Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış, indüklenebilir yapay transkripsiyon faktörleri veya istenen özgüllükte ATF'ler oluşturmak, test etmek ve doğrulamaktır. Bu, ilk olarak, A DNA bağlayıcı alan PCR ürününün dahil edilmesinin, bir insan östrojen reseptörü ve VP 16 ile çerçeve içi bir füzyonla sonuçlandığı basit bir maya dönüşümü yoluyla A TF'nin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, plazmit PMN sekizdeki bağlanma bölgelerini bir TF hedefleme dizileri ile değiştirerek A TF için bir GFP raportör plazmidi oluşturmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, ATF'lerin GFP raportörünü aktive etme yeteneğini test etmek ve ayrıca büyüme hızını ölçerek maya fizyolojisi üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Prosedürün son adımı, doğal bir genomik hedefi koşullu olarak ifade etmek için doğrulanmış bir TF'yi kullanmaktır. Nihayetinde, ilgilenilen herhangi bir hedef gen şartlı olarak aktif hale getirilebilir.

Bu tekniğin, gen ekspresyonunun galaktoz aracılı indüksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, seçici indüksiyonun pleotropik etkiler olmaksızın çeşitli besin ve fizyolojik koşullar altında elde edilebilmesidir. Bu yöntem, istenen gen ürünlerinin hızlı ve geri dönüşümlü bir şekilde eklenmesi yoluyla maya biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve hem kazanç hem de işlev kaybının incelenmesini sağlar. Başlamak için, PCR, yüksek kaliteli bir polimeraz kullanarak DNA bağlanma alanını veya ilgilenilen DVD'yi çoğaltır.

Saflaştırılmış PCR ürününün bir mikrogramından daha fazlasını lityum asetat yöntemini kullanarak mayaya dönüştürün. Transformasyonu takiben, hücreleri bir mikro santrifüjde 15 saniye boyunca en yüksek hızda döndürün, dönüşüm karışımını çıkarın ve maya özütü üzerine kaplamadan önce hücreleri yaklaşık 200 mikrolitre steril suda yeniden süspanse edin. Pepto dekstroz veya YPD ortamı ertesi gün YPD'den beş floro erotik asit plakası üzerine replika plaka.

İki ila dört gün büyüdükten sonra, en az beş ila 10 koloniyi YPD'ye yeniden yerleştirin. Ardından, dahil edilmeyi doğrulamak için metin protokolündeki ve dizisindeki primerleri kullanarak bir koloni PCR gerçekleştirin. İstenilen bağlanma bölgesi oligolarını eşmolar konsantrasyonlara seyreltin.

Bağlanma bölgesini T dört polinükleotid kinaz ve daha sonra metin protokolündeki reaksiyon koşullarına göre bir neo termosikler kullanarak fosforile edin. Daha sonra, bir HF ve xb içermeyen yaklaşık bir ila iki mikrogram PMN sekizini sindirin. 37 santigrat derece jelde bir saat boyunca bir.

Omurga bandını saflaştırın ve saflaştırılmış omurgayı mikrolitre başına 10 nanograma seyreltin. Daha sonra, çift sarmallı fosforile bağlanma bölgesini, mikrolitre başına molar omurga konsantrasyonunun beş katına kadar seyreltin. T dört DNA Ligaz kullanarak, bağlanma bölgelerini 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sindirilmiş omurgaya bağlar.

Ligasyon reaksiyonunun yarısını 50 mikrolitre standart kimyasal olarak yetkin EIA coli hücresine ekleyerek ve metin protokolünde listelenen prosedürü izleyerek dönüşümü gerçekleştirin. Hücreleri geri kazandıktan sonra, luria berti veya lb artı ampisilin plakası başına 100 ila 200 mikrolitre hücre ekleyin, bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün e coli ve lb artı ampisilin sıvısını büyütün ve metin protokolünde açıklandığı gibi plazmit DNA'yı hasat edin.

Ardından, ligasyon kolonilerinden yeni raportör plazmitini sıralayın. Son olarak, yeni raportör plazmitini, lityum asetat dönüşümü kullanarak E suşu içeren A TF'ye dönüştürün. Başlamak için, urasil içermeyen beş mililitre sentetik tam ortamda gece boyunca zorlanma içeren bir TF plus raportör büyütün.

9 250 mililitre elde edin, şişeyi sallayın ve her birine 25 mililitre SC eksi URA ekleyin. Daha sonra, metin protokolünde listelendiği gibi farklı beta estradiol seyreltmesine sahip şişelerden yedisini, gece boyunca kültürlerin 125 mikrolitresinde 25 milimolar beta estradiol stoğunun on kat seri seyreltilmesinden, kalan iki şişe için bu yedi şişeye hazırlayın, kurucu bir GFP üreten suş ve GFP'den yoksun bir suş ile aşılayın. Bunlar akış sitometresini kalibre etmek için gereklidir.

