Name: Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Öğrenin, farelerde transversus abdominis kasının diseksiyonu ve immünofloresan boyama ile nöromusküler kavşakların görüntülenmesi yöntemini. Bu protokol motor nöron hastalıklarının patolojisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (hibe numarası MOP 38040) R.K.'ye, Musküler Distrofi Derneği'nden (ABD) R.K.'ye, SMA ailelerinden R.K. ve L.M.M'a, SMA Trust'tan T.H.G.'ye ve Kas Distrofisi Kampanyası'ndan T.H.G.'ye hibelerle desteklendi. L.M.M, Kanada Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Bursu'nun alıcısıdır ve R.K. Ottawa Üniversitesi'nden Bir Üniversite Sağlık Araştırma Kürsüsü'nün alıcısıdır.

Tüm işlemler kurum tarafından belirlenen hayvan bakım standartlarına göre yapılmalıdır.
1. Karın Kasının Fareden Diseksiyonu
<ol><li>Başlamadan önce% 4 paraformaldehit (PFA) yapın. Dikkat: PFA'yı her zaman duman kaputunda tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin.</li>
	<li>Fareyi onaylanmış bir yöntemle ötenazi edin. Not: Videoda gösterilen fare aşırı dozDA CO2 ve servikal çıkık ile ötenaziye uğradı. Bu fare, CD1/C57Bl6 hibrit arka plan üzerinde 4 haftalık vahşi tip bir faredir. Bu fare, Ottawa Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde başlangıçta satın alınan farelerden yetiştirildi.</li>
	<li>Kalça seviyesinde ciltten ilk kesiyi yapın ve cildi farenin etrafından kesin.</li>
	<li>Ön ayak seviyesine ulaşana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun.</li>
	<li>Karın kasını kalça hizasına kadar kesin ve omur kolonuna ulaşana kadar kesi devam edin.</li>
	<li>Bu noktada, üst ekvuğa ulaşana kadar kas ve kaburgalardan yukarı doğru kesmeye başlayın.</li>
	<li>Diğer taraftaki omur sütununa ulaşana kadar düz bir şekilde kesin.</li>
	<li>Başladığınız noktaya ulaşana kadar aşağı doğru kesin.</li>
	<li>Diyaframı alttan serbest bırakın (TVA kasına zarar vermemeye dikkat edin) ve 0,2 mm diseksiyon pimli SYLGARD kaplı bir diseksiyon kabına fosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirin.</li>
	<li>Göğüs kafesini ve çanaktaki ilişkili kasları, yüzeysel tarafı yukarı doğru sabitleyerek kasın tamamen gerildiğine emin olun.</li>
	<li>1x PBS'yi dökün ve% 4 PFA ile değiştirin.</li>
	<li>15 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir platformda örtün ve bırakın.</li>
	<li>10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
</ol>* Bu noktada sabit kaslar sonraki diseksiyondan önce bir gece buzdolabında bırakılabilir.
