ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

Bu prosedürün genel amacı, yüzey başlatmalı montaj kullanarak tek veya çoklu hücre dışı matris proteinlerinden bağımsız nanolifler, nanoyapılar ve 2D matrisler tasarlamaktır. Bu işlem, öncelikle PDMS ön polimerinin topografik olarak desenlenmiş bir ana kalıba dökülüp kürleşmeye bırakılmasıyla polidimetilsiloksan veya PDMS damgaların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kürleşmiş PDMS damgalar kesilir ve istenen hücre dışı matris proteinlerini içeren bir solüsyonla kaplanır.

Ardından, damgalar yıkanır, kurutulur ve poly N izopropil akrilamid veya pNIPAM kaplı cam lamella üzerine mikro temas baskılama yöntemiyle basılır. Son adım, lamellayı 40 °C sıcaklıktaki deiyonize su ile hidrate etmek ve çözeltinin yavaşça soğumasına izin vermektir. Sıcaklığın yaklaşık 32 °C'nin altına düşmesi, termal hassasiyetli pNIPAM tabakasının çözünmesini ve birleştirilmiş protein nanoliflerin veya nanoyapıların salınmasını tetikler.

Nihayetinde, birleştirilen nano lifler ve nano yapılar, faz kontrastı ve/veya floresan mikroskobu ile doğrulandığı üzere çözelti içinde serbest durumdadır ve doku mühendisliği iskeleleri gibi ileri uygulamalarda kullanılabilir. Bu tekniğin faz ayrımı veya elektro eğirme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin in vivo ortamda normal olarak ECM liflerini oluşturma biçimini gerçekten taklit eden bir teknik kullanarak ECM protein nano lifleri tasarlama yeteneğidir. Yüzeyden başlatılan birleştirme tekniği; protein kompozisyonunu, lif morfolojisini ve iskele mimarisini kontrol edebilme kabiliyeti dahil olmak üzere bir dizi benzersiz avantaja sahiptir.

Ayrıca, diğer yöntemlerle gerçekleştirilmesinin zor olduğu kanıtlanmış olan fibronektin laminin ve tip dört kolajen gibi hücre dışı matris proteinlerinden ECM protein nano lifleri tasarlayabiliriz. Bu yöntem, araştırmacıların adezyon ve diferansiyasyon gibi çeşitli hücre davranışlarını yönlendirmek için spesifik ve iyi tanımlanmış fiziksel ve kimyasal ipuçlarına sahip konstrüktlar geliştirmelerini sağlayarak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniği ilk kez kullanıyorsanız, mikro temas baskılama desenlerinin sadakatinin yanı sıra gövdelerinizin kalitesini sürekli olarak kontrol etmeyi unutmamalısınız.

Bu işlem, ECM nano liflerinin ve nanoyapılarının düzgün bir şekilde bir araya getirilmesi için gereklidir. Bu prosedüre başlamak için, elastomer bazını ve kürleme ajanını 10:1 ağırlıkça oranında birleştirerek polidimetilsiloksan veya PDMS ön polimerini hazırlayın; genellikle, ana kalıbı 1 cm kalınlığında bir tabaka ile kaplayacak yeterli miktarda PDMS'in olduğundan emin olmak için 80 g baz ve 8 g kürleme ajanı kullanılır. PDMS'i, 2000 RPM'de iki dakika boyunca karıştırma ve 2000 RPM'de iki dakika boyunca degazlama (DGAs) şeklinde ayarlanmış bir santrifüj karıştırıcı kullanarak karıştırın ve gazını alın. Ardından dökün.

Bir santimetre kalınlığında bir tabaka oluşturmak için ana kalıbın üzerine PDMS ön polimer dökün ve PDMS'yi 65 °C'de dört saat boyunca fırınlayın. Kürlendikten sonra, PDMS damgasını oluşturmak için desenin bulunduğu bölgeyi bir bistüri ile kesin. PDMS damgasının desenli tarafını arka tarafından ayırt etmek için.

Damganın arka tarafındaki köşelerden birini çentikleyerek kesin. Bu prosedüre 25 milimetre çapındaki cam lamelleri temizleyerek başlayın; lamelleri %95 etanolda bir saat boyunca sonikasyonla temizleyin ve ardından 65 °C'lik bir fırında kurutun. Ardından, poliakrilamid ve izopropil akrilamid veya piam çözeltisini hazırlamak için piam'ı 1-butanol içerisinde %10 konsantrasyonda çözün. Temiz bir cam lamelini spin kaplayıcının vakumlu tablasına ortalayarak yerleştirin ve cam yüzeyi tamamen kaplamak için yüzeye 200 µL piam çözeltisi pipetleyin.

