Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için
January 16th, 2015
Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.
Bu prosedürün genel amacı, eksozomların idrardan izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunan modifiye edilmiş bir eksozom çökeltme yöntemi tasarlamaktır. Bu, önce idrar örneğinden büyük ölü hücrelerin ve hücre kalıntılarının santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir ve idrar eksozomlarını içeren snat yeni bir tüpe aktarılır. İkinci adımda, pelet, TAM at düşme proteinini uzaklaştırmak için DTT içeren izolasyon çözeltisi içinde çözülür.
Daha sonra daha fazla santrifüjlemeden sonra, TP içermeyen süpernatant, ertesi gün eksozomları çökeltmek için gece boyunca ekzo hızlı TC reaktifi ile inkübe edilir. Exo quick TC reaktifi ile muamele edilen numuneler, eksozom peletini elde etmek için son bir kez santrifüjlenir. Sonuç olarak, ilgilenilen biyobelirteçleri tanımlamak için eksozomlar üzerinde Western blot ve gerçek zamanlı QPCR gibi aşağı akış işlemleri gerçekleştirilebilir.
Bu tekniğin ultra santrifüj, filtrasyon ve çökeltme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kol yönteminin ultra sertifikasyon adımları gerektirmemesidir, nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi kolaydır, ancak idrar toplamadan önce sonraki moleküler analizler için yüksek, nispeten saf bir eksozom verimi sağlar. 3.125 mililitre taze hazırlanmış proteaz inhibitörü kokteylini boş bir steril kaba koyun ve ardından haznede yaklaşık 10 mililitre ilk boş idrar toplayın. Numuneyi 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.
Lütfen, toplanan 24 saatlik bir idrar örneğinin, dört santigrat derecede saklanarak eksozom izolasyonu için de kullanılabileceğini unutmayın. İdrar eksozomlarından hücresel kalıntıları çıkarmak veya ayırmak için tüpleri 17.000 GS ve 37 santigrat derecede 10 dakika döndürün. Daha sonra, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti 500 mikrolitre izolasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin.
Pelet, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede mililitre başına 200 miligramlık bir nihai konsantrasyonda DTT ile inkübe edin. Numuneyi her iki dakikada bir girdaplamak. Daha sonra pelet tamamen çözüldüğünde, numuneye 500 mikrolitre izolasyon solüsyonu ekleyin ve elde edilen süspansiyonu hemen aşağı döndürün.
Süpernatanı daha önce toplanan süpernatan ile birleştirin ve yeni peleti 50 mikrolitre izolasyon solüsyonunda yeniden askıya alın. Eksozomları izole etmek için SDS sayfa analizi için, önce havuzlanmış süpernatantın 11 mililitresini 3.3 mililitre ekzo hızlı TC reaktifi ile en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından numuneyi santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı SDS sayfa analizi için yeni bir tüpe aktarın ve idrar eksozomlarını içeren pelet, D-N-A-R-N-A veya proteini çıkarmak için kullanılır veya eksi 80 santigrat derecede saklanır.
Burada iki mikrolitre numune ile 260 ve 280 nanometrede absorbansı ölçerek her ekstraksiyonun DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir NanoDrop spektrofotometresi kullanın. İşlenmemiş idrar bulunan şeritlerde batı kan analizi kullanılarak bir SDS sayfa analizinin ve biyobelirteç tespitinin modifiye edilmiş bir reprodüksiyonu gösterilmiştir ve 90 ila 100 kilodaltona karşılık gelen ilk idrar pelet proteini yasakları gözlenmiştir, bu da TAM at düşme proteininin varlığını ve çıkarılmasını gösterir. TAM at düşmesi protein bandı gözlenmedi, bu da önceki adımlarda TAM at düşme proteininin çıkarıldığını ve bunun da eksozom pelet veriminin artmasına neden olduğunu gösteriyor.
