4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi
January 30th, 2014
Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.
Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan zebra balığı kafasındaki faringeal ark hareketlerini gözlemlemek ve karakterize etmektir. Bu, önce bir transgenik zebra balığı embriyosunun anestezik akrost jeli içine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, agaroz gömülü embriyoyu bir mikroskop lamı üzerine bir damla Metilselüloz içine monte etmektir.
Daha sonra, embriyo iki mikroskop lamı arasına vakum gresi ile kapatılır. Sonuç olarak, vahşi tip ve mutant zebra balığı arasındaki farkları ve faringeal kemerlerin morfogenetik hareketlerini göstermek için hızlandırılmış konfokal mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin statik görüntüleme yöntemlerine göre en büyük avantajı, faringeal ark gelişimini gerçek zamanlı olarak yakalaması ve bir araştırmacının morfogenez için kritik olan doku hareketlerini doğrudan gözlemlemesine izin vermesidir.
Köprülü bir kapak kayması yapmak için, 24 x 60 kapak camının her iki ucuna 22'ye 22 kapak camı süper yapıştırıcı sürün. Ortayı boş bırakmak. Bir günden küçük embriyolar için bekarlar yapın.
Bir ila dört günlük embriyolar için iki katına çıkar veya beş gün veya daha büyük embriyolar için üçlü. Ve her örnek için iki köprülü lamel kullanın. Şimdi 10 mililitrelik bir şırıngayı yüksek vakumlu gres ile doldurun.
% 0.2 sıvı aros içinde taze anestezik hazırlayın ve 42 santigrat derece ısıtma bloğunda muhafaza edin. Yumurtadan çıkmamış transgenik embriyoları manuel olarak kaplamak için, embriyo serbest kalana kadar Corian'ı yavaşça yırtın. Şimdi kaplanmış embriyoları MS 2, 22 ve estetik içeren temiz besiyerine aktarın.
Köprülü bir kapak kaymağı hazırlamak için, vakum gresini şırıngadan yavaşça dışarı itin, köprülerin bitişiğinde ve içinde ve kapak kaymasının kenarında pürüzsüz, sürekli bir boncuk oluşturun. Kaymayı kapatmak için köprünün ortasına %4 Metilselülozdan oluşan bir daire yayın. Embriyo uyuşturulduğunda, bir cam pipete çekin.
Embriyonun pipetteki sıvının dibine çökmesini sağlamak için pipeti dikey olarak tutun. Daha sonra pipeti agro solüsyona yerleştirin ve embriyonun sıvıyı dışarı atmadan arosun içine düşmesine izin verin. Pipetin içine biraz agro solüsyon ve embriyo çizin.
Daha sonra embriyoyu bir damla aro çözeltisi içinde dışarı atın. Metilselülozun üstünde. Embriyoyu metilselülozun üzerine doğru itin ve numuneyi mühürlemek için görüntüleme için embriyoyu istediğiniz gibi yönlendirin.
Aşağı bakacak şekilde monte edilmiş olanın üzerine bir köprülü kapak kızağı yerleştirin. Köprüler doğrudan temas edene ve agros her iki kapak kızağına contaları düşürene kadar sandviç örtü kızaklarının her iki tarafına eşit basınç uygulayın. Embriyonun uygun şekilde yönlendirildiğini doğrulayın.
Vakum gres hızındaki çatlakları ve boşlukları düzeltmek için cam boyunca ahşap bir aplikatör sürün. Kenarlardaki fazla yağı silin. Konfokal mikroskobu ve harici lazer cihazlarını etkinleştirin.
Ayrıca konfokal mikroskoba bağlı bilgisayarı açın ve sistemi ve konfokal görüntüleme yazılımını başlat'ı seçin. Ardından, konfokal mikroskobun evreleme platformunu indirin ve objektif lensleri yerlerinden çıkarın. Varsayılan aşamayı elektronik ısıtmalı bir aşama ile değiştirin.
Isıtmalı aşama için denetleyiciyi açın ve sıcaklığı 29,5 santigrat dereceye ayarlayın. Monte edilen numuneyi ısıtılmış tablaya yerleştirin. 20 x objektif lensini yerine getirin ve sahneleme platformunu kaldırın.
Ardından görünür ışık yayıcıyı etkinleştirin ve embriyonun kafasını görüş alanında ortalayın. Floresan kanallarını etkinleştirmek için, algılanacak floresan dalga boyunu seçin ve her kanal için renk arama tablolarını seçin. Her floresan kanalı için lazer yoğunluğunu 10.0'a ve foto çarpan voltajını 600 ile 700 arasında ayarlayın.
