Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için
16 Ocak 2015
Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.
Bu prosedürün genel amacı, eksozomların idrardan izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunan modifiye edilmiş bir eksozom çökeltme yöntemi tasarlamaktır. Bu, önce idrar örneğinden büyük ölü hücrelerin ve hücre kalıntılarının santrifüjleme yoluyla uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir ve idrar eksozomlarını içeren snat yeni bir tüpe aktarılır. İkinci adımda, pelet, TAM at düşme proteinini uzaklaştırmak için DTT içeren izolasyon çözeltisi içinde çözülür.
Daha sonra daha fazla santrifüjlemeden sonra, TP içermeyen süpernatant, ertesi gün eksozomları çökeltmek için gece boyunca ekzo hızlı TC reaktifi ile inkübe edilir. Exo quick TC reaktifi ile muamele edilen numuneler, eksozom peletini elde etmek için son bir kez santrifüjlenir. Sonuç olarak, ilgilenilen biyobelirteçleri tanımlamak için eksozomlar üzerinde Western blot ve gerçek zamanlı QPCR gibi aşağı akış işlemleri gerçekleştirilebilir.
Bu tekniğin ultra santrifüj, filtrasyon ve çökeltme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kol yönteminin ultra sertifikasyon adımları gerektirmemesidir, nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi kolaydır, ancak idrar toplamadan önce sonraki moleküler analizler için yüksek, nispeten saf bir eksozom verimi sağlar. 3.125 mililitre taze hazırlanmış proteaz inhibitörü kokteylini boş bir steril kaba koyun ve ardından haznede yaklaşık 10 mililitre ilk boş idrar toplayın. Numuneyi 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.
Lütfen, toplanan 24 saatlik bir idrar örneğinin, dört santigrat derecede saklanarak eksozom izolasyonu için de kullanılabileceğini unutmayın. İdrar eksozomlarından hücresel kalıntıları çıkarmak veya ayırmak için tüpleri 17.000 GS ve 37 santigrat derecede 10 dakika döndürün. Daha sonra, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti 500 mikrolitre izolasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin.
Pelet, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede mililitre başına 200 miligramlık bir nihai konsantrasyonda DTT ile inkübe edin. Numuneyi her iki dakikada bir girdaplamak. Daha sonra pelet tamamen çözüldüğünde, numuneye 500 mikrolitre izolasyon solüsyonu ekleyin ve elde edilen süspansiyonu hemen aşağı döndürün.
Süpernatanı daha önce toplanan süpernatan ile birleştirin ve yeni peleti 50 mikrolitre izolasyon solüsyonunda yeniden askıya alın. Eksozomları izole etmek için SDS sayfa analizi için, önce havuzlanmış süpernatantın 11 mililitresini 3.3 mililitre ekzo hızlı TC reaktifi ile en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından numuneyi santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı SDS sayfa analizi için yeni bir tüpe aktarın ve idrar eksozomlarını içeren pelet, D-N-A-R-N-A veya proteini çıkarmak için kullanılır veya eksi 80 santigrat derecede saklanır.
Burada iki mikrolitre numune ile 260 ve 280 nanometrede absorbansı ölçerek her ekstraksiyonun DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir NanoDrop spektrofotometresi kullanın. İşlenmemiş idrar bulunan şeritlerde batı kan analizi kullanılarak bir SDS sayfa analizinin ve biyobelirteç tespitinin modifiye edilmiş bir reprodüksiyonu gösterilmiştir ve 90 ila 100 kilodaltona karşılık gelen ilk idrar pelet proteini yasakları gözlenmiştir, bu da TAM at düşme proteininin varlığını ve çıkarılmasını gösterir. TAM at düşmesi protein bandı gözlenmedi, bu da önceki adımlarda TAM at düşme proteininin çıkarıldığını ve bunun da eksozom pelet veriminin artmasına neden olduğunu gösteriyor.
Bu deneyde, biyobelirteç analizi için çok saf bir eksozom peletini ve geliştirilmesinden sonra TAM at düşme proteini de dahil olmak üzere bol miktarda çözünür proteinin bulunmadığını gösteren düşük miktarlarda numune kullanıldığında bile biyobelirteçler Alex ve TSG 1 0 1 tespit edildi. Bu teknik, kronik böbrek hastalığı alanındaki araştırmacıların diyabetik nefropatinin erken tespiti ve teşhisi için idrardan izole eksozomları kullanmalarının önünü açmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, modifiye edilmiş bir çöktürme tekniği kullanarak insan idrarından eksozomların izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Yöntem, eksozom izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Ekzozom Araştırmaları
Arka Plan
- Ekzozomlar, hücreler arası iletişime dahil olan küçük hücre dışı veziküllerdir.
- İdrardan ekzozomların izole edilmesi, çeşitli biyolojik süreçler hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Mevcut yöntemler zaman alıcı ve daha az verimli olabilir.
- Modifiye edilmiş bir çöktürme tekniği, ekzozom geri kazanımını artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- İdrardan ekzosom izolasyonu için hızlı bir yöntem geliştirmek.