2. TVA Kasının İzolasyonu
<ol><li>TVA kasının izolasyonu ile devam etmek için, bir diseksiyon mikroskobu altında, dış eğik kası son birkaç kaburga seviyesinde keserek başlayın (açıklamalı bir kılavuz için Bkz. Şekil 1).</li>
	<li>İç eğik kasın başlangıcına ulaşana kadar linea albanın yanında (aşağıdaki TVA'yı kesmemeye dikkat ederek) kesin.</li>
	<li>Daha sonra aşağıdaki TVA'nın üst kısmından aşırı rektus abdominis ve dış eğik kasları serbest bırakmak için kesin.</li>
	<li>Kan damarını ve aşırı yağları TVA kasından çıkarın.</li>
	<li>Kası üstteki son kaburgadan serbest bırakın.</li>
	<li>Kasın kenar boşluklarını kesin ve PBS içeren 24 kuyulu bir plakaya çıkarın.</li>
</ol>3. TVA Kasının İmmünofluoresan Etiketlemesi ve Mikroskopisi
Sonraki tüm adımlar için, ince uçlu bir pipet kullanarak sıvıyı çıkarın ve plakayı sallanan bir platformda bırakın. Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
<ol><li>NMJ'leri etiketlemek için 30 dakika boyunca 1:1.000 floresan etiketli bungarotoxin içeren PBS'de kuluçkaya yatırın. Bu karanlık bir odada veya folyo altında yapılabilir.</li>
	<li>PBS'de % 2 Triton X-100 kuyusu başına 300 μl ekleyerek kası dengele ve 30 dakika boyunca sallanan bir platformda bırakın.</li>
	<li>30 dakika boyunca reaktifi (%4 BSA, PBS'de %1 Triton) bloke etmek için kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Primer antikorlar içeren reaktifin bloke edilmesinde kuluçkaya yaslanın (nörofilament 1:100; sinaptik vezikül proteini 2, 1:250) bir gecede 4 °C'de.</li>
	<li>1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
	<li>PBS'de 2-4 saat boyunca 1:250 ikincil antikor içeren inkübte edin.</li>
	<li>1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
	<li>Yeterli floresan montaj ortamı ve kapak kılıfı kullanarak kasları cam slaytlara monte edin.</li>
	<li>Slaytlar en iyi standart epifluoresan mikroskopta çift bantlı geçiş filtresi kullanılarak görüntülenir.</li>
	<li>NMJ'ler en az 40X hedefiyle donatılmış bir konfokal mikroskop üzerinde z serisi projeksiyon kullanılarak en iyi şekilde görüntülenir.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+insights+from+transgenic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li>
<li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+peripheral+nerve%2C+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+%28SMARD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li>
<li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li>
<li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li>
<li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+translation+elongation+factor+%28eEF1A2%29+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li>
<li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu videoda, TVA kasının fareden diseksiyonu ve kas içindeki NMJ'lerin tüm montajlı immünofluoresan etiketlemesi için bir protokol detaylandırdık. Ayrıca bu kasın SMA'nın bir fare modelinde nöromüsküler kavşak patolojisini analiz etmek için kullanılabileceğini gösteren veriler sunuyoruz.
Bu teknikteki başarı bir dizi faktöre bağımlıdır. En yaygın sorunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir. İlk olarak: zayıf immünohistokimyasal lekeleme. Bunun bir dizi nedeni olabilir, en yaygın olanlardan biri, bu protokolde listelenenlere farklı reaktiflerin kullanılmasıdır. Bu protokolde listelenen antikorların seçimi gibi, iyi boyama sağlamak için yüksek kaliteli bir elektron mikroskopi sınıfı PFA çok önemlidir. Ek olarak, yaşlı hayvanlarda(yani3 ay >), kaliteli boyama almak daha zor olabilir. Bunun nedeni, kası çevreleyen fasyanın kalınlığının artması ve dış eğik ve tranversus abdominis arasındaki yağ birikiminin artmasıdır. İmmünoresansa geçmeden önce yağı çıkarmak önemlidir. Kalınlaşabilen kası kaplayan fasyanın bir kısmını çıkarmak da gerekebilir. Bazen kas lifine bir miktar zarar vermeden ve innervasyon düzeninde bir bozulma olmadan fasya ve yağı kastan çıkarmak zordur. Ancak bu teknik dikkatli bir şekilde yapılırsa farelerden en az 1 yaşına kadar kaliteli boyama elde edilebilir. Genç farelerde(yani3 aydan az) kas liflerinin herhangi bir alay veya ayrılmasını yapmak gerekli olmamalıdır. İkincisi: diseksiyon ve lekeleme sonrasında NMJ bulmakta zorluk. Bunun nedeni genellikle diseksiyonun son kaburganın altına uzanmamasıdır. NMJ'lerin çoğu son kaburganın hemen altında bulunur ve bu nedenle kasın bu kısmının diseksiyona dahil edilmesine dikkat edilmelidir. Üçüncüsü: EO kasının TVA kasına yapışmasını. Bu genellikle bireyler diseksiyonu iç eğik (GÇ) kas seviyesinin altına uzatmaya çalıştıklarında bir şikayettir. İO'nun da bulunduğu TVA kasının alanını analiz etmek daha zordur, çünkü hangi kasın hangisi olduğunu ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, rutin olarak TVA kasının en üstün kısmını parçalara ayırıyoruz. Bu seviyede, EO ve TVA kasları arasında yapışma yoktur ve bu nedenle bu önemli bir sorun olmamalıdır.