Kapak lamı 6.000 RPM hızda bir dakika boyunca spin coat yöntemiyle kaplayın. PDMS damgaları %50 etanol içinde 30 dakika boyunca sonikasyonla temizleyin ve ardından bir nitrojen akışı altında kurutun; hücrelerle birlikte hücre dışı matris veya ECM nanoyapılarının kullanılacağı uygulamalarda steriliteyi korumak için kurutma ve sonraki tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Mikro temas baskılama adımı, bu prosedürün en zor kısmıdır.

Kullanımdan önce PDMS damgaların görünür herhangi bir kusur açısından incelenmesi önemlidir. Ayrıca, iki haftadan daha eski olan protein çözeltisini kullanmayın. PIAM kaplı lamelleri kapalı bir Petri kabının içine yerleştirin ve UV maruziyeti ile sterilize edin.

Biyogüvenlik kabini içinde UV ışığı altında 45 dakika yeterlidir. Her bir PDMS damgasının desenli yüzeyini 200 µL protein çözeltisi ile kaplayın. Burada, steril distile su içinde 50 µg/mL konsantrasyonda Fibronektin veya FN kullanılmıştır.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra, fazla proteini uzaklaştırmak için PDMS damgaları distile su ile yıkayın ve bir nitrojen akımı altında iyice kurulayın. Borunun erken çözünmesini önlemek için suyun tamamen uzaklaştırılması önemlidir. Lamine kaplama üzerindeki kapak lameli ve hatalı protein transferi.

Gerektiğinde, PDMS damganın desenli yüzeyini boru PAM kaplı lam üzerine yerleştirerek mikro temas baskılama işlemini gerçekleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek ve beş dakika sonra tekdüze temas sağlamak için damgaların arkasına pensetle hafifçe vurun. PDMS damgayı lam üzerinden soyarak çıkarın.

Bu aşamada, çalışmaya bağlı olarak, daha karmaşık ve çok bileşenli yapılar oluşturmak için ek ECM proteinleri desenlenebilir. ECM deseni basıldıktan sonra, desenlenmiş boru PAM kaplı lameli 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve desen sadakatini faz kontrast mikroskobu kullanarak inceleyin.

Desene bağlı olarak, desenin özelliklerini çözümlemek için bir CCD kamera gerekebilir. ECM proteinleri floresanla işaretlenmişse, desenin incelenmesi için floresan mikroskobu da kullanılabilir. Desen sadakati doğrulandıktan sonra, Petri kabına üç mililitre 40 °C saf su ekleyin ve suyun borunun çözünmesini kademeli olarak soğutmasına izin verin.

PAM tabakası ve ECM protein desenlerinin salınımı, faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Genellikle, ECM protein nanoyapılarının salındığından emin olmak için su, pNIPAM'ın 32 °C olan alt kritik çözüm sıcaklığının çok altına, oda sıcaklığına kadar soğutulur. Eğer uygulama optik tekniklerin kullanımına izin vermiyorsa, salınım çözelti sıcaklığı ölçülerek izlenebilir.

Boru PAM tabakasının salınımından sonra nano lifler ve diğer nano yapılar suyun içinde yüzecektir. Gelecek uygulamalar için nano kumaşların ve diğer nano yapıların manipüle edilmesi gerekir ancak izlenecek kesin yaklaşım deneysel amaca bağlıdır. Yüzey başlatmalı montaj veya SIA'nın, lif boyutları üzerinde hassas kontrolle ECM protein nano lifleri tasarlayabildiğini göstermek için burada temsili sonuçlar sunulmuştur.

50 mikrometre uzunluğunda ve 20 mikrometre genişliğinde bir dizi fibronektin dikdörtgeni, piam kaplı bir lam üzerine desenlendi; ardından 40 °C DI su eklemesi yapıldı ve piam'ın alt kritik çözelti sıcaklığının altına soğutulması sağlandı. Piam'ın çözünmesiyle birlikte fibroin nano liflerin salınımı tetiklendi. Lifler, içsel bir ön gerilime sahip oldukları için büzüldüler.

Piam yüzeyine desenlendiğinde, fibronektin nanolif boyutlarının salınım öncesi analizi, bunların 50,19 ± 0,49 µm ortalama uzunluk ve 19,98 ± 0,17 µm ortalama genişlik ile monodispers olduğunu ortaya koymuştur. Salınım sonrası nanolifler belirgin şekilde kısalmış ancak 14,15 ± 0,92 µm ortalama uzunluk ve 2,65 ± 0,32 µm ortalama genişlik ile monodispers kalmaya devam etmiştir. Atom kuvvet mikroskopisi, SIA salınım süreciyle ilişkili lif boyut değişikliklerine dair daha yüksek çözünürlüklü bir perspektif sağlamıştır.

