Name: Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Öğrenin, idrardan eksozom izolasyonu için hızlı ve ölçeklenebilir modifiye bir çöktürme yöntemi. Bu teknik, santrifüjasyon ve ExoQuick TC reagent kullanarak yüksek saflıkta eksozom elde eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın desteği için Roney Aile Vakfı'na minnettarız. Dr. M. Lucrecia Alvarez'in bu çalışmada açıklanan deneylerin planlanması ve yürütülmesine yaptığı katkıyı kabul ediyoruz.

Not:. Modifiye çökeltme yöntemi kullanılarak idrar eksozomlann izole söz konusu olan adımlar, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir, ilk adım santrifüj ile büyük ölü hücrelerin çıkarılması ve hücre artıkları içerir. Her bir sonraki aşamada toplanan kültür bakiyesinden elde edilen nihai pelet, protein, RNA ve DNA daha fazla ekstre için ayırma çözeltisi içinde eritilir eksozom tekabül eder. İdrar 1. Koleksiyonu <ol><li> Idrar toplama öncesinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlamak ve boş steril hazne Bu kokteyl 3.125 ilave edin. proteaz inhibitörü kokteyli içeren Tüp daha sonra idrar toplama gönüllülere dağıtılabilir. Not: proteaz inhibitörü ilave nedeni idrar numunesi içinde bulunan proteini bozulmasını en aza indirmektir. Biz özellikle bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanılmasına rağmenSigma, diğer ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri ikame edilebilir. </li><li> İlk boşluk idrar yaklaşık 10 ml toplayın. Toplandıktan hemen sonra depolama veya soğutma olmadan idrar işleyin. Modifiye yağış yöntemini kullanarak kopya üriner eksozomlar yalıtmak; üriner eksozom partiküllerinin ölçülmesi için ise çiftleri biri, DNA, toplam RNA ve protein ekstre içindir. NOT: 24 saat idrar numunesi 4 ° C&#39;de saklayarak eksozom izolasyonu için toplanabilir. </li></ol> Hücre Moloz ve Tamm-Horsfall Protein 2. Kaldırma (THP) <ol><li> 15 ml santrifüj tüplerine idrar örnekleri aktarın. Santrifüj 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de idrar 10 mi hücreleri ve hücre kalıntısını (Şekil 1) ortadan kaldırmak için. </li><li> Bir pipet kullanarak, daha fazla işlem için yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Izolasyon çözeltisi 500 ul pelletini (250 mM sakaroz, 10 mM Trietilamininnihai konsantrasyon 200 mg / ml), 37 ° C &#39;de DL-ditiyotreitol (DTT ile 10 dakika inkübasyon ile takip anolamine, pH 7.6). Not: DTT verim azalmasına yol açan, eksozomlar yakalar THP, indirgeme eklenir. Süpernatant transferi sırasında rahatsız pelet bırakmak özen, ve yüzer pelet açık olduğunu doğrulayın. </li><li> Vortex pelet örnekleri pelet kadar her 2 dk tamamen çözülür. Ardından çözünmüş pelet izolasyon çözeltisi 500 ul ekleyin. </li><li> 37 ° C, 10 dakika için 17,000 x g&#39;de izole pelet çözeltisi santrifüj ilave edildikten sonra. Pipetleyin süpernatant ve önceki toplanan süpernatant ile birleştirmek. </li><li> SDS-PAGE analizi için ayırma çözeltisi 50 ul pelletini. Not: PBS veya TBS pelletini yerine yalıtım çözeltisi kullanılabilir. </li></ol> Exosome Peleti 3. İzolasyonu <ol><li> Toplanan supern 11 mlatant, ExoQuick-TC ayıracı 3.3 ml ilave edilir ve en az 12 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. Not: ExoQuick-TC reaktif süpernatant hacmine oranı arttırmak veya exosomal verim azaltmak için ayarlanabilir. Bu ilave reaktif az miktarlar eksozom küçük anomerin görülmektedir. </li><li> Inkübasyondan sonra, santrifüj 25 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de örnek / ExoQuick-TC karışımı. </li><li> SDS-PAGE analizi için temiz bir tüpe süpernatant aktarın. </li><li> eksozom pelet, DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu ve CD9 ELISA 11 kullanılarak eksozom partiküllerinin ölçümü için, -80 ° C&#39;de saklanabilir. Not: eksozom pelet sınırlı dondurma ve eritme ile 1 yıl boyunca, -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 4. Biyomarker Algılama ve Exosome Peleti Analizi <ol><li> Alt baş analizler için, DNA / RNA / protein izolasyon kiti ve bir RNA izolasyon Ki ile eksozom topağından DNA, RNA ve protein özüüreticinin talimatlarına uygun olarak T. Örnek 2 ul 260 absorbans ve 280nm ölçerek Nanodrop spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonlarını belirleyin. </li><li> Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR (qPCR), TaqMan microRNA deneyleri kullanılarak veya miRNA-spesifik primerler (bizim durumumuzda, biz insan miR-192- ve miR-1207-5p özel deneyleri kullanılır) gerçekleştirin. </li><li> SDS-PAGE analizi için, tek boyutlu elektroforez ile% 4-12 Bis-Tris jel ve ayrı protein numuneleri kullanmaktadır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, gümüş boya kitini kullanarak jeller görselleştirmek. </li><li> Üretici tarafından sağlanan talimatlara uygun olarak PVDF membranlar kullanılarak Western blot analizi. Western blot algılama tümör bir gen 101 protein veya TSG101 apoptoz bağlantılı gen-2 etkileşimli protein X veya Alix ve fare monoklonal antikor tavşan poliklonal antikor kullanın. Açık erişim NIH ImageJ yazılımı tarafından bantların yoğunluğu ölçmek (http://rsbweb.nih.gov/ij/) veyabenzer bir program. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir CD9 ELISA kiti kullanılarak elde edilen idrar eksozom parçacıkların sayısını ölçmek. </li></ol>