TVA kasının kullanılmasının önemli bir engeli, apandisitrik kaslara kıyasla, cerrahi manipülasyonlar veya maddelerin enjeksiyonu için erişilebilirliktir. Bu tür deneyler, belirli bir kastaki NMJ fizyolojisini araştırmak için çok önemli olabilir. TVA kesinlikle tibialis ön veya gastrocnemiusgibi daha yaygın olarak kullanılan kaslardan daha az kolay erişilebilir olmasına rağmen, önceki çalışmalar TVA'yı interkostal sinirlerin cerrahi yaralanması ile denervate etmenin mümkün olduğunu göstermiştir18. Son zamanlarda bu kası genel anestezi altındaki maddelerin yerel yönetimi için de kullandık (yayınlanmamış veriler). Bu deneyler ılımlı bir teknik zorluğu temsil etse de, bu çalışma bunların mümkün olduğunu ve böylece hem patolojik hem de fizyolojik manipülasyon altında NMJ'lerin analizi için bu kasın yararlılığını genişlettiklerini göstermektedir.
TVA kası, innervasyon desenlerinin tam olarak monte analizi için kullanılabilecek vücut boyunca bulunan bir dizi ince düz kastan biridir. Diğer kaslar arasında, beyin sapının yüz çekirdeğinden kaynaklanan motor nöronlar tarafından içselleştirilmiş bir grup kranial kas, levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus, diseksiyonları daha öncetanımlanmıştır 14,19. Ayrıca, EO, IO ve rectus abdominisde dahil olmak üzere TVA kasını çevreleyen kas yapısı da etiketlenebilir ve NMJ analizi için kullanılabilir. Bir fare modelinde NMJ patolojisinin kapsamlı analizi için, vücutta bulunan bir dizi kası göz önünde bulundurmak ve analizi tek bir kasla kısıtlamamak önemlidir. Bu, farklı kaslar arasındaki NMJ patolojisi seviyelerinde önemli heterojenliğin olduğu motor nöron hastalıklarının fare modellerinde örneklenmiştir20. Bu tür intermüsküler değişkenlik, motor nöron kırılganlığının mekanizmasını araştırırken son derece değerli bir araçtır ve bu nedenle analizi tek bir kasla kısıtlamak araştırmanın potansiyelini önemli ölçüde azaltabilir.

Nöromüsküler kavşaklar (NMJs), daha düşük bir motor nöron ile iskelet kas lifi arasındaki sinaptik bağlantıdır. Geleneksel olarak bir nöron (presynaptik terminal), kas lifi (post sinaptik terminal) ve terminal Schwann hücre1'denoluşan üçlü bir sinaps olarak kabul edilirler. NMJ'ler, bir dizi motor nöron hastalığında ve fare modellerinde patolojide erken ve önemli hedefler olarak görünmektedir2,3. Tipik semptomlar, motor plakasının presynaptik bir innervasyondan yoksun hale geldiği denervasyon, presynaptik terminalin şişmesi ve NMJ morfolojisinin karmaşıklığında bir azalma4-11içerir. Aksional süreçlerin kalan sinaptik terminallerden veya internodlardan yeniden yağlanmış denervated uç plakalarına kadar uzandığı terminal ve nodal filizlemeyi içeren telafi edici yanıtlar da not edilebilir12,13. Sinaptik aktivite ve NMJ morfolojisi arasındaki sıkı korelasyon nedeniyle, NMJ morfolojisinin analizinden motor nöronların fonksiyonel durumu hakkında çok fazla bilgi edinilebilir. NMJ kaybı sıklıkla nöromüsküler patolojinin ilk yönlerinden birini temsil ettiği için4,10Innervasyon seviyesinde niceleme patolojinin ilerlemesi ve terapötik bir müdahalenin potansiyel etkisi hakkında önemli bilgiler verebilir. Ayrıca, NMJ kaybı patolojik ilerlemede önemli bir adımı temsil ettiği için, bağlantıları stabilize edebilecek ve yenilenmeyi teşvik edebilecek terapötiklerin geliştirilmesi önemli fayda sağlayabilir.
