Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Bu prosedürün genel amacı, istenen özgünlüğe sahip, genetik olarak kodlanmış, indüklenebilir yapay transkripsiyon faktörleri veya ATF'ler oluşturmak, test etmek ve doğrulamaktır. Bu, ilk olarak, DNA bağlama alanı PCR ürününün eklenmesinin insan östrojen reseptörü ve VP 16 ile çerçeve içi bir füzyonla sonuçlandığı basit bir maya transformasyonu yoluyla ATF oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, PMN eight plazmidindeki bağlanma bölgelerinin TF hedefleme dizileriyle değiştirilerek ATF için bir GFP raporlayıcı plazmid oluşturmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, ATF'lerin GFP raporerini aktive etme yeteneğini ölçmek ve büyüme hızını ölçerek maya fizyolojisi üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Prosedürün son adımı ise, doğrulanmış bir TF'yi, yerli bir genomik hedefi koşullu olarak eksprese etmek için kullanmaktır. Nihayetinde, ilgilenilen herhangi bir hedef gen koşullu olarak aktif hale getirilebilir.

Bu tekniğin, galaktoz aracılı gen ifadesi indüksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, pleiotropik etkiler olmaksızın çeşitli besin ve fizyolojik koşullar altında seçici indüksiyonun gerçekleştirilebilmesidir. Bu yöntem, istenen gen ürünlerinin hızlı ve tersine çevrilebilir bir şekilde sunulmasını sağlayarak, hem fonksiyon kazanımı hem de fonksiyon kaybı çalışmalarına imkan tanır ve böylece maya biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, yüksek sadakatli (high fidelity) bir polimeraz kullanarak ilgilenilen DNA bağlanma bölgesini veya DVD'yi PCR ile çoğaltın.

Saflaştırılmış PCR ürününün bir mikrogramdan fazlasını, lityum asetat yöntemiyle maya hücrelerine transforme edin. Transformasyon sonrası, hücreleri bir mikro santrifüjde maksimum hızda 15 saniye boyunca döndürün, transformasyon karışımını uzaklaştırın ve hücreleri maya özütü peptone dekstroz veya YPD ortamına ekmeden önce yaklaşık 200 microliter steril su içerisinde yeniden süspande edin. Ertesi gün, YPD ortamından beş floroerotik asit plaklarına replika ekim yapın.

İki ila dört günlük büyümeden sonra, en az beş ila 10 koloniyi yeniden YPD'ye ekleyin. Ardından, metin protokolündeki primerleri kullanarak koloni PCR'ı gerçekleştirin ve dahil etmeyi doğrulamak için dizileme yapın. İstenen bağlanma bölgesi oligolarını ekimolar konsantrasyonlara seyreltin.

Bağlanma bölgesini T4 polinükleotid kinaz kullanarak fosforize edin ve ardından metin protokolündeki reaksiyon koşullarına göre neo termosikletör ile işleme tabi tutun. Daha sonra, yaklaşık 1-2 µg PMN 8'i Not1 HF ve Xba1 ile 37 °C'de bir saat boyunca sindirin.

Omurga bandını saflaştırın ve saflaştırılmış omurgayı mikrolitre başına 10 nanogram olacak şekilde seyreltin. Ardından, çift sarmallı fosforile bağlanma bölgesini, mikrolitre başına omurga molar konsantrasyonunun beş katı olacak şekilde seyreltin. T4 DNA Ligaz kullanarak, bağlanma bölgelerini sindirilmiş omurgaya oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ligasyon yapın.

Ligasyon reaksiyonunun yarısını 50 µL standart kimyasal kompetan EIA coli hücrelerine ekleyerek transformasyonu gerçekleştirin ve metin protokolünde belirtilen prosedürü takip edin. Hücreleri geri kazandırdıktan sonra, her Luria Bertani veya LB+ampisilin plakasına 100 ila 200 µL hücre ekleyin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, E. coli'yi LB+ampisilin içeren sıvı besiyerinde büyütün ve plazmit DNA'sını metin protokolünde açıklandığı şekilde hasat edin.

Ardından, ligasyon kolonilerinden elde edilen yeni reporter plazmidinin dizi doğrulamasını yapın. Son olarak, yeni reporter plazmidini lityum asetat transformasyonu kullanarak TF içeren E suşuna transforme edin. Başlamak için, TF ve reporter içeren bir suşu, urasil içermeyen beş mililitre sentetik tamamlayıcı ortamda gece boyunca büyütün.

9 adet 250 mililitrelik çalkalamalı erlenle alınız ve her birine 25 mililitre SC minus URA ekleyiniz. Ardından, 25 milimolar beta estradiol stok çözeltisinin on katlı seri dilüsyonundan hazırlanan ve metin protokolünde belirtilen farklı beta estradiol dilüsyonları ile yedi erleni hazırlayınız; gecelik kültürlerden bu yedi erlenin her birine 125 mikrolitre ekleyiniz. Geriye kalan iki erleni ise, akış sitometresini kalibre etmek için gerekli olan, konstitütif GFP üreten bir suş ve GFP eksik olan bir suş ile inoküle ediniz.

