Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu prosedürün genel amacı, stres koşullarının memeli hücrelerinin ve dokularının translasyonu, başlatılması üzerindeki etkilerini polizom profillemesi ile ölçmektir. Bu, önce memeli kanser hücrelerinin bir anti-kanser ilacı ile tedavi edilmesi ve ardından hücre ekstraktlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, sakaroz, gradyanlar yapmaktır.

Daha sonra, hücre ekstraktları sakaroz, gradyanlar üzerine yüklenir ve ribozomal fraksiyonları ayırmak için ultra santrifüjlenir. Sonuç olarak, test edilen proteinlerin polizom ile ilişkisini değerlendirmek için spesifik antikorlar kullanılarak western blot analizi yapılır. Metabolik etiketleme gibi mevcut bir yöntemin bu tekniğinin temel avantajı, stres koşullarının translasyonun başlangıç adımı üzerindeki etkisini değerlendirmemize izin vermesidir.

Bu yöntem, anti-kanser ilaçlarının çeviri başlatmayı etkileyip etkilemediği ve nasıl etkilediği gibi stres terapötik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin anlamı, kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü çeviri Başlatmanın yeni düzenleyici yollarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur. Bu yöntem, hücre kültürlerinde translasyon başlatma regülasyonu hakkında fikir verebilse de, beyin ve tümörler dahil olmak üzere izole dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Önce otomatik yoğunluk gradyan fraksiyonlama sistemini hazırlamak için, aparatın boru sistemini beş dakika boyunca %0.1 SDS ile yıkayın. Daha sonra boru sistemini beş dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın, ardından beş dakika RNA Zap solüsyonu ile yıkayın. Ve son olarak, DEPC, su ile sisteme hava pompalayarak boru sistemini kurutun.

Daha sonra, %15 ve %55 sükroz çözeltileri hazırlayın, bir ISCO modeli bir 60 gradyan oluşturucu kullanarak doğrusal %15 ila %55 sükroz gradyanı oluşturun. Üreticinin talimatlarına uyarak, gradyan oluşturucu programının ultra santrifüjü dört santigrat dereceye kadar soğuttuğu süre boyunca gradyanlarda kabarcıklar veya türbülanslar oluşmasını önlemek için tris peristaltik pompa hızını dikkatli bir şekilde kontrol etmek önemlidir. Bu deney, daha önce %80'e ulaşacak şekilde kaplanmış düşük geçişli helo rahim ağzı kanseri hücrelerini kullanana kadar gradyanları dört santigrat derecede tutun.

Deney gününde. Taze hücrelerden ekstraksiyon yapmak ve bu prosedür sırasında RNA kontaminasyonunu önlemek için, anti-kanser ilacını eklemeden 90 dakika önce, hücrelerin ortamını taze, tam bir besiyeri ile değiştirmek önemlidir. Translasyonu uyarmak için, hücreleri inkübatöre geri koyun.

Anti-kanser ilacını kontrol ilavesi olarak doğrudan hücre kültürüne ekleyin. DMSO, 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin, dört saat sonra% 5 karbondioksit inkübe edin, plakaları buzun üzerine yerleştirin ve en iyi sonuçları elde etmek için hücreleri bir mililitre lizis tamponunda soğuk PBS hasat hücreleri ile üç kez yıkayın. Her deney koşulu için yaklaşık 12 milyon hücre kullanın.

Hücreleri kazınmış plakalardan bir einor tüpüne aktarın ve bir şırıngadan 15 kez geçirerek iyice karıştırın. Hücre lizatlarını 15 dakika buz üzerinde dinlendirin. Daha sonra, bir slayta birkaç damla hücre lizatı koyun ve 10 x objektif kullanarak faz kontrast mikroskobu ile hücresel lizisi değerlendirin.

Hücre lizisi doğrulandıktan sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 11.000 Gs'de santrifüjleme ile netleştirin. Poli ribozomları içeren çözünür lizatı yeni bir tüpe aktarın ve sitoplazmik ekstraktları sakaroz gradyanlarına yüklemeden önce buz üzerinde tutun. Bir spektrofotometre kullanarak mevcut RNA konsantrasyonunu dikkatlice ölçün ve yavaşça yaklaşık 20 OD iki 60 birim ekstraktı %15 ila 55 sükroz gradyanına yükleyin.