NMJ morfolojisi analiz edilirken kas seçimi büyük önem taşımaktadır. Başlıca hususlardan bazıları kas lifi tipi, vücut pozisyonu ve insan koşullarına karşılaştırmalı analiz içerebilir. Ek olarak, maddelerin enjeksiyonu veya travmatik sinir hasarı gibi manipülasyonların gerekli olduğu durumlarda, deneysel erişilebilirliği de göz önünde bulundurmak önemlidir. Genel olarak, vücut boyunca konumlandırılmış bir dizi kasın bir dizi motor ünite alt tipini yansıtması tercih edilir. Bununla birlikte, genellikle, kas seçimi diseksiyon kolaylığından etkilenir. Sonuç olarak, NMJ analizi genellikle sadece gastrocnemiusgibi büyük apandisit kaslarda gerçekleştirilir. Bu tür kaslarda iyi NMJ lekeleme elde etmek için, genellikle kas liflerinin bölümleme veya mekanik bozulması gerekir. Sonuç olarak, innervasyon paterni bozulabilir ve innervasyon paternlerinin, filizlenen ve denervasyonun kapsamlı ve kaliteli bir analizi genellikle tehlikeye girer. Alternatif bir yaklaşım, kesit gerektirmeyen ve lekelenebilen ve sağlam bir şekilde monte edilebilen ince düz kasların kullanılmasıdır ve bu da kasın tüm innervasyonuna kapsamlı bir genel bakış sağlar. Bir grup kranial kas da dahil olmak üzere böyle bir analiz için kullanılabilecek bir dizi kas vardır, (levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus'u kapsar)14, torasik kaslar (örneğin. üçgen sterni) 15ve abdominal(örneğin transversus abdominis (TVA)) kasları. Bu tür kasların kullanılmasındaki en büyük engel, onları hasarsız olarak parçalamak için gereken teknik uzmanlıktır.
Bu videoda, innervasyon paterninin ve NMJ morfolojisinin kapsamlı bir analizine izin vermek için TVA kasının fareden immünofluoresan etiketlemesini parçalamak ve gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. TVA kası, karın kaslarının en derin tabakasını içeren ağırlıklı olarak yavaş bir seğirme kasıdır ve alt interkostal sinirler tarafından içselleştirilir. Önceki çalışmalar, çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin (SMA) bir dizi fare modelinde ve erken başlangıçlı motor nöron dejenerasyonu4,16'nındiğer fare modellerinde patolojiye karşı sürekli olarak oldukça savunmasız olduğunu göstermiştir. Bu nedenle TVA'nın periferik nöropatilerde NMJ analizi için yararlı bir kas olduğunu öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit Sulu Çözelti (%16)</td><td>Elektron Mikroposkopisi Bilimleri</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Açılı Yaylı Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas - ToughCut</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>yerel tedarikçiye bağlı</td><td>Kas</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td> ince <td>bilim araçları</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Sigma'dan Albümin</td><td>Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Nörofilament Primer antikor (2H3), Süpernatan</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SV2 Primer antikor (SV2), Süpernatant</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Montaj Ortamı</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Slaytları (Superfrost Plus; Beyaz)</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CD1/C57Bl6 fare</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tüm montajlı nöromüsküler kavşak analizi için enine abdominis kasının diseksiyonu

