasını takip etmek. Beş ila yedi dakikalık inkübasyon sırasında DIC optiği kullanarak mikro tüp büyümesini izleyin.Mikrotübüller genellikle yaklaşık 10 mikron büyür, çözeltiyi savaş öncesi Rumine Tubulin Karışımı ile hızlı bir şekilde değiştirir ve sekiz ila 10 dakika daha fazla inkübasyon süresi sağlar. Türbülans ve nükleotidlerin yanı sıra çözünür mikro tübül parçalarını çıkarmak için hazneyi dakikada 20 mikrolitrede 100 mikrolitre motilite tamponu ile iyice yıkayın. Daha sonra, odayı ısıtılmış bir GFP etiketli protein veya protein kaplı boncuk çözeltisi ile perfüze edin ve GFP ile etiketlenmiş olan maya kinetico bileşeni DAM'ın görüntülenmesine devam edin, bakteri hücrelerinden saflaştırıldı ve uç izleme testleri için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı.Bu tür proteinler, bir mikro tübülün depolimerize edici ucu ile izlenir ve örtü kayması bağlı tohuma doğru sabit bir şekilde hareket eder. Bu proteinler, karşılık gelen bir grafikte eğik bir çizgi olarak görünür ve daha sonra uç izleme kompleksindeki protein moleküllerinin sayısını belirlemek için analiz edilebilir. Bu analiz metin protokolünde detaylandırılmıştır.Buna karşılık, uç izi bırakamayan proteinler, sökme mikro ucunda floresan sinyalinde bir zenginleşme göstermezler. Bu, insan NDC 80 GFP proteini ile görülür. Protein kaplı boncuklar ve mikrotübüller arasındaki bağlanma genellikle oldukça güçlüdür, bu nedenle mikroskopi odasına boncuklar eklendiğinde, segmentli kapak kayması bağlı mikrotübüllere kolayca bağlanırlar.Boncuk takibi işlemsel olduğunda, birçok gözlem yapılabilir. Bir mikrotübüle bağlanan boncuklar, mikrotübüller büyüme bölgelerinin etrafında hafifçe dönerken yay benzeri bir hareket gösterdi. Dengeleyici kapak yandığında, tohum ve boncuktan distalde yalnızca bir kırmızı segment görülebiliyorsa, boncuk bir mikro tübüle tutturulur.Kapak genellikle, kapak ağartılana kadar boncuk hareketini takiben görülebilir Ağartmadan kısa bir süre sonra boncuk hareketi, mikrotübül oryantasyonu ile tutarlı görünür. Mikro tüp kısaldıkça ve boncuk tohuma doğru hareket ettikçe, ark benzeri salınımların genliği azalır. Boncuklar stabil mikrotübüllere kalıcı bağlantılar oluşturamazsa.Lazer yakalama, artı uç yönelimli kinesin SE E'nin farklı protein yapılarına sahip boncuklar kullanılabilir, bu teknik, boncukları bir TP varlığında segmentli mikro tubial duvarlara fırlatmak için gerekli olmuştur. Bu boncuklar, bir grafik üzerinde kapaklı mikro tüp artı uçlara doğru hızla hareket etti. Bu hareket, kapak tahrip edildikten sonra kapağa doğru yönlendirilen eğik bir çizgi ile sonuçlandı. Kesilmiş casus proteini ile kaplanmış boncuklar, yeşil okla gösterildiği gibi mikro tübülden ayrılmıştır.Buna karşılık, tam uzunlukta B proteinine sahip boncuklar, ters yönde hareketi sürdürebilir. Bu, mikrotübüllerin artı veya eksi ucuna zıt yönlerdeki hareket nedeniyle chm grafiğinde zikzak bir desen olarak görülür. Bu videoyu izledikten sonra, mikro tüp sökme ile yönlendirilen hareketleri incelemek için akış odalarının nasıl hazırlanacağını ve segmentli mikrotübüllerin nasıl büyütüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.

Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

Bu yazıda, birlikte dolaşık aktin filamentleri ve mikrotübüllerinin ayarlanabilir üç boyutlu kompozit ağlarının mühendisliği ve karakterizasyonu için protokoller sunulmaktadır. Kompozitler, miyozin II ve kinesin motorları tarafından tahrik edilen aktif yeniden yapılanma ve balistik harekete uğrar ve aktin, mikrotübüller, motor proteinler ve pasif çapraz bağlayıcıların göreceli konsantrasyonları tarafından ayarlanır.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

Burada, protein hazırlama ve yapım ve aktif nematik hapsetme için kuyuların kullanımı da dahil olmak üzere mikrotübüllerden ve kinesin motorlarından aktif nematiklerin hazırlanması için yöntemler sunulmaktadır.

Mikrotübül Tabanlı Aktif Nematiklerin Oluşturulması, Sınırlandırılması ve Gözlemlenmesi

Burada, spesifik bir modifikasyon için zenginleştirilmiş mikrotübüller elde etmek için spesifik mikrotübül modifiye edici enzimlerden yoksun veya içerebilen memeli hücrelerinden endojen tübülin çıkarmak için bir protokol tarif ediyoruz. Daha sonra, ekstrakte edilen mikrotübüllerin, kriyo-elektron mikroskobu için ızgaralar hazırlamak üzere saflaştırılmış mikrotübül bağlayıcı proteinlerle nasıl dekore edilebileceğini açıklıyoruz.

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Öğrenin, fotoablasyonla kontrollü depolimerizasyon için segment mikrotübüller hazırlama yöntemini. GFP etiketli proteinlerin uç izleme davranışlarını analiz ederek mikrotübül dinamiklerini hücre biyolojisinde inceleyin.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Daha fazla video keşfet