- Ekzosom ekstraksiyonunun ölçeklenebilirliğini ve etkinliğini artırmak.
- Biyobelirteç tanımlama gibi downstream uygulamaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İdrar örneklerinden büyük hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için santrifüjleme.
- Pelletin DTT içeren izolasyon çözeltisinde çözülmesi.
- Süpernatantın exo quick TC reaktifi ile gece boyunca inkübasyonu.
- Ekzosom pelletini elde etmek için son santrifüjleme.
Ana Sonuçlar
- Modifiye edilmiş yöntem, idrardan eksozomları başarıyla izole eder.
- Eksozomlar, Western blot ve qPCR gibi alt analizler için kullanılabilir.
- Kontaminanların etkili bir şekilde uzaklaştırılması, izole edilen eksozomların saflığını artırır.
- Protokol, daha büyük örnek boyutları için ölçeklendirilebilir.
Sonuçlar
- Modifiye çöktürme tekniği, ekzozom izolasyonu için uygulanabilir bir yöntemdir.
- Bu yaklaşım, çeşitli biyolojik çalışmalarda ekzozom araştırmalarını kolaylaştırabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, izole edilen ekzozomların ek uygulamalarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Üriner eksozomların izole edilmesi, böbrek hastalıkları için non-invaziv biyobelirteç keşfini mümkün kılarak renal terapötik geliştirmede erken teşhisi ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Modifiye çöktürme yöntemi, ultrasantrifüjasyona karşı ölçeklenebilir ve yüksek verimli bir alternatif sunarak hedef doğrulama iş akışları için tekrarlanabilirliği ve işlem hacmini artırır. Bu yaklaşım, kontaminasyonu azaltarak ve sonraki moleküler profilleme işlemleri için eksozom saflığını artırarak biyobelirteç tanımlamadaki öngörüsel güveni geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nefron segmentlerinden hücre tipine özgü kargoyu yansıtan eksozomların izole edilmesiyle terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Ultrasantrifüjleme gerektirmeden eksozomları izole etmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem sunarak teknik değişkenliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Profilleme için miRNA ve mRNA bakımından zenginleştirilmiş, yüksek saflıkta eksozom peletleri elde ederek biyobelirteç tespitindeki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili biyobelirteçlerin saptanması için Western blot ve qPCR gibi sonraki analizlara yönelik valide edilmiş ekzozom örnekleri hazırlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek kapasiteli örnek işlemeyle uyumlu, çöktürme tabanlı bir iş akışı aracılığıyla ekzozom izolasyonunu standartlaştırır.
- Analize Hazırlık: RNA ekstraksiyonu ve protein analizi için uygun, tutarlı ekzozom verimleri sağlayarak tekrarlanabilir biyobelirteç taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalığa özgü ekzosom kargosu sağlayarak, idrardaki biyobelirteç keşfinden preklinik doğrulamaya geçişi destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Renal disfonksiyon altında değişmiş ekzosom içeriğinin tespit edilmesini sağlayarak patofizyolojik yolakları netleştirir.
- Öngörü Güveni: Ekzosom biyobelirteçlerini diyabetik nefropatinin erken belirtileriyle ilişkilendirerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, hedef seçimini ve preklinik sürekliliği bilgilendiren non-invaziv biyobelirteç izolasyonuna olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Üriner sistem hücrelerinden hücre kaynağına özgü kargoları yansıtan eksozomların izole edilerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Biyobelirteç analiz geliştirme ve bileşik taramasına uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif eksozom çıktıları sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizleri için qPCR ve Western blot yoluyla eksozomla ilişkili RNA ve protein seviyelerinin ölçülmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili kargo tespiti aracılığıyla, üriner eksozom biyobelirteçlerini böbrek hastalığının preklinik modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla idrar örneği türü ve araştırma programı genelinde uygulanabilir, ölçeklenebilir ve standardize edilmiş bir izolasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Biyobelirteç profilleme için saf eksozom izolasyonu aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamayı geliştirir.
- Operasyonel Değer: Ultrasantrifüjasyon basamaklarını ortadan kaldırarak ve iş akışını basitleştirerek standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Böbrek hastalığının erken biyobelirteç tespitinde güveni artırarak daha iyi devam/durdur kararlarını destekler.
- Portföy Etkisi: Güçlü eksozom biyobelirteç verilerine dayanarak renal terapötik adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Ekzozom biyolojisi ile RNA ekstraksiyonu ve qPCR gibi moleküler tekniklerde uzmanlık gerektirir.
- Santrifüj ekipmanına, ExoQuick TC reaktifine ve RNA/DNA kantifikasyonu için spektrofotometrik araçlara erişim gereklidir.
- Tutarlı inkübasyon süreleri, sıcaklıklar ve reaktif kullanımı sağlamak için ekipler arasında standardizasyon gerektirir.
- Yöntemin farklı idrar toplama protokollerine veya saklama koşullarına uygulanmasında adaptasyon değerlendirmeleri gereklidir.
- Pratik sınırlamalar arasında gece boyu inkübasyon ihtiyacı ve transferler sırasında ekzozom kaybını önlemek için dikkatli taşıma yer alır.