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Nöromüsküler kavşak morfolojisinin analizi, belirli bir motor nöronun fizyolojik durumu hakkında önemli bilgiler verebilir. İnce düz kasların analizi, arka uzuvdan gelenler gibi geleneksel olarak kullanılan daha kalın kaslara göre önemli bir avantaj sağlayabilir(örn. gastrocnemius). İnce kaslar, belirli bir kas için tüm innervasyon deseninin kapsamlı bir genel görünümünü sağlar, bu da seçici olarak savunmasız motor nöron havuzlarının tanımlanmasına izin verir. Bu kaslar ayrıca motor birim büyüklüğü, aksonal dallanma ve terminal/nodal filizleme gibi parametrelerin analizine izin verir. Bu tür kasların kullanılmasında yaygın bir engel, onları parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. Bu videoda, enine abdominis (TVA) kasının genç farelerden parçalanması ve aksonları ve nöromüsküler kavşakları (NMJ' ler) görselleştirmek için immünoresans gerçekleştirme protokolünü detaylandırıyoruz. Bu tekniğin TVA kasının innervasyon paternine tam bir genel bakış sağladığını ve çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin bir fare modelinde NMJ patolojisini araştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yukarıdaki protokol, NMJ analizi için TVA kasının izolasyonu ve lekelenmesine yön veriyor. Bu, kas innervasyon kalıplarının tam olarak monte analizinin yanı sıra NMJ morfolojisinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir (Şekil 2). Bu teknik, SMA4,17(Şekil 3)gibi motor nöron hastalığının fare modellerinde NMJ patolojisini ortaya çıkarmak için başarıyla uygulanabilir. SMA'nın fare modellerinde patolojide önemli kas içi değişkenlik vardır, ancak TVA kası sürekli olarak yüksek oranda etkilenir. Bu, motor uç plakalarının denervasyonu, presynaptik terminalde nörofilamentlerin birikmesi ve terminal filizlenmesi ile kanıtlanmaktadır (Şekil 3). Burada sunulan sonuçlar, yukarıda açıklanan tekniğin fare modellerinde NMJ patolojisinin innervasyonuna ve analizine kapsamlı bir genel bakış sağlamak için güçlü bir yöntem olabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Şekil 1. Farenin karın kas yapısına genel bakış. (A) Görüntü, yakın zamanda ötenazilenmiş bir fareden çıkarılan ve diseksiyon kabı yüzeysel bir tarafı yukarı (A) ile sabitlenmiş ekli abdominal kaslı torasik kafesi gösterir. (B) A'daki diseksiyon karın kaslarının yaklaşık sınırlarını işaretlemek için açıklama eklenmiştir. Yüzeysel karın kasları diseksiyonun sol tarafında görülebilir ve dış eğik (mavi ile özetlenmiştir) ve rectus abdominis (kırmızı ile özetlenmiştir) içerir. Diseksiyonun sağ tarafında, yüzeysel kaslar, enine abdominis kasının (yeşil ile özetlenmiştir) ve iç eğik kanın (sarı ile özetlenmiştir) görselleştirilmesine izin verilen şekilde çıkarılmıştır. Bu protokolün amacı, burada düz yeşil bir üçgen olarak gösterilen TVA kasının üst kısmının diseksiyonunun yönlendirilmesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Şekil 2. TVA kasında nöromüsküler kavşaklara tam montajlı genel bakış. Nörofilament (NF; yeşil), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2; yeşil) ve bungarotoksin (BTX; kırmızı) için immünoflooresan boyama ile görselleştirilen TVA kasından örnek NMJ'leri gösteren görüntüler. Görüntüler, tüm kası (A) veya grupları gösteren konfokal görüntüleri gösteren montajlı floresan mikrograflardır (B) veya bireysel (C) NMJs. Ölçek çubuğu = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Şekil 3. TVA kasında nöromüsküler kavşak patolojisi SMA'nın bir fare