ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi
April 17th, 2014
Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.
Bu prosedürün genel amacı, yüzeyden başlatılan montajı kullanarak tek veya çoklu hücre dışı matris proteinlerinden bağımsız nano lifler, nanoyapılar ve 2D matrisler tasarlamaktır. Bu, önce PDMS ön polimerinin topografik olarak desenli bir ana kalıba dökülerek ve kürlenmesine izin verilerek poli dimetil soane veya PDMS damgalarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kürlenmiş PDMS damgalarını kesmek ve bunları istenen hücre dışı matris proteinlerini içeren bir çözelti ile kaplamaktır.
Daha sonra, pullar yıkanır, kurutulur ve bir poli N izopropil akrilamid veya boru PAM kaplı cam kapak astarı üzerine mikro temas basılır. Son adım, örtü kayışını ılık 40 santigrat derece deiyonize su ile nemlendirmek ve çözeltinin azaltılması için kademeli olarak soğumasına izin vermektir. Yaklaşık 32 santigrat derecenin altındaki sıcaklık, termal olarak hassas boru PAM tabakasının çözünmesini ve birleştirilmiş protein nano liflerinin veya nano yapıların salınmasını tetikler.
Sonuç olarak, bir araya getirilen nano lifler ve nano yapılar, faz kontrastı ve/veya floresan mikroskobu ile onaylandığı gibi çözelti içinde bağımsızdır ve doku mühendisliği iskeleleri gibi daha ileri uygulamalarda kullanılabilir. Bu tekniğin, yüz ayırma veya elektro eğirme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücrelerin normalde in vivo olarak ECM liflerini oluşturma şeklini gerçekten taklit eden bir teknik kullanarak ECM protein nano liflerini tasarlama yeteneğidir. Yüzeyden başlatılan montaj tekniği, protein bileşimini, lif morfolojisini ve iskele mimarisini kontrol etme yeteneği dahil olmak üzere bir dizi benzersiz avantaja sahiptir.
Ayrıca, ECM protein nano liflerini, lif nin, laminat ve diğer yöntem türlerini kullanarak zor olduğu kanıtlanmış olan kollajen tip dört gibi hücre dışı matris proteinlerinden tasarlayabiliriz. Bu yöntem, araştırmacıların yapışma ve farklılaşma gibi çeşitli hücre davranışlarını yönlendirmek için spesifik ve iyi tanımlanmış fiziksel ve kimyasal ipuçlarına sahip yapılar geliştirmelerini sağlayarak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknikte yeniyseniz, saplarınızın kalitesini ve mikro kontak baskılı desenlerin aslına uygunluğunu sürekli olarak kontrol etmeyi unutmamalısınız.
Bu, ECM nano fiberlerinin ve nanoyapılarının uygun şekilde monte edilmesini sağlamak için gereklidir. Bu prosedüre başlamak için, elastomer tabanı ve sertleştirici maddeyi ağırlık başına 10 ila bir ağırlık oranında birleştirerek poli dimetil soane veya PDMS ön polimerini hazırlayın, tipik olarak 80 gram baz ve sekiz gram kürleme maddesi kullanılır. Ana kalıbı bir santimetre kalınlığında bir tabaka karışımında kaplamak için yeterli PDMS olduğundan emin olmak için ve PDMS'yi aşağıdaki karışıma ayarlanmış bir merkezcil karıştırıcı kullanarak DGA'lar İki dakika boyunca 2000 RPM, iki dakika boyunca 2000 RPM'de DGA'lar. Yeterince fakir.
Burada bir santimetre kalınlığında bir tabaka oluşturmak için ana kalıp üzerine PDMS ön polimer, PDMS dört saat boyunca 65 santigrat derecede pişirilerek. Sertleştikten sonra, PDMS damgasını oluşturmak için deseni içeren bölgeyi kesmek için bir neşter kullanın. Özellik tarafını PDMS damgasının arka tarafından ayırt etmek için.
Damganın arka tarafındaki köşelerden birinden bir çentik kesin. Bu işleme 25 milimetre çapındaki cam kapak fişlerini temizleyerek başlayın, kapak fişlerini bir saat boyunca% 95 etanol içinde sonikasyon yapın ve ardından 65 santigrat derece fırında kurutun. Daha sonra, poli ve izopropil akrilamid veya piam çözeltisini hazırlayın, piam'ı bir bütanol içinde %10'luk bir konsantrasyonda çözün, Döndürme kaplayıcının vakumlu aynasına temiz bir cam kapak kapağı ortalayın ve 200 mikrolitre boru Pam solüsyonunu pipetleyin yüzeyi tamamen kaplamak için cam yüzeye.
