Name: Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin stres koşullarının memeli hücrelerinde çeviri başlatılmasına etkilerini polizom profilleme ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, ribozom fraksiyonlarını ayırarak protein sentezi düzenlemesini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PA Laval Üniversitesi Tıp Fakültesi bursu &quot;Pierre Durand&quot; bir alıcı. Bu çalışma Polizom parçalama RMR M yeni CIHR araştırmacı maaş ödülü tutar için inovasyon hibe Kanadalı Vakfı (MOP-GF091050) yoluyla elde edilmiş RM Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi (MOP-CG095386) tarafından desteklenmiştir. Biz Dr minnettarız. Yararlı tavsiyeler E. Khancıyan, I. Gallouzi, S. Di-Marco ve A. Cammas.

Protokol kuralları takip Laval Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1.. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Beyin Manipülasyon <ol><li> Memeli hücreleri ve Drosophila <ol><li> American Type Culture Collection tarafından tavsiye edilen, HeLa servikal kanser hücreleri ve Schneider Drosophila embriyonik hücreler büyür. Düşük bir geçit hücreleri ile çalışmak. </li><li> % 80 izdiham Deneyin gün ulaşmak için Plaka hücreler. En iyi sonuçları elde etmek için, her bir deney için hücreler 12 x 10 ~ 6 kullanın. Polizom analizi için özler yapmadan önce, en az 90 dakika boyunca, taze tam orta ekleyerek çeviri uyarır. </li></ol></li><li> Beyin izolasyon: doğumdan sonra 9 ve 16 gün arasında değişen farelerin beyinleri kesin. Ötenazi anestezi ve servikal dislokasyon sonra CO 2 solumaktan içerir. Kurban sonra, bütün beyin ve iki yerde izole it -80 ° C ya da doğrudan doğruya hemen kullanım için soğuk PBS 1X içine aktarın. </li></ol> 2.. Yoğunluk hazırlanması Gradyan Bölünmesi Sistemi <ol><li> 5 dakika için% 0.1 SDS ile boru sistemi yıkayın. </li><li> DEPC su ile yıkamadan önce, 5 dakika boyunca RNaseZAP Çözüm ile, daha sonra 5 dakika için% 70 etanol ile boru sistemi yıkayın. </li><li> Aparatın boru sistemi kurutmak için hava pompası. </li></ol> Sakroz Gradyanların 3. Hazırlanması <ol><li> 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.25 mM MgCI2, 150 mM NaCI, ve 1 mM DTT,% 15 ve% 55 sükroz cevap verir. </li><li> Oluşturmak üreticinin talimatlarına göre tarif edildiği gibi, eski bir Isco Model 160 kullanarak lineer gradyan% 15-55 sukroz gradyanı. Bununla birlikte, bu geçişlerini kabarcıklar veya türbülanslar oluşmasını önlemek için de TRIS peristaltik pompa hızını kontrol etmek önemlidir. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de gradyanlar tutun. </li><li> Degrade yapımcısı programı çalıştığı süre boyunca, 4 ° C&#39;ye ultrasantrifüjdeki serin </li></ol> 4. Hücre hazırlanması ve Fare Beyin özler <ol><li> Hücre ekstrelerinin hazırlanması <ol><li> Buz ve yıkama hücreleri üzerinde plaka (lar) soğuk PBS 1X ile 3x. </li><li> Hasat hücreleri, pH 7.4, 1.25 mM MgCI2, 150 mM NaCI, 1 mM DTT,% 1 Nonidet P40, 5 U / ml RNase inhibitör, takviye edilmiş, 1 ml liziz tamponu (20 mM Tris-HCI (12 x 10 ~ 6) tam Mini EDTA&#39;sız proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri ile birlikte), bir Eppendorf tüpüne transfer ve 1 cc U100 insülin şırınga 28 G 1/2 ile olanağına 15x geçirilerek iyice karıştırın. Hücre lizatı 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. </li><li> 10X objektif kullanarak bir faz kontrast mikroskop ile gözleyerek hücre lizizi değerlendirmek için bir slayt üzerine hücre lisatı birkaç damla koyun. Sadece çekirdekleri görünür olmalıdır ve herhangi bir hücre zarları hücre lizizi görebilir doğrulayan olmalıdır. Bir kontrol olarak, gözlemlemekLizinlerle parçalanmayan hücreler. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 11,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre lizat açıklığa kavuşturulması ve poliribozomların içeren çözünebilir lizat tutun. </li></ol></li><li> Fare Beyin ekstrelerinin hazırlanması <ol><li> Liziz tamponu 2 ml buz gibi soğuk bir Dounce homojenizatör içinde 10 vuruş ile izole edilmiş bütün beyin (~ 500 mg) homojen ve 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 11,000 x g&#39;de santrifüj ile Homojenat açıklamak </li><li> % 50 sakroz yastığı üzerine elde edilen süpernatan yükleyin ve 4 ° C&#39;de TH-641, bir ultra santrifüj rotor kullanılarak 200,000 xg&#39;de 2 saat boyunca devam sedimantasyon </li><li> Liziz tamponu içinde 1 ml poliribozomların içeren şeffaf pelet yeniden süspanse edin ve aşağı ve yukarı pipetlenerek ile iyice karıştırın. Geçişlerini üzerine yüklenmeden önce 30 dakika için buz üzerinde kalan süspansiyon olsun. </li></ol></li></ol> 5.. Sakaroz Gradyanların ve Ultrasantrifügasyon üzerine ayıklar yükleniyor <ol><li> Konsantrasyonunu ölçmekBir spektrofotometre kullanılarak, sitoplazmik ekstre içinde mevcut RNA. Dikkatli ve yavaş yavaş% 15 ila% 55 sukroz gradyanı üzerine ~ ekstrenin 20 OD 260 adet yükleyin. Kullanılabilir alan 2-3 mm santrifüj sırasında tüpler taşan önlemek için borunun yüzeyinde olduğundan emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de TH-641, bir ultra santrifüj rotor kullanılarak 230,000 x g, 2 saat 30 dakika için ultra-santrifüj kullanarak gradyanlara santrifüj Santrifüj sona erdiğinde, tüpleri çıkarın ve geçişlerini rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde buz koyun. </li></ol> Polisomlann profilleme için Sitoplazmik Ekstraktlarının 6. Fraksiyonu <ol><li> Üretici tarafından tarif edildiği gibi, (0.5 ml her biri) Otomatik Yoğunluk Fraksiyonu Sistemi sakaroz gradyanları yerleştirin ve fraksiyonların otomatik fraksiyonasyonu ve toplama ile devam edin. </li><li> 254 nm&#39;de absorbans sürekli olarak izlenmesi ile ayrı Eppendorf tüpleri içine her fraksiyonu (~ 500 | il) toplayın. Parall yılındagradyan ayrıştırma işleminin el, polyribosomal profil grafik kağıt üzerinde düzenleme olacaktır. Seçenek olarak ise, polisom profilinin bir elektronik satın için grafik kaydedicisinde bağlanmış bir veri toplama birimi kullanır. </li><li> Her çalışma sonunda, kuru buz üzerinde toplanan Eppendorf şişesi aktarın. Şu anda, mağaza ya da -80 ° C&#39;de kısımlar toplandı ve aşağıdaki gibi direkt protein-RNA kompleksleri hızlandırabilir. </li></ol> 7. Protein Ekstraksiyon ve Analiz <ol><li> Sukroz gradyanı her toplanan fraksiyon için,% 100 soğuk 2 hacim etanol ekleyin ve RNA-protein kompleksleri, -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca çökelmeye sağlar. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 11,000 x g, her bir RNA-protein çökelti daha sonra% 70 etanol ile yıkayın. Kuru ve (bkz. Şekil 2) özel antikorlar kullanılarak Batı beneği ile devam etmeden önce, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon çökelti. </li></ol> 8. RNA Ekstraksiyon ve Analysis <ol><li> Bölüm 7.1 olarak RNA-protein kompleksleri çöktürün. % 0.1 SDS ihtiva eden liziz tamponu içinde her bir RNA-protein çökeltisinin yeniden süspanse edin. Bir 55 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca 2 mg / ml proteinaz K ile çökeltinin protein bileşeni Digest. </li><li> &quot;: Kloroform fenol&quot;, kloroform 2 birimleri ve 2 M NaOAc pH 4 0.1 hacim ve 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de santrifüj 1 hacim ekleyerek Çökeltinin RNA bileşenleri çıkarmak. Izopropanol içinde 1 hacim ve glikojen 0.2 ug / ul ekleyerek -20 ° C &#39;de bir gece boyunca, her numunenin edilen sulu fazdan Çökelti RNA. 4 ° C&#39;de 10,000 x g&#39;de 1 saat boyunca çökelti spin % 70 soğuk etanol ile RNA pelet yıkayın. </li><li> RNAse içermeyen su, küçük bir hacim içine RNA topağı yeniden süspanse edin. Miktarını değerlendirmek ve kalite RNA spektrofotometre kullanılmıştır. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sukroz dereceleri üzerinde Polizom profil analizi hücreler ya da dokulardan 9,11-14 izole polizom yoğunluğu analiz ederek çeviri başlangıç ​​ölçümünü sağlar. Bu teknik, en iyi yaklaşım (değil benzersiz ise) in vivo çeviri inisiyasyon ölçmek için. Bu, hücre döngüsü boyunca 15 hücrelerinin büyüyen translasyonel durumunu izlemek için ve çeviri başlatma üzerinde, viral enfeksiyonlar, hipoksi 13,16, radyasyon 17 ve kimyasal ilaçlar terapide kullanılan 18 de dahi...

