Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Bu protokolün genel amacı, multipl sklerozu taklit eden bir hastalık modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelitten etkilenen farelerde intravenöz enjeksiyon yoluyla nöral kök progenitör hücreleri CNS'ye iletmektir. Bu, ilk olarak yetişkin farelerden beynin subventriküler bölgesinden nöral kök progenitör hücrelerin veya NPC'lerin türetilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, in vivo hücre tanımlama ve izleme için NPC'leri viral vektör teknolojisi ile genetik olarak etiketlemektir.

Daha sonra çoğalan nöroküreler, tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır, istenen yoğunlukta yeniden süspanse edilir ve hastalığın zirvesinde EAE farelerinin kuyruk damarına enjekte edilir. Sonuç olarak, enjekte edilen kök hücrelerin sağkalım dağılımını ve entegrasyonunu belirlemek ve karakterize etmek için postmortem organ ve doku patolojisi ve immünohistokimya yapılır. Bu tekniğin temel avantajı, kök ve progenitör hücreleri iltihaplı sinir sistemine nakletmek için minimal invaziv, güvenli ve etkili bir yöntem sağlamasıdır.

Bu yöntem, sinir sisteminin enflamatuar hastalıklarının modellerinde sistemik olarak enjekte edilen kök hücrelerin güvenliği ve etkinliği ile ilgili üç temel soruyu yanıtlamaya yardımcı olur. Bu yöntemin görsel gösterimi, özellikle genç bilim adamları için yararlıdır, çünkü beyin kök hücre izolasyonundan multipl skleroz için bir fare modelinde sistemik enjeksiyona hazırlanmaya kadar kritik deneysel adımların anlaşılmasına yardımcı olur, İlk adım, diseksiyon için gerekli tüm çözeltileri bir araya getirmektir. Uygun steril teknik kullanarak.

Yeni izole edilmiş bir beyni bir beyin dilimleyici matrisine yerleştirin. Optik izler hariç, beynin ön kutbundan iki milimetre uzakta ve önceki kesimin üç milimetre arkasında olmak üzere koronal bölümler oluşturmak için iki tıraş bıçağı kullanın. Beyin dilimlerini temiz bir Petri kabına yerleştirin ve subventriküler bölge dokusunu izole etmek için diseksiyon mikroskobu altında çalışın.

Dokuyu kıydıktan sonra, önceden hazırlanmış ve süzülmüş 30 mililitre sindirim çözeltisine ekleyin. Hafifçe çalkalayın ve her 15 dakikada bir sallayarak 30 dakika inkübe edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti 200 mikrolitre tam büyümede yeniden süspanse edin.

Pipetleme ile orta veya CGM. Önce bir P 1000 ve ardından bir P 200 pipeti ile. Tek hücreli bir süspansiyona ulaşıldığında, CGM ile beş mililitreye getirin ve yeni bir şişeye aktarın.

Hücreleri bir inkübatöre yerleştirin ve nörosferlerin beş ila yedi gün boyunca oluşmasına izin verin. Hazır olduğunda, süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe ve santrifüje toplayın. Süpernatanı çıkarın ve damağı 200 mikrolitre CGM'de yeniden askıya alın.

Nörosferleri bir P 200 pipet ucundan 100 ila 150 kez geçirerek mekanik olarak ayırın. CGM ile süspansiyonu bir mililitreye kadar getirin. Ardından, süspansiyonu doğru bir şekilde seyreltin.

Uygun hacmi hayati bir leke ile karıştırın ve hücre sayısını belirlemek için bir hemo sitometre doldurun. Hücreleri doğru konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve yeni bir şişeye aktarın. Nakledilen hücrelerin in vivo olarak tanımlanmasına yardımcı olmak için bu adımları her dört ila beş günde bir tekrarlayın.

NPC'ler, NPC transdüksiyonundan 72 saat sonra raportör genleri kodlayan viral vektörlerle transdüksiyona tabi tutulur. Floresan raportör genlerin ekspresyonu, immünofloresan veya akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Hazır olduğunda, GFP eksprese eden nöroküreleri santrifüjleme ile hasat edin ve süpernatanı çıkarın.

Daha sonra, 200 mikrolitre hücre agrega ayrışma çözeltisi ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Hücreleri alın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için nazikçe yeniden süspanse edin. Hava kabarcıklarından kaçınmaya özen gösterin.