Kapak fişini bir dakika boyunca 6.000 RPM'de döndürün. PDMS damgalarını 30 dakika boyunca% 50 etanol içinde sonikasyon ile temizleyin ve daha sonra bir nitrojen kurutma akışı altında kurutun ve sonraki tüm adımlar, hücre dışı matris veya ECM nano yapılarının hücrelerle kullanılacağı uygulamalar için steriliteyi korumak için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Mikro kontak baskı adımı, bu prosedürün en zor yönüdür.
Kullanmadan önce PDMS damgalarını herhangi bir görünür kusur açısından incelemek önemlidir. Ayrıca, iki haftadan daha eski protein solüsyonu kullanmayın. PIAM kaplı kapak, kapalı bir Petri kabının içine kayar ve UV ışınlarına maruz kalarak sterilize edilir.
UV ışığı altında 45 dakikalık bir biyogüvenlik kabininde dinlenmeniz yeterlidir. Her PDMS damgasının desen yüzeyini 200 mikrolitre protein çözeltisi ile kaplayın. Fibronektin veya FN burada steril damıtılmış suda mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda kullanılır.
Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, bir saat sonra fazla proteini çıkarmak için PDMS damgalarını ve damıtılmış suyu yıkayın ve bir nitrojen akışı altında iyice kurulayın. Borunun erken çözünmesini önlemek için suyun tamamen çıkarılması önemlidir. Kapak kızağı üzerinde Pam kaplama ve yanlış protein transferi.
Gerekirse PDMS damgasının özellik tarafını boru PAM kaplı kapak kayma ile temas edecek şekilde yerleştirerek mikro temaslı baskı yapın. Hava kabarcıklarını gidermek ve beş dakika sonra düzgün temas sağlamak için damgaların arkasına hafifçe vurmak için forseps kullanın. Kapak fişinden PDMS damgasını soyun.
Bu aşamada. Çalışmaya bağlı olarak, daha karmaşık ve çok bileşenli yapılar oluşturmak için ek ECM proteinleri modellenebilir. ECM deseni yazdırıldıktan sonra, desenli boru PAM kaplı lameti 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve faz kontrast mikroskobu kullanarak desen doğruluğunu kontrol edin.
Desene bağlı olarak, desenin özelliklerini çözmek için bir CCD kamera gerekli olabilir. Floresan mikroskobu, ECM proteinlerinin floresan olarak etiketlenmesi koşuluyla deseni incelemek için de kullanılabilir. Desen doğruluğunu doğruladıktan sonra, Petri kabına üç mililitre 40 santigrat derece damıtılmış su ekleyin ve suyun yavaş yavaş soğumasına, borunun çözünmesine izin verin.
PAM tabakası ve ECM protein paternlerinin salınımı, faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Tipik olarak ECM protein nanoyapılarının serbest bırakıldığından emin olmak için su, 32 santigrat derece olan borunun düşük kritik çözelti sıcaklığının çok altındaki oda sıcaklığına soğutulur. Uygulama optik tekniklerin kullanımına izin vermiyorsa, çözelti sıcaklığı ölçülerek salınım izlenebilir.
Nano lifler ve diğer nano yapılar, boru PAM tabakasının serbest bırakılmasından sonra suda yüzecektir. Daha ileri uygulamalar için, nano kumaşların ve diğer nano yapıların manipüle edilmesi gerekir, ancak kesin yaklaşım deneysel hedefe bağlı olacaktır. Yüzey başlatmalı montajın veya SIA'nın, fiber boyutları üzerinde hassas kontrol ile ECM protein nano fiberlerini tasarlama yeteneğine sahip olduğunu göstermek için temsili sonuçlar burada sunulmaktadır.
50 mikrometre uzunluğunda ve 20 mikrometre genişliğinde bir dizi fibronektin dikdörtgeni, 40 santigrat derece DI suyunun piam kaplı bir örtü kayması ilavesi ve ardından alt kritik çözeltinin altında soğutulması üzerine desenlendi. Piamın sıcaklığı, piamın çözünmesini ve serbest bırakıldıktan sonra fibroin nano liflerinin salınmasını tetikledi. Lifler, doğal bir öngerilme altında oldukları için büzüldü.