Ökaryotik hücreler sürekli bir hızlı adaptif hücre yanıtı gerektiren zararlı fizyolojik ve çevresel stres koşulları bir dizi karşılaşma. Hücre stres yanıtı, anti-hayatta kalma ve pro-sağkalım etkili faktörler arasındaki hassas denge içerir. Bu dengeyi bozarak kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi insan patolojilerin gelişimine öncülük geri dönülmez sonuçlar doğurabilir. Stres yanıtı ilk adımı sırasında, hücreler mRNA çeviri düzeyinde gen ekspresyonunda değişiklikler koordine kontrolü ile ilgili pro-hayatta kalma yolunu aktive edebilir. ökaryotlarda mRNA çevirisi başlatma faktörleri (EIFS), spesifik RNA bağlayıcı protein (RBDS) ve RNA molekülleri 1 ila koordineli etkileşimleri içeren karmaşık hücresel bir süreçtir. başlatma, uzama ve sonlanma: mRNA çeviri üç ayrı evreye ayrılır. Her üç faz dede tabi olsa da,translasyonel kontrol mekanizmaları, böylece protein sentezi 2&#39;nin oran-sınırlayıcı bir adım teşkil etmektedir çeviri çoğunlukla başlangıç ​​aşaması, hedef merciin düzenleyici mekanizmalar,. Çeviri başlatma i ön başlatma kompleksinin oluşumuna yol açan, üçlü kompleks ve 40S ribozom alt birimine yönelik daha sonraki bağlanma Met eIF2a.GTP.Met-tRNA oluşumu ile başlayan bir çok düzenli bir süreçtir. Bir sonraki adım, eIF4F ve eIF3 gibi çeviri başlatma faktörlerinin aktivitesi içerir mRNA için preinitiation kompleksinin işe olan. Bu şekilde oluşturulan 48S preinitiation kompleksi AUG başlangıç ​​kodonunun tanıyıncaya kadar mRNA&#39;nın 5&#39;-ötelenmemiş bölge tarama başlatmak için bu makine sağlayacak özel yapısal değişikliklere uğrar. Çeviri başlangıç ​​faktörlerin çoğu daha sonra serbest bırakılır ve 60S alt birimleri bir 80S oluşturmak için işe alınırlar ribozom kompleksi çeviri, yetkili birt hangi nokta protein sentezi başlar (Şekil 1). Birden fazla 80S monosome sözde polisomlann (veya poliribozomların) üreten bir zamanda aynı mRNA&#39;nın tercüme edilebilir. Bir mRNA üzerinde polizom yoğunluğu başlatma, sonlandırma ve uzama oranları yansıtır ve böylece, belirli bir transkriptin çevrilebilirlik bir ölçüsüdür. Bununla birlikte, polisom profili esas olarak başlangıç ​​aşamasında mRNA çevirisinde değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Burada çeviri başlatma inhibitörü gibi bir proteazom önleyicisi kullandık. Bu ilaç kanser hücrelerinin tedavisi translasyon başlatma faktörü eIF2a 3 fosforile HRI adlı stres kinazın aktivasyonu ile karakterize edilen bir stres tepkisi oluşturur. EIF2a fosforilasyonu, memeli hücrelerinde 4 çeviri başlatma inhibisyonuna yol açan önemli olaylardan biridir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hücreler</td></tr><tr><td>HeLa rahim ağzı kanseri hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila embriyonik hücreler</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (Manassas, VA; ATCC</td><td>)CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kültür ortamı ve Takviyeler</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Bilim Adamı Bilim İnsanı</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sükroz çözeltileri</td></tr><tr><td>D-sükroz</td><td>Fisher Bilim Adamı</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Fisher Bilim Adamı</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lizis tamponu</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Bilim Adamı</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630)</td> <td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknibilim</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase inhibitörü (RnaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü)</td> <td>Yaşam teknolojileri</td><td>10777-019</td> <td>ve nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteazlar (tam, mini, EDTA içermez)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Ekstraksiyon</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Life teknolojileri</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenol: kloroform</td><td>Fisher Bilim Adamı</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Bilim Adamı</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>10814-010&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Akros organikler</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Antikorlar</td></tr><tr><td>anti-FMRP antikoru</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