modelinden. TVA kasından gelen NMJ'leri gösteren konfokal mikrografiler, nörofilament (NF; yeşil), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2; yeşil) ve bungarotoxin (BTX; kırmızı) için immünofluoresanboyama ile görselleştirilmiştir. Normal NMJ morfolojisi kontrol farelerinde gözlenebilirken, Smn2B / - farelerden TVA kaslarında tam denervasyon (beyaz ok ucu), kısmi denervasyon (mor ok ucu) terminali filizlenme (mavi ok ucu) ve presinaptik şişlik (sarı ok ucu) kanıtı olduğunu unutmayın. Post-sinaptik uç plakalar da görünüşte daha az olgun bir fenotip yansıtan daha az karmaşıktır. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük görüntüyü görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Bu videoda, farenin enine abdominis kasının diseksiyonu için bir protokol gösteriyoruz ve nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için immünofluoresans ve mikroskopi kullanıyoruz.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Transvers ADOS kası, abdominal kas sisteminin en derin tabakasını oluşturan ince ve yassı bir kastır. Lineer alfa aracılığıyla orta hatta ve göğüs kafesinin derin yüzeyine tutunur. Bu videoda, bu kasın üst kısmını diseke edeceğiz ve innervasyon paternlerini ile nöromüsküler kavşak yapısını görüntülemek için immünofloresan yöntemini kullanacağız.Bu diseksiyon için, ekteki protokolde ayrı ayrı listelenmiş olan şu araçlara ihtiyacınız olacaktır. Fareleri uygun bir yöntemle sakrifiye ettikten sonra, tüy yayılımını en aza indirmek için %70 ethanol püskürtün. Fareyi sırtüstü yatırın ve kalça seviyesinden deri boyunca bir insizyon yapın.Karın kaslarını kesmemeye dikkat ederek, bu insizyonu fareyle tüm çevre boyunca sürdürün. İnsizyonu tamamladıktan sonra, deriyi farenin başının üzerine doğru çekin.Tekrar, karın kaslarının yırtılmamasına dikkat ederek, karın kaslarını kesin ve insizyonu omurga sütununa ulaşana kadar sürdürün. Bu noktada, sternumun üzerine çıkana kadar kaburgalar boyunca yukarı doğru kesin ve diyaframı göğüs kafesinden ayırmaya özen gösterin.Bu işlemi farenin diğer tarafında da tekrarlayın. Bu noktada, kaburgaları ve sternumu kesin; kasların bağlı olduğu kaburgaları agar kaplı bir diseksiyon kabına aktarın. Kasları, böcek diseksiyon iğneleri kullanarak sabitleyin.Dokunuzu %4 PFA ile sabitleyin ve 15 dakika boyunca sallama platformunda bırakın. Burada, iğnelenmiş kasınızın nasıl görünmesi gerektiğine dair bir örnek yer almaktadır. Görüntünün sol tarafında, mavi ile çerçevelenmiş m. obliquus externus ve kırmızı ile çerçevelenmiş m. rectus abdominis'i içeren yüzeysel kaslar görülebilir.Görüntünün sağ tarafında, sarı ile çevrelenmiş m. obliquus internus'u ve yeşil ile çevrelenmiş m. transversus abdominis'i ortaya çıkarmak için bu tabaka geriye doğru soyulmuştur. Amacımız, m. transversus abdominis'in üst kısmını diseke etmektir. Bir diseksiyon mikroskobu altında burada içi dolu yeşil üçgenle gösterildiği üzere, eksternal oblik kasını kaburgaları örttüğü noktadan kesin, ardından eksternal obiği ancak transvers abdominis'in üzerinden kesecek şekilde aşağı doğru kesin. Görüntünün sol tarafında teğetsel kas lifleri olarak görülen internal oblik kasının başlangıcını görene kadar kesmeye devam edin.Kan damarını, kas yüzeyinden nazikçe soyarak çıkarın. Ardından, transvers abdominis kasını üzerindeki kaburgadan ayırmak için künt diseksiyon uygulayın. Kaburganın altındaki kısmı da dahil ettiğinizden emin olarak