Erleni 200 RPM'de ve 30 °C'de 12 ila 18 saat boyunca çalkalayın. Ardından, her kültürden 500 µL alarak ayrı 1,7 mL'lik eppendorf tüplerinde santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, pelletlenmiş hücreleri bir kez akış sitometrisi tamponu ile yıkayın ve ardından hücreleri aynı tamponun 1 mL'sinde yeniden süspande edin.

Ardından, dokuz adet falcon tüpüne birer mililitre akış sitometrisi tamponu ekleyin. Resüspande edilen hücreleri, toplam hacim iki mililitre olacak şekilde tampon içeren falcon tüplerine ekleyin. Son olarak, akış sitometrisini gerçekleştirin.

Maya hücrelerini tanımlamak için ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) değerlerini kullanın. Akış hızını saniyede yaklaşık 3000 hücreye ayarlayın. GFP'yi 50. kanal üzerinden ölçün ve donmuş stoklardan çizgi ekimleme metin protokolünde olduğu gibi ilerleyerek, hem A TF içeren bir suşu hem de A TF içermeyen bir suşu YPD üzerine ekin. İki günlük büyümenin ardından, beş mililitre YPD sıvısı içeren ayrı kültür tüplerini inoküle edin ve her bir suşu 30 °C'de gece boyu büyütün.

0.25 millimolar beta estradiol stok çözeltisinin %100 etanol içerisinde 10.000 katına kadar on katlı seri dilüsyonlarını gerçekleştirin. Her bir gece boyu süren kültürden 40 µL'yi 10 mL YPD sıvı besiyerine ekleyin. Her suş için, dilüe edilmiş hücrelerden 96 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın 18 kuyucuğuna ekleyin.

Ardından hücrelere dört µL beta estradiol ekleyin. Önemli bir nokta, her kuyucuğun aynı toplam etanol miktarına sahip olduğundan emin olmaktır. Her suş için üç kuyucuğu sadece etanol içerecek şekilde üç tekrarlı olarak gerçekleştirin.

Kontroller, 96 kuyucuklu plakayı gaz geçirgen bir membranla kapatır. Büyümeyi, bir plaka okuyucuda 600 nanometre optik yoğunlukta izleyin. Maksimum eğimin belirlenmesi gibi herhangi bir yöntemle büyüme hızlarını nicelendirin.

Metin protokolü PCR'de belirtildiği şekilde plazmit hazırlandıktan sonra, can MX promoter kasetini amplifiye edin. PCR ürününü, lityum asetat yöntemiyle A TF eksprese eden bir suşa transforme edin, transforme olan hücreleri YPD plaklarına ekin ve ertesi gün YPD artı G four 18 antibiyotiği içeren plakalara replika ekim yapın. Son olarak, forward primer ve promotörü değiştirilen genin iç kısmına özgü bir reverse primer kullanarak promotörün uygun şekilde yerleştiğini doğrulayın.

Nihai PCR ürünü yaklaşık 1,2 KB'dir; burada üç farklı ATF promotör çiftinin (Z4EV, Z3EV veya GEV) 1 µM beta estradiol yanıtı olarak zamanla GFP indüksiyonu gösterilmektedir. Maya dışı DNA bağlanma domenleri içeren ATF'lerin yanıtıyla GFP üretimindeki artışa dikkat çekiniz. Bu durum, söz konusu faktörlerin maya genomunda tek gen spesifikliğine ulaşmasından kaynaklanıyor olabilir.

Sadece GEV indüksiyonu yüzlerce genin aktivasyonuna veya represyonuna yol açarken, Z three EV ve Z four EV yalnızca uygun bağlanma bölgelerini içeren sentetik bir promotörün aşağı akışına yerleştirilmiş bir hedef genin ekspresyonunu aktive eder. Burada, sıfır nanomolar beta estradiol ve 18 saatlik indüksiyonun ardından bir micromolar beta estradiol'e yanıt olarak Z three EV tarafından GFP indüksiyonu gösterilmektedir. Z three EV sisteminin sıkı regülasyonunu örneklendirmek için GFP eksikliği olan hücrelerden de floresan ölçümü yapılmıştır. Z three EV'nin bir dizi beta estradiol konsantrasyonunda GFP'yi indükleme yeteneği burada gösterilmektedir.

Dağılımların ortalama floresansı, indükleyici konsantrasyonu ile ekspresyon çıktısı arasındaki ilişkinin, Z three EV'nin bağımsız bağlanmasını belirten yaklaşık bir hill katsayısı ile dereceli olduğunu ortaya koymaktadır. Bu prosedürün ardından, tek bir genin ekspresyonundaki değişikliğin genom genelindeki gen ekspresyon modellerini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyon mikro dizileri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yapay transkripsiyon faktörlerinin nasıl tasarlanacağı, test edileceği ve etkinliğinin nasıl doğrulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu yapay transkripsiyon faktörleri, uygun DNA hedef dizilerinin aşağısına yerleştirilen genlerin ekspresyonunu koşullu olarak kontrol eder.