Önemli bir bulgu olarak, salınım öncesi fiberler yaklaşık beş nanometre düzeyinde tekdüze bir kalınlığa sahipken, salınım sonrası fiberlerin kalınlığı birkaç yüz nanometre mertebesindeydi; bu sırada uzunluk ve genişlik azalmıştır. SIA işlemi kullanılarak, boyutu, şekli ve bileşimi ayarlanabilen çeşitli ECM protein nanoyapıları tasarlamak mümkündür. Örneğin, başlangıçta 20 mikrometre genişliğinde ve bir santimetre uzunluğunda olan fibronektin nanolifler bir boru üzerine desenlenmiştir.

Soğutma ve borulama işlemi sonrası PAM kaplı lamel. Pam çözünmesiyle birlikte nano lifler serbest kalmış ve yaklaşık üç mikrometre genişliğinde uzun iplikler oluşturmuştur. Ayrıca, desen mikro temas baskısı için kullanılan PDMS damgasının yüzey topografyası ile tanımlandığından, kavram kanıtı olarak karmaşık ECM protein nanoyapıları tasarlamak mümkündür.

Çok kollu fibroin yıldızlar oluşturuldu. Termal salım, kolların büzülmesine yol açtı ancak kolların birleştiği yıldızın merkezi bölgesinde büzülme gerçekleşmedi. SIA ayrıca laminin veya LN gibi diğer ECM proteinleri ile de çalışır ve birden fazla ECM proteini aynı yapıya dahil edilebilir.

Bu örnekte, kırmızıyla gösterilen 20 mikrometre genişliğindeki fibronektin çizgileri ile yeşille gösterilen 50 mikrometre genişliğindeki laminin çizgilerinin ortogonal olarak birbirine bağlandığı ve 2D bir nano kumaşa entegre edildiği desenler oluşturulmuş ve ardından serbest bırakılmıştır; serbest bırakılma üzerine her iki nano lif türü de büzülmüş, ancak genel birbirine bağlılık ve kare kafes yapısı korunmuştur. Bu sonuçlar, SIA'nın çeşitli kompozisyon ve yapılara sahip ECM materyalleri tasarlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, ECM nano liflerinin SIA işleminde başarısız olduğu bazı örnekler gösterilmiştir.

Nedenlerden biri, ECM proteininin piam yüzeyine yetersiz transferi nedeniyle tamamlanmamış bir desenin hatalı şekilde serbest bırakılmasıdır. Mikro temas baskılama sırasında meydana gelen delikler, düzensiz kenarlar ve diğer kusurlar; serbest bırakma işlemi sırasında kırılmaya ve parçalanmaya meyilli, tamamlanmamış nanolifler ve nanoyapılar oluşturacaktır. Boru PAM'ın hızlı çözünmesi de serbest bırakma sonrası zayıf desen sadakatine yol açabilir.

Örneğin, alt kritik çözelti sıcaklığının altında olan 20 °C'de su kullanmak, piam'ın hızla şişmesine ve çözünmesine neden olacaktır. Bu durum, 32. görüntüde gösterildiği gibi nanoliflerin geri sıçrayıp kırılmasına ve 52. görüntüde gösterildiği gibi rastgele, düzensiz konfigürasyonlar oluşturmasına yol açabilir.

Bu prosedüre başlamadan önce, PDMS sapların kusurlar açısından durumu kontrol edin ve tüm yüzeylerin tozdan arındırılmış olduğundan emin olun. Aksi takdirde, bu durum uygun protein transferini engelleyecek ve A CM yapılarının yetersiz montajına yol açacaktır. Bu prosedür takip edilerek serbest bırakılan nanolifler veya nanoyapılar, protein liflerinin mekanik özelliklerini analiz etmek gibi birçok işlemde kullanılabilir veya doku mühendisliği için iskeleler olarak değerlendirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bileşimi, geometrisi ve mimarisi ayarlanabilir ECM protein nano fiberleri ve nanoyapıları nasıl mühendislik yöntemleriyle oluşturabileceğinize dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Özellikle, ECM protein desenlerinin pition kaplı cam lameller üzerine mikro temas baskılama yöntemiyle nasıl basılacağını ve ardından ECM yapılarını bir araya getirmek için yüzeyin çözünmesinin termal olarak nasıl tetikleneceğini kavrayacaksınız.