polizom profilleme stres durumlardaki Çeviri başlatılması analizi

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

MRNA çevirisi hassas kontrolü, özellikle fizyolojik ve patolojik strese yanıt olarak, ökaryotik hücre homeostazı için temeldir. Bu programın değişiklikler kanser gelişimi arasında ayırt edici bir özelliği, ya da nörodejeneratif hastalıklarda görüldüğü gibi, prematüre hücre ölümüne hasarlı hücrelerin büyümesine yol açabilir. Translasyonel kontrol için moleküler temel ilişkin bilinenlerin çoğu bir yoğunluk gradyan ayırma sistemi kullanılarak Polizom analizinden elde edilmiştir. Bu teknik, bir doğrusal sakroz gradyanı üzerinde sitoplazmik özler ultrasantrifüj dayanır. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, sistem, farklı çeviri tekabül eden santrifüj bölgelerinin ayırma ve böylece bir miktar Polizom profili ile sonuçlanan popülasyonları ribozom sağlar. Polisom profilde değişiklikler stres çeşitli tepki olarak meydana gelen çeviri başlatma değişiklikler veya kusurların göstergesidir. Bu teknik aynı zamanda inci değerlendirmek sağlar:e çeviri başlatma belirli proteinlerin rolü ve spesifik mRNA translasyon aktivitesini ölçmek için. Burada, normal ya da stres ya da büyüme koşulları altında, ökaryotik hücrelerin ve dokuların başlatılması için değerlendirmek amacıyla Polizom profilleri gerçekleştirmek için protokol açıklar.

Daha önce belirtildiği gibi, polisom profil stres şartları altında için başlatma değişikliklerin analizi. 1. Daha önce çeviri başlatma komplekslerinin sıralı bir düzeneği içeren bir çok aşamalı bir süreçtir tarif edildiği gibi çeviri başlatma basitleştirilmiş bir görünüşüdür sağlar. Normal büyüme şartları altında, çeviri başlatma kompleksleri olan algılama Polizom profili tarafından bir aktif için başlatma (; İşlenmemiş Şekil 2) için kanıtlamak poliribozomların dönüştür...

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Bu prosedürün genel amacı, polisom profilleme yoluyla stres koşullarının memeli hücreleri ve dokulardaki translasyon başlangıcı üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu işlem, önce memeli kanser hücrelerinin bir anti-kanser ilaçla tedavi edilmesi ve ardından hücre ekstraktlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise sükroz gradyanlarının oluşturulmasıdır.Ardından, hücre ekstraktları sükroz gradyanlarına yüklenir ve ribozomal fraksiyonların ayrılması için ultra santrifüj edilir. Son olarak, test edilen proteinlerin polisom ile ilişkisini değerlendirmek amacıyla spesifik antikorlar kullanılarak western blot analizi gerçekleştirilir. Bu tekniğin metabolik işaretleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, stres koşullarının translasyonun başlama aşaması üzerindeki etkisini değerlendirmemize olanak sağlamasıdır.Bu yöntem, anti-kanser ilaçlarının translasyon başlangıcını etkileyip etkilemediği ve bunu nasıl yaptığı gibi, stres terapisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin önemi, translasyon başlangıcının yeni düzenleyici yolaklarını ortaya çıkarmaya yardımcı olduğu için kanser tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, hücre kültürlerinde t

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Vitro becerisini ölçmek için Toeprinting amaçları için formu çeviri başlatma kompleksleri ile ribozomlara koşulları çeşitli altında RNA transkripsiyonu. Bu iletişim kuralı toeprinting memeli RNA için bir yöntem açıklanır ve kap-bağımlı ve IRES uygulamalı çeviri çalışma için kullanılabilir.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Öğrenin stres koşullarının memeli hücrelerinde çeviri başlatılmasına etkilerini polizom profilleme ile analiz etme yöntemini. Bu teknik, ribozom fraksiyonlarını ayırarak protein sentezi düzenlemesini incelemeye olanak tanır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Daha fazla video keşfet