Arka planı azaltmak ve toplanan floresan bilgilerini artırmak için ortalamayı iki veya dört olarak ve bit derinliğini 16 bit olarak ayarlayın. ZS yığınını ve zaman serisi modüllerini etkinleştirin. Gerekirse iğne deliğini ayarlayın.
Denemenin zaman aralığını ve uzunluğunu ayarlayın. Kamerayı canlı moda çevirin. Odağı ayarlayın ve gerekirse lazer yoğunluğunu artırın.
Floresan görmek için. Daha geniş bir görünüm için dijital yakınlaştırmayı 0,6'ya ayarlayın. İstenirse.
Sahneyi, ilgilenilen tüm yapılar görünür olacak ve görüş alanında büyüme için yer olacak şekilde konumlandırın. Dorsal ve anterior olarak embriyo boyunca floresanın üst ve alt sınırlarına odaklanır. İlk ve son Zack dilim konumlarını bu sınırların en az 100 mikrometre veya daha fazla ötesine ayarlayın.
Ardından, görüntü arama tablosunu, floresan yapıların gri bir tonda görünmesi ve alanın geri kalanının mavi veya siyah olması için aralık göstergelerine ayarlayın. Gerekirse, fotoğraf çarpanı voltajını doymuş kırmızı piksellerin göründüğü yerin hemen altındaki bir seviyeye yükseltin. Floresan yapılar kırmızı görünüyorsa, lazer yoğunluğunu ve/veya kazancı gri bir ton olana kadar azaltın.
Gerekirse, ofseti ayarlayın. Bu nedenle numunenin dışındaki alanlar mavidir. Görüntülerin zamanında toplanmasını sağlayan en küçük çap için ayarlayın.
Z aralığı her zaman iğne deliği çapı için önerilen en uygun mesafeye ayarlanmalı, ayarları test etmek için her zaman mümkün olan en düşük lazer yoğunluğunu kullanarak kısa taramalar yapmalıdır. Şimdi denemeyi istediğiniz süre boyunca çalıştırın. Daha sonra, embriyoyu ısıtılmış aşamadan çıkarın ve kapak fişlerini yavaşça ayırın, kapağı, slipi ve embriyoyu 30 milimetrelik bir Petri kabına daldırın.
Bir cam pipet kullanarak, embriyoyu kapak fişinden nazikçe yıkayın ve kapak fişini Petri kabından çıkarın. Gelişmeye devam etmek için embriyoyu 28,5 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Deneylerin sonunda, deneylerin başında örneğe benzer şekilde sahnelenen, ancak bir EM ve 28.5 santigrat derece inkübatör yetiştirilen agros'a monte edilmiş kardeş embriyoların bireysel Zack görüntülerini alın.
Yabani tip embriyolarda konfokal yazılım veya diğer görüntüleme işleme yazılımlarını kullanarak faringeal kemerleri gerektiği gibi ölçün. Nöro kret popülasyonunu takiben, faringeal arklar rostral yönde hareket ederken anterior posterior ve dorsal ventral AE'ler boyunca uzar. Ön ucunda, ilk faringeal ark, oral ektoderm anahtarı morfogenetik hareketlerle ayrılan maksiller ve mandibular alanları oluşturur, düzleştirilmiş mutantlarda büyük ölçüde bozulur.
Burada yedinci faringeal ark, döllenmeden 48 saat sonra daha ön kemerlerle örtüşecek şekilde roly göç edemez. Zebra balığı SM beş mutantının çok sayıda kraniyal yüz kusuru vardır. Bu statik konfokal görüntülerde.
İkinci ve üçüncü kemerlerin ventral alanlarındaki füzyonlar, döllenmeden 32 saat sonra belirgindir. Hızlandırılmış konfokal mikroskopi kullanarak, faringeal arkların morfogenezini analiz ediyoruz. Smad'da, ikinci ve üçüncü kemerler arasındaki beş mutant füzyonu ilk olarak döllenmeden 32 saat sonra ortaya çıkar.
Statik analizle tutarlıdır. PDGF ailesi üyeleri ifadesi geniş ölçüde faringeal ark morfogenezi ile ilgili olabileceğini düşündürse de, posterior arkların hareketi normal görünmektedir. P-D-G-F-R-A mutantlarında, özellikle bozulmuş görünen ilk faringeal arkın morfogenezidir.
