İndirimli Itraconazole Konsantrasyon ve Süreleri Tedavisi Başarılı mısınız

Bu prosedürün genel amacı, amfibi Kitt mantarı olan Bera key tridium, dendro, he veya BD ile enfekte olmuş amfibileri, antifungal kemoterapi ilacı atriazole ile tedavi etmektir. Bu işlem, öncelikle BD kültürlerinin yetiştirilmesi ve hayvanların fungal patojen ile inoküle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, BD enfeksiyonunu doğrulamak için cilt sürüntülerinde DNA ekstraksiyonu ve QPCR kullanılarak hayvanların test edilmesidir.

Ardından, enfekte hayvanlar altı gün boyunca günde beş dakika %0,0025'lik econazole çözeltisi ile yıkanarak tedavi edilir. Son adım, hayvanın başarılı bir şekilde tedavi edildiğinden emin olmak için tedavi tamamlandıktan sonra en az dört hafta boyunca deri sürüntülerine QPCR analizi yaparak tedavi edilen hayvanların enfeksiyon durumunu izlemektir; bu prosedür, antifungal itraconazole'un düşük konsantrasyonunun ve daha kısa tedavi süresinin bd ile enfekte hayvanların tedavisi için etkili olduğunu göstermektedir. 11 gün boyunca %0,01'lik itraconazole çözeltisi şeklinde olan önerilen tedavi dozuna kıyasla bu tedavi rejimini kullanmanın temel avantajı, önerilen dozun dörtte biri oranındaki düşük bir konsantrasyonun ve altı güne indirilmiş tedavi süresinin BD enfeksiyonunu iyileştirmede hâlâ etkili olması ve aynı zamanda önerilen tedavi dozunun kullanımından kaynaklanan negatif yan etkileri minimize etmesidir.

Metin protokolünde belirtildiği şekilde BD'yi tritone besiyerinde inkübe ettikten ve Zo spor hareketini kontrol ettikten sonra, her plak beş mililitre dinlendirilmiş musluk suyu ile doldurulur ve ZO sporların medyuma girmesi için 10 dakika beklenir. Ardından, Zo Spor süspansiyonu taşınabilir bir kaba dökülür. Zo spor konsantrasyonu bir hemositometre ile tahmin edilir ve burada gösterilen Latoria vei Alpina gibi bir hayvanı inoküle etmek için karışım, dinlendirilmiş musluk suyu ile üç mililitrede 1 × 10⁶ konsantrasyona seyreltilir.

Bir 50 mililitrelik kabın üzerinde tutun ve inokülüm karışımının üç mililitresini hayvanın venter bölgesine dökün. Ardından, hayvanı inokülümden süzülen sıvının bulunduğu kaba yerleştirin. Kabın kapağını kapatın ve enfeksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için hayvanı inokülasyon kabında 24 saat bekletin.

BD patojeni ile kontaminasyonu önlemek için eski eldivenleri çıkarın ve imha etmeden önce otoklavlanmak üzere uygun yere yerleştirin. Yeni bir çift eldiven giydikten sonra bir sonraki hayvanı inoküle etme işlemine geçin.

İnokülasyondan 24 saat sonra, hayvanları iki hafta boyunca kendilelerine ait dezenfekte edilmiş teraryumlarına geri yerleştirin. İki haftanın sonunda çözeltiyi %10'luk çamaşır suyu konsantrasyonuna getirerek, tüm sıvı atıkları imha etmeden önce dezenfekte etmeyi unutmayın. Başarılı BD enfeksiyonunu test etmek için hayvanlardan steril bir pamuklu çubukla sürüntü alın.

Sürükleme işlemleri sırasında ve arasında pamuklu çubuğu nazikçe döndürün. Her iki tarafta karın bölgesine, her bir uyluğa ve dört uzvun her birine beşer kez sürükleme yaparak toplam 45 sürükleme gerçekleştirin. Pamuklu çubukları -20 °C'de 1,5 ml'lik mikro tüplerde saklayın.

Ticari olarak mevcut bir DNA izolasyon kiti kullanarak sürüntülerden genomik DNA'yı ekstrakte edin ve metin protokolünde belirtildiği şekilde QPCR gerçekleştirin. Metin protokolünde açıklandığı üzere, itrakonazolün üç farklı dozajı için birer tane olmak üzere üç tedavi banyosu hazırlayın. Ardından, tekil amfibileri dezenfekte edilmiş

35 mililitre tedavi çözeltisi içeren 50 mililitrelik kutu kaplar. Hayvanlar arasında eldivenleri değiştirmeyi unutmadan, hayvanların beş dakika boyunca tamamen kaplandığından emin olmak için kabı ara sıra nazikçe çalkalayın. Beş dakika sonra, hayvanları dezenfekte edilmiş alanlarına geri döndürün.

Beş dakikalık işlemi beş gün boyunca her gün tekrarlayın. Enfeksiyonun temizlendiğinden emin olmak için, tedavi tamamlandıktan bir hafta sonra ve ardından dört hafta boyunca haftada bir kez hayvanları tekrar BD enfeksiyonu açısından test edin. Tedavi tamamlandıktan sonra bile, hayvanların hâlâ kontaminasyon riski taşıyormuş gibi değerlendirilmesi gerektiğini unutmayın.

Hayvanların enfeksiyondan sonra en az bir ay boyunca ayrı bir alanda tutulması gerekir. Tedavi başarısız olursa, işlem tekrarlanmalıdır. Farklı türler ve farklı yaşam evreleri enfeksiyona ve tedavi rejimlerine farklı tepkiler verir; bu nedenle tedavi, yaygın olarak uygulanmadan önce denenmelidir.

BD biyotehlike oluşturduğundan, teraryumları ve tedavi kaplarını %10'luk bir çamaşır suyu çözeltisiyle yıkayarak her hafta dezenfekte edin. En az 30 saniye boyunca bekletin, çamaşır suyunu iki kez suyla durulayarak temizleyin ve kurbağaların tekrar yerleştirilmesinden önce kapların 24 saat boyunca kurumasına izin verin. Burada, 11 günlük BD tedavisi veya altı günlük BD tedavisi sonrası durumlar gösterilmiştir.

Siyah oklar tedavinin son gününü göstermektedir. Düz çizgiler kontrol gruplarının sağkalımını belirtmektedir. Düz siyah çizgiler, BD pozitif olan ancak BD tedavisi almayan hayvanlar içindir.

Düz gri çizgiler ise BD negatif olan ve BD tedavisi görmeyen hayvanları temsil etmektedir. Kesikli çizgiler, belirtilen konsantrasyonda ekonazol alan tedavi gruplarının sağkalım oranlarını göstermektedir. Altı gün boyunca %0,0025 konsantrasyonda nebulizatörle tedavi edilen tüm hayvanlar, tedavi sona erdikten dört hafta sonra BD negatif bulunmuştur ve bu nedenle bu tedavi başarılı kabul edilmiştir.

Ek olarak, bu dozdaki ekonazol tedavisi, mortalite açısından BD pozitif kontrollerle karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. 11 gün boyunca uygulanan %0,01 ve %0,005 ekonazol tedavilerinin, BD pozitif kontrollere kıyasla mortalitede anlamlı bir artışa yol açtığına dikkat ediniz. Fungal patojen BD'nin bir biyotehlike olduğunu; eldiven giyme ve değiştirme, tüm katı atıkların otoklavlanması ve dezenfeksiyon gibi önlemlerin gerektiğini unutmayınız.

Bu prosedür uygulanırken tüm sıvı atıkların bertarafı gerçekleştirilmelidir.