<ol><li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+within+urinary+exosomes%2Fmicrovesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
<li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li>
<li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery%3A+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li>
<li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li>
<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li>
<li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

Bu yazı için yayın ücretleri SBI Biosciences tarafından ödendi.

Idrardan eksozom çökelmesini içeren çok yöntem Tamm-Horsfall proteini (THP) tarafından oluşturulan polimerik ağ kaldırılmasını ele alınmamıştır. Bu protein, bu varsayımsal trans ilk düşük hızlı santrifüj içinde eksozomlar idrar, büyük miktarlarda mevcuttur. Modifiye yönteminde, sonuç eksozom çökeltme öncesinde DTT kullanılarak THP azaltmıştır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, THP, daha yüksek bir miktar, proteine ​​çıkarılmasını gösteren, son yüzer tabakanın ve eksozom pelet içinde herhangi bir THP ile...

İdrar eksozomlar miRNA&#39;ların 1 zenginleştirilmiş görünmektedir idrar drenaj sistemlerinin astar glomerüler Podositler, renal tübül hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere idrar alanı normal ve patolojik koşullar altında tüm hücre tipleri türetilen multiveziküler organları (MVB), 100 nm küçük bir iç veziküllerdir -2. Pek çok araştırmacı, sağlıklı bireylerin idrar aynı zamanda böbrek ve / veya sistematik hastalık 3-5 olan izole eksozom belirgin proteinleri tespit ettik. Eksozomlar, ultra santrifüjleme, 8-9 ya da 10-11 çökeltme ile nanomembrane filtrenin birlikte, bu ya da sukroz 6-7 olmaksızın iki aşamalı bir diferansiyel ultra-santrifüj gibi farklı yöntemler kullanılarak izole edilebilir. Biz son zamanlarda idrar eksozomlar izole ve miRNA ve protein biyomarkerları 11 algılamak için, basit, hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir yöntem geliştirdik. Biyomarkerler farklı biyolojik sıvıların çeşitli tespit edilebilir olsa da, urine nispeten invazif olmayan bir şekilde büyük miktarlarda elde edilebilir, çünkü, böbrek ve idrar yolu hastalıkları olan hastalar için uygun bir seçimdir. Idrar eksozomlar 6-11 izole etmek birkaç yöntem olmasına rağmen, en yaygın kullanılan prosedür% 30 sukroz yastık ile diferansiyel Ultrasantrifügasyon bağlıdır. Bu yöntem etkili değildir ve bu yönteme izole elde edilen eksozom kalitesi yüksek olsa da, teknik kendisi uzman personel gerektirir ve zaman alıcı birçok adımları ultrasantrifügasyon, zorunlu kılmaktadır. Bu, süzme ve çökeltme gibi başka yöntemler, özel bir özelliği, çökeltme reaktifinin kullanan bir de dahil olmak üzere, eksozom izolasyonu için geliştirilmiştir (örneğin, ExoQuick-TC: Sistem Biosciences, Mountain View, CA). Bu reaktif kullanılarak yağış hızlı ve nispeten kolay olmasına rağmen, izole eksozomlann saflık Ultrasantrifügasyon meth kıyasla düşüktürod. Kısa bir süre önce laboratuarımızda 11 geliştirilen ExoQuick-TC ile çökeltme yönteminin bir modifikasyonu dahil olmak üzere idrar eksozomlann izole edilmesi için altı yöntemi olarak karşılaştırılmıştır. Biz bu değiştirilmiş çöktürme yöntemi protein, miRNA ve mRNA&#39;larının ve kendisi daha hızlı ve daha Ultrasantrifügasyon uygulamak kolay oldu prosedürün daha yüksek miktarlarda vermiştir bulundu. Burada, biz kademeli bir şekilde bizim modifiye yağış yöntemi deneysel protokol açıklar ve eksozom izolasyonu diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu tekniğin avantajları ve dezavantajları bir tartışma vardır. değiştirilmiş çöktürme yöntemi exosomal proteinleri ile ilişkili ve idrardan eksozom veriminin azalmasına yol açtığı bilinmektedir Tamm-Horsfall proteini ile uzaklaştırılarak elde edilmiş eksozom partiküllerinin ilk çökeltme, içerir. Biz, bu değişimler idrardan exosomal hazırlama verim ve saflıkta arttırdığı bulunmuştur.

<table><tbody><tr><td>Corning 15 ml Santrifüj Tüpü</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td>, <td>200 mg / ml</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE SDS-PAGE sistemi (% 4-12 Bis-Tris Jel 1.0 mm, 10 kuyulu</td><td></td><td>SDS-PAGE analizi için</td>Invitrogen <td>NP0321BOX</td></tr><tr><td>ECL Advance Western lekelenme tespit kiti</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>RPN2135</td><td>Biyobelirteçlerin western blot tespiti için</td></tr><tr><td>Exoquick-TC Reaktif</td><td>Sistemi Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>Eksozom izolasyonu için</td></tr><tr><td>Eksozom CD9 ELISA Komple Kit</td><td>Sistemi Biosciences (SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>Eksozom miktar tayini için</td></tr><tr><td>DNA, RNA, Protein izolasyonu için</td> <td>AllPrep DNA/RNA/Protein mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>80004</td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Temizleme kiti</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spektrofotometre</td> Protein <td>Miktar Tayini İçin</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td></tr><tr><td>ProteoSilver Şerit Leke Kiti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>SDS-PAGE jellerini</td></tr> <tr><td>boyamak içinXcell SureLock Mini-Cell Elektroforez Sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>SDS-PAGE jellerini çalıştırmak için</td></tr><tr><td>TaqMan mikroRNA testleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>RT-PCR testleri için</td></tr><tr><td>qBasePlus v1.5 yazılımı</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>RT-PCR test verilerinin analizi için</td></tr><tr>ALIX <td>Millipore'a</td><td></td><td>karşı tavşan poliklonal antikoru</td><td>Biyobelirteçlerin</td></tr> <tr><td>batı lekesi tespiti içinBiyobelirteçlerin</td><td>western blot tespiti için</td> TSG101 <td>Abcam'a</td><td></td> fare monoklonal antikoru</tr></tbody></table>