Bu deneyde, biyobelirteç analizi için çok saf bir eksozom peletini ve geliştirilmesinden sonra TAM at düşme proteini de dahil olmak üzere bol miktarda çözünür proteinin bulunmadığını gösteren düşük miktarlarda numune kullanıldığında bile biyobelirteçler Alex ve TSG 1 0 1 tespit edildi. Bu teknik, kronik böbrek hastalığı alanındaki araştırmacıların diyabetik nefropatinin erken tespiti ve teşhisi için idrardan izole eksozomları kullanmalarının önünü açmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu el yazması, insan idrarından eksozomları izole etmek için modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanan bir protokolü açıklar. Yöntem, eksozom izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Ekzosom Araştırması
Arka Plan
- Ekzosomlar, hücreler arası iletişimde rol oynayan küçük hücre dışı veziküllerdir.
- İdrarından eksozomların izole edilmesi, çeşitli biyolojik süreçler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Mevcut yöntemler zaman alıcı ve daha az verimli olabilir.
- Modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği, eksozom geri kazanımını artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- İdrarından eksozom izolasyonu için hızlı bir yöntem geliştirmek.
- Ekzosom ekstraksiyonunun ölçeklenebilirliğini ve etkinliğini artırmak.
- Biyobelirteç tanımlama gibi alt akış uygulamalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İdrar örneklerinden büyük hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için santrifüjasyon.
- Peleti DTT içeren izole çözeltisinde çözmek.
- Süpernatantı ekso quick TC reaktifi ile gece boyunca inkübe etmek.
- Ekzosom peletini elde etmek için son santrifüjasyon.
Ana Sonuçlar
- Modifiye edilmiş yöntem, idrarından eksozomları başarıyla izole eder.
- Ekzosomlar, Western blot ve qPCR gibi alt akış analizlerinde kullanılabilir.
- Kontaminantların verimli bir şekilde çıkarılması, izole edilen eksozomların saflığını artırır.
- Protokol, daha büyük numune boyutları için ölçeklenebilir.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş çökeltme tekniği, eksozom izolasyonu için uygun bir yöntemdir.
- Bu yaklaşım, çeşitli biyolojik çalışmalarda eksozom araştırmasını hızlandırabilir.
- Gelecek çalışmaları, izole edilen eksozomların ek uygulamalarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating urinary exosomes enables non-invasive biomarker discovery for kidney disease, supporting early detection and mechanistic de-risking in renal therapeutic development. The modified precipitation method offers a scalable, high-yield alternative to ultracentrifugation, improving reproducibility and throughput for target validation workflows. This approach enhances predictive confidence in biomarker identification by reducing contamination and increasing exosome purity for downstream molecular profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating exosomes that reflect cell-type-specific cargo from nephron segments.
- Operational Value: Provides a quick, scalable method for isolating exosomes without ultracentrifugation, reducing technical variability.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker detection by yielding high-purity exosome pellets enriched in miRNA and mRNA for profiling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated exosome samples for downstream assays such as Western blot and qPCR to detect disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation through a precipitation-based workflow compatible with high-throughput sample processing.
- Assay Readiness: Generates consistent exosome yields suitable for RNA extraction and protein analysis, supporting reproducible biomarker screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from biomarker discovery in urine to preclinical validation by providing disease-relevant exosome cargo.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of altered exosome content under renal dysfunction, clarifying pathophysiological pathways.
- Predictive Confidence: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking exosome biomarkers to early signs of diabetic nephropathy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling non-invasive biomarker isolation that informs target selection and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating exosomes that reflect cell-origin-specific cargo from urinary tract cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exosome outputs suitable for biomarker assay development and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of exosome-associated RNA and protein levels via qPCR and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects urinary exosome biomarkers to preclinical models of kidney disease through disease-relevant cargo detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized isolation platform applicable across multiple urine sample types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by reducing mechanistic ambiguity through pure exosome isolation for biomarker profiling.
- Operational Value: Improves standardization and scalability by eliminating ultracentrifugation steps and simplifying workflow.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing confidence in early biomarker detection for kidney disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal therapeutic candidates based on robust exosome biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in exosome biology and molecular techniques such as RNA extraction and qPCR.
- Needs access to centrifugation equipment, ExoQuick TC reagent, and spectrophotometric tools for RNA/DNA quantification.
- Demands standardization across teams to ensure consistent incubation times, temperatures, and reagent handling.
- Requires adaptation considerations when applying the method to different urine collection protocols or storage conditions.
- Practical limitations include the need for overnight incubation and careful handling to avoid exosome loss during transfers.