Hücreleri saydıktan ve seyrelttikten sonra, hücre süspansiyonunu kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Nörosferler hazır olduğunda, daha önce CNS için bir fare modeli olarak hizmet etmek üzere hazırlanmış fareleri alın. Hasar tedavisi, hastalık ifadesinin zirve yaptığı noktada gerçekleşmelidir.

Kuyruk damarının genişlemesine izin vermek için fareleri yaklaşık 10 dakika boyunca bir ısıtma kutusuna koyarak başlayın. Hazır olduğunuzda, bir fareyi ısıtma kutusundan bir fare tutucuya aktarın. Hareketi kısıtlamak ve kuyruğu izole etmek için tutucuyu kapatın.

Kuyruktaki enjeksiyon alanını uygun bir topikal solüsyonla sterilize edin. Bir mililitrelik insülin şırıngasını 150 mikrolitre hücre süspansiyonu ile doldurun ve tüm kabarcıkları çıkardığınızdan emin olun. Damarı kuyruğun sırt yüzeyinde lokalize edin ve iğneyi kuyruğun orta alt kısmında damara paralel olarak konumlandırın.

Burada damar cildin yüzeyine daha yakındır. Böylece prosedürü kolaylaştırır. İğneyi yavaşça damarın içine sokun ve birkaç mikrolitre kan çekerek doğru pozisyonunu sağlayın.

Daha sonra solüsyonu yavaşça kuyruk damarına enjekte edin Enjeksiyondan sonra iğneyi çıkarın ve kanamayı yavaşlatmak için birkaç saniye basınç uygulayın. Fareyi yeni bir kafese yerleştirin ve iyileşene kadar izleyin. Önceden belirlenmiş deneysel zaman noktalarında tüm fareler için aynı prosedürü tekrarlayın.

Tedavi edilen ve kontrol edilen hayvanlardan örnekler toplanır ve nörosfer olarak çoğalırken NPC'lerin CNS'ye ve diğer dokulara sızmasını ve entegrasyonunu belirlemek için analiz edilir, NPC'ler fosfo, hisone, H gibi mitotik aktivite belirteçlerini ifade eder, yeşil ile gösterilir ve uygun farklılaşma koşulları altında kaplandığında kırmızı ile gösterilen yuva gibi farklılaşmamış nöral hücrelerin belirteçleri, NPC'ler, astroglia markörü, GFAP, nöronal markör, mikro tübüler ilişkili protein iki gibi üç nöral soyun tipik markörlerini eksprese eder ve oligo dyl glial markörler O four ve miyelin bazik protein çekirdekleri, transplantasyondan sonra terapötik olarak etkili olacak dpi farklılaşmamış MPC'ler, CD 44 ve çok geç antijen dördünün alfa dört alt birimini içeren hücre yüzeyi adezyon moleküllerini eksprese etmelidir. Bu örnekler, transdüksiyonlu NPC'lerin hem proliferatif nöroküreler olarak hem de büyüme faktörü çekilmesi üzerine in vitro farklılaşırken GFP'yi eksprese ettiğini göstermektedir. EAE farelerine sistemik olarak enjekte edilen sinjeneik NPC'ler, transplantasyondan 45 gün sonrasına kadar hem beyinde hem de omurilikte oklarla gösterilen CNS hasarının perivasküler bölgelerinde hemen hemen bulunur.

Bu prosedürün önemli bir adımı hücre ayrışmasıdır. Aslında, tek hücreli süspansiyonun hazırlanması, geliştikten sonra damar tıkanıklığına yol açabilecek klemplerden veya agregalardan kaçınmak için esastır. Bu teknik, periyodik olmayan kök hücrelerin küçük laboratuvar hayvanlarının beynine verimli bir şekilde verilmesi için minimal invaziv protokolleri araştıran rejeneratif tıp araştırmacılarının ve yakın perspektifte enflamatuar nörolojik hastalıklardan etkilenen insanların yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, beyin hastalıkları olan laboratuvar hayvanlarında dokuya özgü duruşların izolasyonu, hazırlanması ve sistemik enjeksiyonu ile ilgili sorun giderme adımlarını net bir şekilde anlayacağınızı umuyoruz.