Kapsamlı Cochlear Proteome tanımak için aşağıdan yukarıya ve Shotgun Proteomiks

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çeşitli proteomik teknikler kullanarak koklear duyusal epitelden en fazla sayıda protein tanımlamasını elde etmektir. Bu, ikinci adım olarak protein elde etmek için koklea, duyusal epitelin yetişkin farelerden izole edilmesi ve lizis tamponunda sonikat ile elde edilir. Peptit ve protein dizisi kapsamını arttırmak için tüm lizata veya fraksiyone protein lizatına farklı sindirim stratejileri uygulanır.

Daha sonra, kütle spesifikasyon analizinden önce numune karmaşıklığını azaltmak için güçlü katyon değişimi ve ters faz kromatografisi dahil olmak üzere farklı ayırma teknikleri kullanılır. Sonuçlar, çoklu proteomik yaklaşımlar ve yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi kullanılarak fare koklea duyusal epiteli için çok sayıda zar ve çözünür proteinin tanımlandığını göstermektedir. Bu tekniğin antikor mikroarray ve iki boyutlu jel elektroforezi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok sayıda hem çözünür hem de membran proteininin tanımlanması ve dolayısıyla koklear proteom verilerinin artmasıdır.

Bu yöntem, işitme ve yırtılma bozuklukları ile ilgili biyobelirteçler hakkında bilgi sağlayabilse de, yaş ve meme veya akciğer kanseri ile ilgili biyobelirteçlerin tanımlanması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntem, kan gibi diğer biyolojik örneklerin incelenmesine de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, memeli iç kulağından elde edilen sınırlı proteomik veri setini ve özellikle bu prosedüre başlamadan önce tanımlanmış olan sınırlı sayıda zar proteinini gözlemlediğimizde aklımıza geldi.

Koklear duyusal epiteli doğum sonrası 30 gün farelerinden izole edin. Dokuyu bir x fosfat tamponu ile yıkadıktan sonra, dokuya 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve karışımı sonik bir parçalayıcı kullanarak buz üzerinde 30 saniye boyunca sonikleştirin. Her sonikasyon arasında bir dakika boyunca buz üzerinde lizatı soğutun, ardından numuneyi toplam üç kez sonikleştirin.

Centra, süspansiyonu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de kaynaştırdı. Bittiğinde, süpernatanı sindirim için saklayın. Bunu takiben, 30 mikrolitrelik bir koklear protein ekstraktını doğrudan 30 K'lık bir spin filtreye ekleyin ve Riss HCL santrifüjünde 200 mikrolitre sekiz molar üre ile karıştırın.

Karışım 15 dakika boyunca 14.000 kez G'de. Bittiğinde, konsantreyi 200 mikrolitre sekiz molar üre çözeltisi ile seyreltin ve daha önce olduğu gibi aynı koşulları kullanarak santrifüjlemeyi tekrarlayın. Daha sonra, filtredeki konsantreye 10 mikrolitre 10 XI oto asetamid ve 90 mikrolitre sekiz molar üre çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca girdap yapın.

Spin filtresini bir mikro santrifüj rafına yerleştirdikten sonra, 14.000 kez G'de 10 dakika boyunca mikrolitre başına 0.1 mikrogram endo proteaz ly C'de bir ila 50 enzim / protein oranında santrifüjlemeyi takiben karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve karışımı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bittiğinde, filtre ünitesine 40 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin Önceki adımı tekrarladıktan sonra, filtre ünitesini 40 mikrolitre sekiz molar üre ile yıkayın. Ardından filtre ünitesini iki kez 40 mikrolitre mili Q su ile yıkayın.

Filtre ünitesi 100 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ile üç kez yıkandıktan sonra, bir ila 100 enzim / protein oranında mikrolitre tripsin başına 0.4 mikrogram ekleyin ve karışımı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, filtre ünitesine 40 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyerek triptik peptitleri elüte edin ve karışımı 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından bu adımı bir kez daha tekrarlayın.

Bu noktada, 50 ila 100 mikrogram sindirilmiş protein örneğini 200 x 2.1 milimetre beş mikrometre gücünde bir katyon değişim kolonuna enjekte edin Peptitleri ayırmak için, peptit fraksiyonlarını 280 nanometrede izleyin ve fraksiyonları iki dakikalık aralıklarla toplayın. Bir fraksiyon toplayıcı kullanarak, fraksiyonları bir vakum yoğunlaştırıcıda kurutun. Bittiğinde, kurutulmuş fraksiyonları sıvı kromatografisi için kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Tandem kütle spektrometresi analizi. Başka bir yaklaşımda, protein karışımını ayırmak için jel içermeyen fraksiyonlama kullanıldı. Koklear protein süpernatanı aseton çökeltme ile tuzdan arındırıldıktan sonra, daha önce 112 mikrolitre Milli Q suyunda süspanse edilmiş tuzdan arındırılmış proteine 30 mikrolitre beş x numune tamponu ekleyin.

Daha sonra, bir molar DTT'den sekiz mikrolitre ekleyin ve protein disülfür bağlarını azaltmak için karışımı beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Isıttıktan sonra karışımın soğumasını bekleyin. Anot haznesine sekiz mililitre çalışma tamponu, numune toplama haznesine 150 mikrolitre çalışma tamponu ve katot haznesine altı mililitre çalışma tamponu ekleyin.

Bu yüklemeyi takiben, 150 mikrolitre koklear protein karışımı, 3,5 ila 150 kilodalton kütle aralığına sahip %8'lik bir tris asetat kartuşu kullanılarak numune yükleme odasına yerleştirilir. Çalıştırmaya başladıktan sonra, bir pipet kullanarak cihaz üzerinde duraklatılan her aralıkta numune toplama odasından numuneyi toplayın ve yeni etiketlenmiş bir mikro tüpe ekleyin. Daha sonra toplama haznesini 150 mikrolitre çalışma tamponu ile iki kez yıkayın ve atın.

Jel içermeyen fraksiyonların 1D jel elektroforezini takiben. Her bir fraksiyonu doğrudan 30 K'lık bir filtre ünitesine ekleyin. Daha sonra, 25 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjlemeyi takiben her bir fraksiyonu tris HCL'de 200 mikrolitre sekiz molar üre ile karıştırın, her filtre ünitesindeki konsantreye üre çözeltisinde 10 mikrolitre 10 XI oto asetamid ekleyin ve bir dakika boyunca girdaplayın.

Döndürme filtrelerini bir mikro santrifüj rafına yerleştirdikten sonra, numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, 30 santigrat derecede gece boyunca inkübasyonu takiben filtre ünitelerine bir ila 50 enzim / protein oranı için mikrolitre LY C başına 0.1 mikrogram ekleyin, spin filtrelerine 40 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve önceki adımı bir kez tekrarladıktan sonra numuneleri 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin, Sıkma filtrelerini 100 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ile üç kez yıkayın, son yıkamadan sonra bir ila 100 enzim / protein oranında mikrolitre tripsin başına 0.4 mikrogram ekleyin. Numuneler gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildikten sonra, 40 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyerek her bir filtre ünitesinden triptik peptitleri elüte edin ve numuneleri 10 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin.

Bunu tekrarladıktan sonra, bir kez adım atın, numuneleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ile analiz edin. Kullanılan iki çift sindirim prosedürü vardı. Birincisi bir triptik sindirimiydi, ardından güçlü bir katyon değişim sütunu üzerinde 18 fraksiyona bölünen ve nano sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi ile analiz edilen tripsin ile ikinci bir sindirim yapıldı.

Tek süreli sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi gerçekleştirilirken %1'lik bir FDR ile toplam 1.485 protein tanımlandı. Bu deneysel yaklaşımı kullanarak. Tanımlanan proteinler arasında 324 ve 258 protein sırasıyla mitokondri ve plazma zarı olarak kategorize edildi.

İkinci çift sindirim prosedürü, lys C sindirimi ve ardından tripsin sindiriminden oluşuyordu. Her bir sindirim ayrı ayrı yüklendi ve güçlü katyon değişim kolonuna 18 fraksiyona ayrıldı ve nano sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ile analiz edildi. LY C ve tripsin sindirimlerinin sonuçları,% 1 FDR ile toplam 3.503 protein üretti.

Ek olarak, 605 ve 617 protein sırasıyla mitokondri ve plazma zarında kategorize edildi. Bu yaklaşım, zarla ilişkili protein kimliklerinin en fazla sayısını sağladı. LY C ve tripsinin çift analizi.

Fraksiyonlar, tanımlanan proteinlerin 65'inden fazlasının deneyler arasında paylaşıldığını gösterdi. Bununla birlikte, replikat analizinde yeni tanımlanmış proteinler de vardı. Ek peptitler ve proteinler, kromatografideki küçük değişiklikler nedeniyle tanımlandı, bu nedenle parçalanma için farklı peptitlere yol açtı.

Jel içermeyen fraksiyonlamanın sonuçlarını gösterildiği gibi görselleştirmek için bir gümüş leke jeli hazırlandı. Burada jel, her ardışık fraksiyon için moleküler ağırlığı artırarak protein ayrımı gösterdi. Bu nedenle, 12 jel içermeyen sıvı fraksiyonu, iki farklı çok yüzlü sindirim yaklaşımı kullanılarak sindirildi ve sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ile analiz edildi.

İlk sindirim yaklaşımı, tek süreli bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi gerçekleştirilirken %1'lik bir FDR ile 2.165 proteinin tanımlanmasına yol açan bir çift tripsin sindirimi kullanılarak gerçekleştirildi. Bu deneyde 516 ve 399 protein mitokondri ve plazma zarında kategorize edildi. İkinci sindirim yaklaşımı, endo proteinaz ly C kullanılarak gerçekleştirildi, ardından tripsin sindirimi, tek çalışmalı sıvı kromatografisi yapıldı.

Tandem kütle spektrometresi analizi,% 1 FDR'ye sahip 2.211 protein tanımladı. Bu yaklaşım, tripsin tripsin yaklaşımı kullanılırken olduğu gibi benzer sayıda zarla ilişkili protein gösterdi, kütle spektrometresi proteomik verileri, veri seti tanımlayıcısı PXD 0 0 0 2 3 1 ile Proteom Değişim Konsorsiyumu'na yatırıldı. Bu prosedürü denerken, protein bozulmasını önlemek için protein ekstraksiyonu yaparken her adımda kontaminasyondan kaçınmayı ve dokuyu buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.