bir modifiye yağış yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

İdrar ve plazmada böbrek hastalıklarının erken teşhisini sağlayan biyobelirteçlerin tanımlanması birkaç yıldır aktif bir ilgi alanı olmuştur. Boyutları 40-100 nm arasında değişen idrar eksozom vezikülleri, normal koşullar altında tüm nefron segmentlerinden hücreler tarafından idrara salınır ve orijinli hücre tipini temsil eden protein, mRNA ve mikroRNA içerebilir. Böbrek fonksiyon bozukluğu veya yaralanma koşulları altında, eksozomlar, hastalık için biyobelirteç görevi görebilecek bu bileşenlerin değiştirilmiş oranlarını içerebilir. Şu anda üriner eksozomların izolasyonu için çeşitli yöntemler mevcuttur ve daha önce bu yaklaşımların her birinin deneysel bir karşılaştırmasını gerçekleştirdik, bunlardan üçü ultrasantrifüjlemeye dayalı, biri nanomembran ultrafiltrasyon yoğunlaştırıcısı kullanarak, biri ticari bir çökeltme reaktifi kullanarak ve biri laboratuvarımızda geliştirdiğimiz ExoQuick reaktifi kullanarak çökeltme tekniğinin bir modifikasyonunu kullanarak. Modifiye çökeltme yönteminin en yüksek eksozom parçacıkları, miRNA ve mRNA verimini ürettiğini bulduk ve bu yaklaşımı sonraki RNA profillemesi için eksozomların izolasyonu için uygun hale getirdik. Modifiye eksozom çökeltme yönteminin, eksozomların idrardan izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunduğu sonucuna vardık. Bu raporda, insan idrarından eksozomları izole etmek için ExoQuick reaktifi kullanarak modifiye çökeltme tekniğimizi açıklıyoruz.

İdrar eksozomlar böbrek epitel hücrelerinden salgılanan protein MiRNA ve mRNA biyolojik işaretleri taşırlar. Bu eksozomlann izolasyon ve algılama gibi diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıklarının erken teşhisi için yararlı bir tanısal araç sağlayabilir. Insan deneklerden alınan idrar örneklerinde eksozomlann izole edilmesi için bir kaç yöntem vardır. Biz daha önce idrar eksozom izolasyon altı yöntemleri karşılaştırıldığında ve protein, mRNA ve miRNA düzeyleri 11 Elde incelenmiştir. Burada amacımız detaylı ...

Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Bu prosedürün genel amacı, idrardan ekzosomların izolasyonu için hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir alternatif sunan modifiye bir ekzosom çöktürme yöntemi tasarlamaktır. Bu, öncelikle santrifüjasyon yoluyla idrar örneğindeki büyük ölü hücrelerin ve hücre döküntülerinin uzaklaştırılması ve üriner ekzosomları içeren süpernatantın yeni bir tüpe aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, TAM horse fall proteinini uzaklaştırmak için pellet, DTT içeren izolasyon solüsyonunda çözülür.Ardından, daha fazla santrifüjleme işleminden sonra, TP içermeyen süpernatan, eksozomları ertesi gün çöktürmek için exo quick TC reaktifi ile gece boyunca inkübe edilir. Exo quick TC reaktifi ile işlem görmüş örnekler, eksozom peletini elde etmek için son bir kez daha santrifüjlenir. Son aşamada, ilgilenilen biyobelirteçleri tanımlamak için eksozomlar üzerinde Western blot ve gerçek zamanlı QPCR gibi alt süreçlar gerçekleştirilebilir.Bu