Piam yüzeyine desenlendiğinde, serbest bırakma öncesi fibronektin nanofiber boyutlarının Alice analizi, bunların ortalama uzunluğu 50.19 artı veya eksi 0.49 mikrometre ve ortalama genişliği 19.98 artı veya eksi 0.17 mikrometre olan mono dispers olduklarını ortaya çıkardı. Serbest bırakıldıktan sonra, nano lifler kayda değer bir şekilde büzüldü, ancak ortalama 14.15 artı veya eksi 0.92 mikrometre uzunluğunda ve ortalama 2.65 artı veya eksi 0.32 mikrometre genişliğinde mono dispers kaldı. Atomik kuvvet mikroskobu, SIA salım süreciyle ilişkili fiber boyutsal değişikliklerinin daha yüksek çözünürlüklü bir perspektifini sağladı.
Özellikle, serbest bırakma öncesi lifler yaklaşık beş nanometrelik tek tip bir kalınlığa sahipken, serbest bırakma sonrası lifler, uzunluk ve genişlik azalırken birkaç yüz nanometre mertebesinde bir kalınlığa sahipti. SIA prosesini kullanarak, ayarlanabilir boyut, şekil ve bileşime sahip çeşitli ECM protein nanoyapılarını tasarlamak mümkündür. Örneğin, başlangıçta 20 mikrometre genişliğinde ve bir santimetre uzunluğunda fibronektin nano lifleri bir boru üzerine desenlendi.
Soğutma ve boru üzerine PAM kaplı kapak kayması. Pam çözünmesi, nano lifler, yaklaşık üç mikrometre genişliğinde azaltılmış uzun iplikler oluşturarak serbest bırakıldı. Ayrıca, desen, mikro kontakt baskı için kullanılan PDMS damgasının yüzey topografyası ile tanımlandığından, kavram kanıtı olarak karmaşık ECM protein nanoyapılarını tasarlamak mümkündür.
Çok kollu fibroin yıldızları yaratıldı. Termal salınım kolların kasılmasına neden oldu, ancak kolların birleştiği yıldızın merkezi bölgesi değil. SIA ayrıca laminat veya LN gibi diğer ECM proteinleri ile de çalışır ve birden fazla ECM proteini aynı yapıya dahil edilebilir.
Bu örnekte, ortogonal birbirine bağlı, kırmızı ile gösterilen 20 mikrometre genişliğinde fibronektin çizgileri ve yeşil renkte gösterilen 50 mikrometre genişliğinde laminin çizgileri, bir 2D nano kumaşa entegre edildi ve daha sonra serbest bırakıldıktan sonra serbest bırakıldı, her iki nano lif türü de büzüldü, ancak genel ara bağlantı ve kare kafes yapısı korundu. Bu sonuçlar, SIA'nın çeşitli bileşimlere ve yapılara sahip ECM malzemelerini tasarlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Son olarak, ECM nano fiberlerinin bazı başarısız SIA örnekleri gösterilmiştir.
Bunun bir nedeni, ECM proteininin piam yüzeyine zayıf transferi nedeniyle eksik bir modelin yanlış salınmasıdır. Mikro kontakt baskı sırasında, deliklerin, düzensiz kenarların ve diğer kusurların varlığı, eksik ve serbest bırakıldığında kırılmaya ve parçalanmaya eğilimli nano lifler ve nanoyapılar oluşturacaktır. Boru PAM'inin hızlı çözünmesi, serbest bırakıldıktan sonra zayıf desen doğruluğuna da neden olabilir.
Örneğin, 20 santigrat derece su kullanarak, zaten düşük kritik çözeltinin altında bir sıcaklık. Piamın sıcaklığı, piamın hızla şişmesine ve çözünmesine neden olur. Bu, nano liflerin 32. görüntüde gösterildiği gibi geri çekilmesine ve kırılmasına ve 52 saniyelik görüntüde gösterildiği gibi rastgele düzensiz konfigürasyonlar oluşturmasına neden olabilir.
Bu işleme başlamadan önce, PDMS'nin durumu kusurlardan kaynaklanır ve ayrıca tüm yüzeylerin tozsuz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, uygun protein transferini önleyecek ve AC yapılarının zayıf bir şekilde monte edilmesine yol açacaktır. Bu prosedürü takiben, salınan nano lifler veya nanoyapılar, protein liflerinin mekanik özelliklerini analiz etmek veya doku mühendisliği için iskele olarak kullanmak gibi bir dizi şey yapmak için kullanılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, ECM protein nano liflerinin ve nanoyapılarının ayarlanabilir kompozisyon, geometri ve mimari ile nasıl tasarlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Özellikle, ECM proteinlerinin baskı desenlerinin piton kaplı cam kapak fişlerine nasıl mikro temas ettirileceğini ve ardından ECM yapılarını birleştirmek için yüzeyin çözünmesini termal olarak nasıl tetikleyeceğinizi anlayacaksınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücre dışı matris proteinlerinden bağımsız nanofiberler ve karmaşık nanoyapılar mühendisliği için bir yöntemi açıklamaktadır. Teknik, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları için uygun malzemeler oluşturmak üzere yüzeyle başlatılan montajı kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Doku Mühendisliği
- Nanoteknoloji
Arka Plan
- Hücre dışı matris proteinleri, doku yapısı ve fonksiyonunda önemli bir rol oynar.