Şişeyi 200 RPM ve 30 santigrat derecede 12 ila 18 saat çalkalayın. Daha sonra her kültürden 500 mikrolitre çıkarın ve ayrı 1.7 mililitrelik einor tüplerinde döndürün. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peletlenmiş hücreleri bir kez akış sitometri tamponu ile durulayın, ardından hücreleri aynı tamponun bir mililitresinde yeniden süspanse edin.

Ardından, dokuz şahin ikisine bir mililitre akış sitometrisi tamponu ekleyin. Yeniden askıya alınan hücreleri, iki mililitreye eşit bir son hacim için şahin tüpleri içeren tampona ekleyin. Son olarak, akış sitometrisi yapın.

Maya hücrelerini tanımlamak için ileri saçılma ve yan saçılma kullanın. Akış hızını saniyede yaklaşık 3000 hücreye ayarlayın. GFP'yi 50 kanalından ölçün ve metin protokolündeki gibi ilerleyin donmuş stoklardan hem A TF içeren bir suş hem de YPD üzerine gerilme eksikliği olan bir A TF çizin İki günlük büyümeden sonra, beş mililitre YPD sıvısı içeren ayrı kültür tüplerini aşılayın ve her bir suşu gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün.

10.000'e kadar 0.25 milimolar beta estradiol stok çözeltisinin on kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin,% 100 etanol içinde katlayın. 10 mililitre YPD sıvısına her gece kültüründen 40 mikrolitre ekleyin. Her suş için, 96 oyuklu bir plakanın 18 oyuğuna 96 mikrolitre seyreltilmiş hücre ekleyin.

Sonra hücrelere dört mikrolitre beta estradiol ekleyin. Önemli bir nokta, her kuyucuğun aynı miktarda toplam etanole sahip olduğundan emin olmaktır. Her bir suş için üç kuyucuk sadece etanol olacak şekilde üçlü bir kopya gerçekleştirin.

Kontroller, 96 kuyulu plakayı gaz geçirgen bir zarla kaplar. Bir plaka okuyucuda 600 nanometrelik bir optik yoğunlukta büyümeyi izleyin. Maksimum eğimi bulmak gibi herhangi bir sayıda yöntem kullanarak büyüme oranlarını ölçün.

Plazmidi PCR metin protokolünde belirtildiği gibi hazırladıktan sonra, kutu MX promotör kasetini yükseltin. PCR ürününü, lityum asetat yöntem plakasını kullanarak bir A TF eksprese eden suşa dönüştürün, hücreleri YPD'ye dönüştürün ve ertesi gün YPD artı G dört 18 antibiyotik üzerine replika plakasını yapın. Son olarak, ileri primer ve promotörü değiştirilen genin içinde bir ters primer kullanarak promotörün uygun şekilde yerleştirildiğini onaylayın.

Nihai PCR ürünü yaklaşık 1.2 KB'dir, burada gösterilen GFP'nin üç farklı TF promotör çifti, Z, dört EVZ, üç EV veya bir mikromolar beta estradiole yanıt olarak zaman içinde GEV tarafından indüksiyonudur. Maya olmayan DNA bağlanma alanları içeren ATF'lere yanıt olarak GFP üretimindeki artışa dikkat edin. Bu, bu faktörlerin maya genomunda tek gen özgüllüğüne ulaşmasından kaynaklanabilir.

GEV indüksiyonu tek başına yüzlerce genin aktivasyonuna veya baskılanmasına yol açarken, Z üç EV ve Z dört EV yalnızca uygun bağlanma bölgeleri içeren sentetik bir promotörün akış aşağısına yerleştirilen bir hedef genin ekspresyonunu aktive eder. Burada, 18 saatlik indüksiyonu takiben sıfır nanomolar beta estradiol ve bir mikromolar beta estradiole yanıt olarak Z üç EV tarafından GFP'nin indüksiyonu gösterilmiştir Z üç EV sisteminin sıkı regülasyonunu göstermek için GFP'den yoksun hücrelerden floresan da ölçülmüştür. Z üç EV'nin bir dizi beta estradiol konsantrasyonunda GFP'yi indükleme yeteneği burada gösterilmiştir.

Dağılımların ortalama floresansı, indükleyici konsantrasyonu ile ekspresyon çıktısı arasındaki ilişkinin, Z üç EV'nin bağımsız bağlanmasını gösteren yaklaşık bir tepe katsayısı ile derecelendirildiğini ortaya koymaktadır Bu prosedürü takiben, tek bir genin ekspresyonunun değiştirilmesinin gen ekspresyonunun genom şarap modellerini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyon mikrodizileri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yapay transkripsiyon faktörlerinin etkinliğini nasıl tasarlayacağınızı, test edeceğinizi ve doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu yapay transkripsiyon faktörleri, uygun DNA hedef dizilerinin aşağı akışına yerleştirilen genlerin ekspresyonunu şartlı olarak kontrol eder.