tekniğin, ultra santrifüj filtrasyonu ve çöktürme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, herhangi bir ultra santrifüj adımına ihtiyaç duymaması, uygulanmasının kolay ve nispeten hızlı olması ve aynı zamanda sonraki molekürel analizler için yüksek miktarda, nispeten saf ekzosom verimi sağlamasıdır. İdrar toplama işleminden önce, boş steril bir kaba 3,125 ml taze hazırlanmış proteaz inhibitör kokteyli ekleyin ve ardından kaba yaklaşık 10 ml ilk boşaltım idrarı toplayın. Numuneyi 15 ml'lik konik tüplere aktarın.Lütfen unutmayın, 4 °C'de saklanmak koşuluyla toplanmış 24 saatlik idrar örneği de ekzozom izolasyonu için kullanılabilir. Hücresel kalıntıları idrar ekzozomlarından uzaklaştırmak veya ayırmak için tüpleri 17.000 g'de ve 37 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, peletin bozulmamasına dikkat ederek süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve peleti 500 µL izolasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.Pelleti, 200 mg/mL nihai konsantrasyondaki DTT ile 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Örneği her iki dakikada bir vortexleyin. Pellet tamamen çözündüğünde, örneğe 500 µL izolasyon solüsyonu ekleyin ve oluşan süspansiyonu hemen santrifüjleyin.Süpernatantı önceden toplanan süpernatant ile birleştirin ve yeni peleti 50 µL izolasyon solüsyonunda yeniden süspande edin. Ekzozomları izole ederek SDS-PAGE analizi yapmak için, birleştirilmiş süpernatantın 11 mL'sini 3,3 mL ExoQuick TC reaktifi ile 4 °C'de en az 12 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonu takiben örneği santrifüjleyin, ardından süpernatantı SDS-PAGE analizi için yeni bir tüpe aktarın; idrar ekzozomlarını içeren pelet ise DNA, RNA veya protein ekstraksiyonu için kullanılır veya -80 °C'de saklanır.Burada, iki mikrolitre numunenin 260 ve 280 nanometredeki absorbansını ölçerek her bir ekstraksiyonun DNA ve RNA konsantrasyonlarını belirlemek için NanoDrop spektrofotometresi kullanın. İşlem görmemiş idrar ile ilk idrar pelletinin bulunduğu şeritlerde, modifiye edilmiş bir SDS page analizi ve western kan analizi kullanılarak yapılan biyobelirteç tespitinin reprodüksiyonu gösterilmiştir; burada 90 ile 100 kilodalton arasındakilere karşılık gelen protein bantları gözlemlenmiş olup, bu durum sırasıyla final süpernatan ve eksozom pellet şeritlerinde TAM horse fall proteinin varlığını ve uzaklaştırıldığını göstermiştir. TAM horse fall protein bandı gözlemlenmemiştir; bu da önceki adımlarda TAM horse fall proteinin uzaklaştırıldığını ve bunun sonucunda eksozom pellet veriminin arttığını göstermektedir.Bu deneyde, düşük miktarda numune kullanıldığında bile biyobelirteçler Alex ve TSG 1 0 1 tespit edilmiştir; bu durum, biyobelirteç analizi için oldukça saf bir eksozom peletinin elde edildiğini ve TAM at düşme proteini dahil olmak üzere bol miktarda çözünür proteinin bulunmadığını göstermektedir. Geliştirilen bu teknik, kronik böbrek hastalığı alanındaki araştırmacıların, diyabetik nefropatinin erken tespiti ve teşhisi için idrardan izole edilen eksozomları kullanmalarının önünü açmıştır.