- Nanofiberler ve nanoyapılar doğal doku ortamlarını taklit edebilir.
- Yüzeyle başlatılan montaj, malzeme özellikleri üzerinde hassas kontrol sağlayan bir tekniktir.
- Bağımsız protein bazlı malzemeler oluşturmak, çeşitli alanlardaki uygulamalarını artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre dışı matris proteinlerinden nanofiberler ve nanoyapılar üretmek için bir yöntem geliştirmek.
- Malzeme tasarımı için protein-yüzey etkileşimlerini kullanmak.
- Doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarını keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Desenli ana kalıptan poli dimetil siloksan (PDMS) damgaların hazırlanması.
- PDMS damgalarının hücre dışı matris protein çözeltisi ile kaplanması.
- Poly N-izopropil akrilamid (PIPAAm) kaplı cam kapak üzerine mikro temas baskısı.
- Montajlanmış nanoyapıların salınmasını tetiklemek için kapak üzerindeki nemlendirme ve soğutma işlemi.
Ana Sonuçlar
- Bağımsız protein bazlı nanofiberler ve nanoyapıların başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Malzemelerin bileşimi ve mimarisinde ayarlanabilirliğin gösterilmesi.
- Doku mühendisliği ve biyoteknoloji alanlarındaki çeşitli alanlarda potansiyel uygulamalar.
- Yöntemin deneysel sonuçlarla doğrulanması.
Sonuçlar
- Yöntem, protein bazlı malzemeleri mühendislik için çok yönlü bir yaklaşım sağlar.
- Yüzeyle başlatılan montaj, karmaşık nanoyapıların oluşturulması için etkilidir.
- Bu malzemeler, doku mühendisliği uygulamalarını ilerletmek için önemli potansiyele sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Engineering extracellular matrix (ECM) protein nanofibers and nanostructures with precise control over composition, geometry, and architecture enables biopharma R&D to recapitulate native tissue microenvironments for predictive modeling. This capability supports target validation and phenotypic screening by providing disease-relevant systems that modulate cellular adhesion, differentiation, and apoptosis. Surface-initiated assembly (SIA) offers a mechanistic de-risking approach to generate tunable ECM materials for preclinical model development and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled presentation of ECM proteins to assess target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Provides reproducible, well-defined nanostructures to reduce biological variability in early-stage target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized ECM nanofiber substrates for quantitative phenotypic screening of compound effects on cell behavior.
- Operational Value: Supports assay standardization and scalability via microcontact printing of defined protein patterns for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system engineering by incorporating multi-component ECM proteins (fibronectin, laminin, fibrinogen, collagens I/IV) to mimic tissue-specific microenvironments.
- Operational Value: Enables predictive confidence in preclinical model selection through tunable scaffold architecture that directs cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
Surface-initiated assembly integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing tunable ECM materials that inform lead identification and risk-adjusted advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM protein composition and nanostructure geometry to probe mechanotransduction signaling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanofiber arrays with quantifiable dimensional outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides measurable fiber dimensions (length, width, thickness) and release kinetics as quantitative readouts to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through engineered ECM nanostructures that maintain structural integrity and support longitudinal cellular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating custom ECM nanostructures across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through biomimetic ECM presentation that reduces mechanistic ambiguity in cellular response interpretation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via surface-initiated assembly protocol and microcontact printing fidelity controls.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on cell adhesion, differentiation, and apoptosis in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on performance in disease-relevant ECM nanostructure models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein surface chemistry, microcontact printing, and thermally responsive polymer handling.
- Depends on instrumentation for PDMS stamp fabrication, spin coating, and environmental control during thermal release.
- Necessitates cross-team standardization of protein solution preparation, stamp cleaning, and pattern inspection to ensure fidelity.
- Involves adaptation considerations when extending to different ECM proteins or multi-component nanostructures.
- Practical limitations include sensitivity to protein solution age, stamp defects, and temperature control during PIPAAm dissolution affecting nanostructure integrity.