Bu prosedür, morfo enjeksiyonu veya genetik mozaiklerin oluşturulması gibi yaygın olarak kullanılan diğer zebra balığı tekniklerine uygundur. Hızlandırılmış analizler, bu manipülasyonların sonuçlarının doğrudan analizine izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, numuneleri uygun şekilde anestezi altına alarak ve monte ederek ve konfokal mikroskopi için ideal parametreleri ayarlayarak transgenik zebra balığı embriyolarının in vivo zaman atlamalı görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, zebra balığı embriyolarında kraniyal yüz morfogenezini karakterize etmek için zaman-zaman kısaltmalı konfokal görüntüleme metodolojisini açıklamaktadır. Teknik, farinks ark hareketlerinin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlayarak, yabani tip ve mutant embriyolar arasındaki farklar hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Zaman-zaman kısaltmalı konfokal görüntüleme, gelişimsel biyolojide güçlü bir araçtır.
- Kraniofasiyal morfogenezi anlamak, gelişimsel bozukluklar hakkında bilgiler için kritik öneme sahiptir.
- Zebra balıkları, embriyonik gelişimi incelemek için mükemmel bir model organizmadır.
- Mutant suşlar, morfolojik değişikliklerin genetik temelini ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığında farinks ark hareketlerini gözlemlemek ve karakterize etmek.
- Yabani tip ve mutant embriyolar arasındaki morfogenetik hareketleri karşılaştırmak.
- Kraniofasiyal gelişimi anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Transjenik zebra balığı embriyolarını anestetik acrost jele gömme.
- Embriyoları mikroskop slaytlarına metilselüloz üzerine monte etmek.
- Embriyoları mikroskop slaytları arasına vakum gresi ile kapatmak.
- Gerçek zamanlı görüntüleme için zaman-zaman kısaltmalı konfokal mikroskopi kullanmak.
Ana Sonuçlar
- Gerçek zamanlı görüntüleme, gelişim sırasında kritik doku hareketlerini yakalar.
- Yabani tip ve mutant embriyolar arasında farinks ark gelişiminde farklılıklar gözlenir.
- Teknik, kraniyal yüz morfogenezinin dinamikleri hakkında bilgiler sağlar.
- Zaman-zaman kısaltmalı görüntüleme, gelişimsel süreçleri incelemek için statik yöntemlere göre daha üstündür.
Sonuçlar
- Zaman-zaman kısaltmalı konfokal görüntüleme, embriyonik gelişimi incelemek için etkilidir.
- Metodoloji, zebra balığında çeşitli genetik arka planlara uygulanabilir.
- Elde edilen bilgiler, gelişimsel bozukluklar üzerinde araştırma yapmaya yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Time-lapse confocal imaging enables direct observation of dynamic tissue movements in living embryos, providing critical insights into morphogenetic processes that underlie craniofacial development. This approach supports target validation by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system, enhancing predictive confidence in early discovery. The methodology facilitates mechanistic de-risking by allowing real-time comparison of wild-type and mutant phenotypes, informing go/no-go decisions in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how genetic mutations disrupt pharyngeal arch morphogenesis in zebrafish.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation through longitudinal imaging of tissue behaviors in cranial neural crest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting varied tissue behaviors that cause craniofacial abnormalities, linking genotype to phenotype.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements of pharyngeal arch elongation and movement along anterior-posterior and dorsal-ventral axes.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent embryo mounting, anesthesia, and imaging parameters across experimental conditions.
- Scalability: Compatible with increasing abundance of transgenic zebrafish lines, supporting high-content screening of mutant and microinjected embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system to model craniofacial morphogenesis, with observations in smoothened and SMAD5 mutants reflecting human developmental disorder mechanisms.
- Preclinical Model: Zebrafish embryos serve as a predictive system for assessing morphogenetic disruptions prior to mammalian studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Time-lapse imaging allows detection of early phenotypic defects, such as failed rostral migration of the seventh pharyngeal arch at 48 hpf, informing early-stage de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling real-time analysis of morphogenetic consequences of genetic manipulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by directly observing tissue movements critical to morphogenesis in wild-type and mutant embryos.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via time-lapse capture of pharyngeal arch dynamics in developing zebrafish heads.
- Analytics: Enables measurement of pharyngeal arch elongation and movement using confocal software, providing statistical outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through analysis of mutant phenotypes that mirror human craniofacial disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to various genetic backgrounds and commonly used zebrafish techniques like morpholino injection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in craniofacial development through direct in vivo observation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined embryo preparation, mounting, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of morphogenetic disruptions, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by linking genetic perturbations to quantifiable phenotypic outcomes in a scalable model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, transgenic handling, and confocal microscopy operation.
- Dependent on instrumentation including confocal microscope with Z-stack and time-series capabilities, heated stage, and laser systems.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols, mounting media (agarose, methylcellulose), and sealing techniques (vacuum grease, bridged cover slips).
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in adjusting embryo age-specific mounting (single/double/triple bridged slips) and imaging parameters for developmental stage.
- Includes practical limitations such as potential developmental delays from anesthesia and mounting, though reported as minimal in the source.