a-modified-precipitation-method-to-isolate-urinary-exosomes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Plazma izole eksozomlar, erken teşhis ve hastalığın ilerlemesi için biyobelirteçlerin tespiti ve takibi için invaziv olmayan ve tekrarlanabilir bir yol olarak kullanılabilir. Bu video, DNA ve protein ekstraksiyonları için kullanılabilecek küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarının plazma örneklerinden eksozomların ayrılması için protokolü açıklamaktadır.

Eksozom İzolasyonu: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Hastalarının Plazmasından Eksozomları Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, döteryum oksitte hazırlanan %25 (a/a) sükroz yastığı kullanılarak insan embriyonik böbrek hücre kültürlerinden hasat edilen şartlandırılmış ortamdan eksozomları izole etmek için yoğunluğa dayalı bir ultrasantrifüjleme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilmiş eksozomlar, aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Eksozom İzolasyonu: Kültürlenmiş Hücrelerin Şartlandırılmış Ortamlarından Eksozomları Ayırmak için Sükroz Yastığı Kullanan Yoğunluğa Dayalı Bir Ultrasantrifüjleme Tekniği

Bu makalede eksozomların tam kandan izolasyonu ve yarı otomatik bir alet kullanılarak nanopartikül izleme ile daha fazla analiz için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan teknoloji, sıvı süspansiyondaki partikülleri görselleştirmek ve analiz etmek için son derece hassas bir yöntem sağlar.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Burada, geçici exosomes normal myogenic atası hücrelerden türetilmiş dikim tarafından Duchenne kas distrofisi farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için bir protokol mevcut.

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.

Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu

Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Öğrenin, idrardan eksozom izolasyonu için hızlı ve ölçeklenebilir modifiye bir çöktürme yöntemi. Bu teknik, santrifüjasyon ve ExoQuick TC reagent kullanarak yüksek saflıkta eksozom elde eder.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Daha fazla video keşfet