Santrifüjleme sırasında tüpün taşmasını önlemek için tüpün yüzeyinde iki ila üç milimetre kullanılabilir alan olduğundan emin olun. Tüpleri rotora yükleyin. Rotoru ultra santrifüje yerleştirin ve gradyanları iki saat 30 dakika boyunca dört santigrat derecede 230.000 Gs'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandığında, tüpleri çıkarın ve gradyanları bozmadan dikkatlice buzun üzerine yerleştirin. Sitoplazmik ekstraktların fraksiyonlanmasına başlamak için, sükroz gradyanlarını otomatik bir yoğunluk fraksiyonlama sistemine yerleştirin ve üretici tarafından tarif edildiği gibi otomatik fraksiyonlama ve fraksiyonların toplanması ile devam edin. Her 0.5 mililitrelik fraksiyonu, gradyan fraksiyonlama işlemine paralel olarak 250 nanometrede sürekli absorbans izlemesi ile ayrı einor tüplerine toplayın, poli ribozomal profil her çalışmanın sonunda grafik kağıdı üzerinde düzenlenecektir.

Toplanan fraksiyonları olan eend tüplerini buzun üzerine aktarın. Bu prosedüre başlamak için, toplanan her fraksiyona iki hacim% 100 soğuk etanol ekleyin ve RNA protein komplekslerinin gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökelmesine izin verin. Proteinlerin ekstraksiyonu için,% 70 etanol hava ile yıkandıktan sonra dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 11.000 G'de her bir RNA protein çökeltisini santrifüjleyin ve çökeltiyi yeniden süspanse edin.

Bir SDS sayfası numune tamponu RNA Resus'un ekstraksiyonu için western blot analizine devam etmeden önce, her bir RNA protein çökeltisini %0.1 SDS içeren lizis tamponunda askıya alın, çökeltinin bir protein bileşenini mililitre proteinaz K başına iki miligram ile 30 dakika boyunca sindirin. % 55 Santigrat su banyosunda, bir hacim fenol kloroform, iki hacim kloroform ve 0.1 hacim iki molar sodyum asetat pH dört ekleyin. 15 dakika buz üzerinde dinlendirin.

20 dakika boyunca dört santigrat derecede 10.000 GS'de santrifüjleyin. Mikrolitre glikojen başına bir hacim izopropanol ve 0.2 mikrogram ekleyerek ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede bırakarak her bir numune çökelti RNA'sının elde edilen sulu fazını toplayın. Ertesi gün, çökeltiyi bir saat boyunca dört santigrat derecede 10.000 G'de döndürün.

Süpernatanı çıkarın ve RNA peletini %70 soğuk etanol ile yıkayın, RNA peletini küçük bir hacimde RNA'ya yeniden süspanse edin. Bedava su. Spektro fotometreyi kullanarak RNA'nın miktarını ve kalitesini değerlendirin.

Burada sitoplazmik ekstraktlardan temsili polizom profilleri gösterilmiştir. Normal koşullarda veya proteazom inhibitörü ile dört saat boyunca muamele edildikten sonra büyütülen helo hücrelerinden hazırlanır ve santrifüj, ağırlıkça doğrusal sükroz gradyanına %15 ila 55 hacim yapılır. 40 s, ribozomlar 60 s, ribozomlar 80 s, monolar ve polizomların konumları her profilde belirtilmiştir.

Degradenin üstünden aşağıya doğru fraksiyonlar gösterilir, soldan sağa fraksiyonlar, büyük ribozomal L 28 proteinine karşı antikorların yanı sıra normal büyüme koşulları altında polizom bütünlüğü için kontrol görevi gören polizomla ilişkili protein FMRP ile Western blot tarafından toplanmış ve analiz edilmiştir. Translasyon başlatma kompleksleri, burada gözlemlendiği gibi polizom profilleme ile tespiti aktif bir translasyon başlatmayı test eden poli ribozomlara dönüştürülür. Proteazom inhibitörü ile tedavi, translasyon başlangıcının inhibisyonunu gösteren bir DS Monos'ta eşlik eden bir artışla birlikte polizom piklerini azaltır Bu prosedüre katılırken, gradyanları dikkatli bir şekilde ele almak ve hücre lizizini kontrol etmek için r nazsız bir ortamda çalışmak önemlidir.

Spesifik protein veya M MNA'nın polizom ile ilişkisi gibi ek soruları yanıtlamak için batı kanı ve kuzey kanı gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, çeviri alanındaki araştırmacıların, kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi insan hastalıklarında çeviri başlatma faktörlerini düzenlemenin etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.