kasın kenarları boyunca kesin.Kaburgayı çıkarın ve kası, immunofloresan inceleme için 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Tüm immunofloresan prosedürlerini 24 kuyucuklu bir plakada gerçekleştirin. İnce uçlu bir pipet kullanarak bu makaledeki protokolü takip edin.Bu protokolde detaylandırılan reaktifleri kullandığınızdan emin olun. İmmünofloresan boyama sonrası kasları cam lamlara ve floresan montaj ortamına yerleştirin; kası kapatma camını eklemeden önce düz olduğundan emin olarak, nazikçe açmak için pens kullanın. Montaj sırasında kası düzleştirmek için sıkıca bastırdığınızdan emin olun. Bu görüntüde gösterildiği gibi, bu protokol, nöromüsküler kavşakları ve innervasyon paternlerini görselleştirmek amacıyla transvers abdominis kasının bütün montaj boyamasını gerçekleştirmek için kullanılabilir.Bu görüntüde, SB two ve nörofilament karşıtı antikorlarla işaretlenen aksonlar ve sinaptik terminaller yeşil renkte, alfa bungar toksini ile işaretlenen motor plaklar ise kırmızı renkte gösterilmiştir. Nöromüsküler bileşke morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi Z serisi kullanılabilir. Bu protokol, fare modellerinde nöromüsküler bileşke patolojisini incelemek için uygulanabilir.Örneğin, bu görüntüler spinal müsküler atrofi fare modelindeki nöromüsküler kavşak patolojisini göstermektedir. Sırasıyla beyaz veya mor oklarla belirtilen tam veya kısmi denervasyonun, mavi oklarla gösterilen terminal filizlenmenin ve sarı oklarla işaretlenen presinaptik şişmenin kanıtları olduğu görülmektedir. Bu tür analizler, motor nöron hastalıklarındaki patolojik süreç hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir...

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Bu video, Drosophila'nın dorsal longitudinal kaslarındaki nöromüsküler kavşakların yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokolü göstermektedir. Prosedür, nöronların ve kasların iki farklı antikorla boyanmasını ve mutant ve vahşi tip sinekler arasındaki floresan modellerinin karşılaştırılmasını içerir. Mutant sineklerde nöronal lekelenmede bir azalma, kas yapısı bozulmadan kalırken nörodejenerasyonu gösterir.

Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Nöromüsküler kavşak (NMJ), bazen sinaptik yetmezlikle sonuçlanabilen çeşitli durumlarda değişir. Bu rapor, bu tür yapısal değişiklikleri ölçmek için floresan mikroskobu tabanlı yöntemleri açıklamaktadır.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

Moleküllerin intramüsküler alımının ve karşılık gelen motor nöronlara retrograd taşınmasının etkinliği, enjeksiyon bölgelerinin motor uç plakalarına (MEP'ler) göre konumuna bağlıdır. Burada, izleyicilerin motor nöronlara retrograd taşınmasını optimize etmek için MEP'lerin iskelet kaslarına nasıl yerleştirileceğini açıklıyoruz.

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevsel bir değerlendirilmesi sinir ve kas arasındaki iletişimi ilgili gerekli bilgileri sağlar. Burada biz kapsamlı bir şekilde kullanarak iki farklı kas-sinir hazırlıklar, yani soleus siyatik ve diyafram frenik NMJ ve kas işlevselliğini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

Öğrenin, farelerde transversus abdominis kasının diseksiyonu ve immünofloresan boyama ile nöromusküler kavşakların görüntülenmesi yöntemini. Bu protokol motor nöron hastalıklarının patolojisini incelemek için kullanılır.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet