Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, saflaştırılmış hematopoietik progenitörlerin, evlat edinme transferi üzerine bağırsak pire yamalarında plazmasitoid dendritik hücrelere yol açma yeteneğini incelemektir. Bu, ilk olarak dendritik hücre büyüme faktörünü kodlayan plazmidin hidrodinamik gen transferinin gerçekleştirilmesiyle gerçekleştirilir. PI'nin yama plazmasitoid dendritik hücre bozukluğu farelerine üç ligand uçurun.

İkinci aşamada, ortak dendritik progenitör hücreler, manyetik boncuk ayırma ve akış sıralama ile vahşi tip kemik iliğinden izole edilir. Son adımda, progenitör hücreler, hidrodinamik gen transferi ile tedavi edilen pyres yama plazmasitoid dendritik hücre bozulmuş farelere intravenöz enjeksiyon yoluyla evlat edinilmiş olarak transfer edilir. Sonuç olarak, donör hematopoietik progenitör hücreden türetilen PI'nin yama plazmositoid dendritik hücre popülasyonu akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

Bu yöntem, korsan yamaları içinde lokalize olan plazma Cy Dendri hücrelerinin gelişimsel kökeni gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, pyres yama plazmasitoid dendritik hücrelerin kökeni hakkında fikir verebilir. Plazmasitoid dendritik hücrelerin bu dokulardaki lenfosit popülasyonlarını nasıl etkilediğini anlamak için de uygulanabilir.

Evlat edinme transferinden iki gün önce, beş CD 45 2 pozitif interferon alfa reseptörü nakavt alıcı farenin kan damarlarını bir ısı lambası altında beş ila 10 dakika boyunca genişletin. Daha sonra her fare için hayvanı bir kısıtlayıcıya yerleştirin ve kuyruğu% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra, beş mikrogram plazma enjekte etmek için 27 gauge bir iğne kullanın ve her bir hayvanın kuyruk damarına üç ligand ve iki mililitre steril PBS kaplayın.

Kontrol kohortu için beş mikrogram boş vektör enjekte edin. Fareleri 15 ila 30 dakika izledikten sonra, onları barınma tesislerine geri koyun. Deney gününde, 10 konjenik CD 45 1 pozitif C 57 siyah altı fareden disseke edilmiş femur ve tibiayı tam besiyeri içeren bir kültür kabına yerleştirin.

Daha sonra her kemiğin bir ucuna 27 gauge bir iğne sokun ve kemik iliğini kemik başına üç kez tabağa akıtmak için tam ortam kullanın. Dışarı atılan ortamın bulanık göründüğünü doğrulayarak kemik iliği hücrelerinin çıkarıldığından emin olun. Ortamı kültür kabında üç ila beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon yapın.

Daha sonra kemik iliği hücrelerini 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek kalıntıları temizleyin ve steril bir şırınga pistonunun ucunu nazikçe uygulayarak hücre kümelerini bozun. Süzgeç üzerinde, hücreleri aşağı doğru döndürün, süpernatanları çıkarın ve kırmızı kan hücrelerini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca dört ila altı kez 10 ila yedinci hücrelere iki mililitre lizis tamponunda bitleyin. Daha sonra kemik iliği hücrelerine 10 mililitre faks tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 500 kez G'de dört dakika döndürün.

Malzemeyi nazikçe aspire ettikten sonra, peleti 10 mililitre faks tamponunda yıkayın. Daha sonra, antikor boyama ve yıkamayı takiben hücreleri antikorları tanıyan hematopoietik soy markörü ile boyayın. Hücreleri keçi sıçan önleyici manyetik mikro boncuklarla inkübe edin.

Mikroboncuk inkübasyonu sırasında, bir MIDI max hücre ayırıcısına bir max LD sütunu yükleyin ve sütunu iki mililitre faks tamponu ile önceden durulayın. Daha sonra sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin ve sütuna 2,5 mililitrelik faks arabelleğinde sekizinci hücrelere beş kez 10 ila 10 tane yükleyin. Sütunu, yıkama başına iki mililitre faks arabelleği ile üç kez yıkayın ve sütundan geçen köken negatif hücrelerini 15 mililitrelik tüpe toplayın.

Kaçan hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri uygun floresan konjuge antikorlarla boyadıktan sonra, ortak dendritik progenitörleri istenen işaretleyici profiline göre sıralamak için numuneyi bir faks tüpüne aktarın. Faksla saflaştırılmış hücreleri, beş mililitre tam ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve ardından faks çalışmasının sonunda sıralanan hücrelerin mutlak sayısını kaydedin.

Döndürüldükten sonra, hücreler, fare başına 100 mikrolitre toplam steril PBS hacmi başına saflaştırılmış ortak dendritik progenitörlerin beşte biri kadar bir kez seyreltilir ve hücre süspansiyonlarını 27 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya aspire eder. Daha sonra, CD 45 1 pozitif progenitör hücreleri, evlat edinme transferinden yedi ila 10 gün sonra gösterildiği gibi, her alıcı CD 45 2 pozitif interferon alfa reseptörü nakavt faresinin kuyruk damarına enjekte edin. Ortak dendritik hücre progenitörü enjekte edilen farelerden bağırsakları çıkarın, dokuları PBS'ye batırılmış kağıt havluların üzerine yerleştirin.

Ardından, ince bağırsağın duvarı boyunca görünen tüm ateş lekelerini toplamak için bir çift ince forseps ve makas kullanın. Odun yığınlarının genellikle tek bir fare içinde bile yapısal olarak farklı olduğunu unutmayın, bu nedenle tüm P'S yamalarının tanımlandığından ve incelendiğinden emin olun. İzole edilmiş P'S yamalarını, dışkıyı çıkarmak için forseps kullanarak PBS içeren bir Petri kabında üç kez yıkayın.

Daha sonra P'S yamalarını mililitre başına bir miligram ile sindirin, 50 mililitrelik bir şişede 10 mililitre HBSS'de dördünü 37 santigrat derecede kuvvetlice karıştırarak kollajenaz edin. Bir saat sonra, sindirilmiş PI yamalarını 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine dökün ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe zorlamak için steril bir şırınga pistonu kullanın. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu döndürdükten sonra, peleti çağrı başına altı mililitre% 37'lik bir çözelti içinde yeniden süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından, çağrı başına adım gradyanı oluşturmak için altına altı mililitre çağrı başına %70 solüsyon yerleştirin. Şimdi hücreleri, kopma ile oda sıcaklığında 800 kez G'de 20 dakika boyunca ayırın. Daha sonra arayüzdeki mononükleer hücre popülasyonunu toplayın.

Toplanan hücreleri peletledikten sonra, 50 mililitre tam ortamda iki kez yıkayın. Daha sonra CD 45 1 pozitif PYS yamasını tespit etmek için bunları uygun antikorlarla boyayın. Evlat edinerek transfer edilen CD 41 pozitif progenitörlerden türetilen plazmositoid dendritik hücreler.

Hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Plazmositoid dendritik hücreler CD 11 C pozitif, clec H pozitif, PDCA bir pozitif, B iki pozitif, CD 11 B negatif fenotipi ile tanımlanabilir. Son olarak, bu denklemi kullanarak plazmasitoid dendritik hücrelerin mutlak sayısını belirleyin.

Bu nokta grafikleri, ortak dendritik progenitörlerin izolasyonu için geçit stratejisini gösterir. Fare kemik iliği hücreleri için, az önce gösterildiği gibi, ortak dendritik progenitörler toplam kemik iliği hücrelerinin yaklaşık% 0.1'ini ve kabaca dört ila altı çarpı 10 ila dördüncüsünü oluşturur. Bu hücrelerden, PI'nin yama plazmasitoid dendritik hücrelerini akış sitometrisi ile tanımlamak için bir fareden izole edilebilir.

İlk olarak ileri ve yan saçılma geçitleme stratejisi kullanılır, ardından CD 11 C pozitif clec H pozitif hücreler için geçit yapılır. İnterferon alfa reseptörü nakavt fareleri, vahşi tip farelere göre pys yama plazmasitoid dendritik hücrelerinde önemli bir azalma sergiler. Ortak dendritik progenitör hücreler ayrıca geleneksel dendritik hücrelere farklılaşır.

Plazmositoid dendritik hücrelerin aksine, CD 11 C pozitif, clec H negatif, konvansiyonel dendritik hücreler hem vahşi tip hem de nakavt farelerde benzer miktarlarda gözlenir. Bu nedenle, interferon alfa reseptörü nakavt fareleri, ölümcül ışınlamanın etkileri olmadan PS yaması plazmasitoid dendritik hücre sulandırmasını inceleme fırsatı sağlar. Yabani tip ortak dendritik progenitörlerin, az önce gösterildiği gibi, interferon alfa reseptörü nakavt farelerine evlat edinici transferi, PI yama plazmasitoid dendritik hücrelerinde bir artışı uyarır.

Ayrıca, FL üç ligand hidrodinamik gen transferi ile ön işlem, PI yamalarında plazmasitoid dendritik hücre genişlemesini daha da arttırır, bu da transfer edilen ortak dendritik progenitörlerin ve muhtemelen endojen FL üç pozitif progenitörlerin, pirus yaması plazmositoid dendritik hücreleri indükleyerek FL üç ligandına yanıt verdiğini ima eder. Her iki koşul da konvansiyonel dendritik hücrelerin gelişimsel kökeni ile tutarlı olarak CD 11 C pozitif clec H negatif konvansiyonel dendritik hücre üretimini uyarır. PYS yama plazmasitoid dendritik hücreler, clec H, PDCA bir ve B iki 20 ve LAC CD 11 dahil olmak üzere geleneksel plazmasitoid dendritik hücre belirteçlerini eksprese etti B.In ek olarak, hem FL üç ligand hidrodinamik gen transferi alan hem de transfer edilen ortak dendritik progenitörleri alan interferon alfa reseptör nakavt farelerinden alınan PYS yamalarının analizi, plazmositoid dendritik hücrelerin yaklaşık% 70'inin donör CD 45 1 pozitif ortak dendritik progenitörlerden türetildiğini göstermektedir.

Toplu olarak, bu veriler, ortak dendritik progenitörlerin evlat edinici transferinin, in vivo FL üç ligand aracılı sinyallere yanıt olarak PI'lerin yama plazmositoid dendritik hücre popülasyonunu indüklediğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, pars yama plasmacytoid D hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.