Name: Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin, fare böbreğinden çift negatif T hücrelerini izole etme yöntemini. Bu protokol, immünoloji ve böbrek hastalıkları araştırmalarında yüksek saflıkta hücre elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH PBS (R21 AI095484) tarafından desteklenmektedir. Biz CD1d tetramerin NHI tetramerdir çekirdek tesis ederiz.

1.. Araçların hazırlanması, Kültür Medya ve Reaktifler <ol><li> Araçlar: steril koşullar altında reaktifler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanmak. </li><li> Fetal sığır serumu% 5, bikarbonat, 2.1 g, 10 ml 100 x glutamat, HEPES, 10 mg, 1 mg sodyum piruvat ve 10 ml 100 x penisilin / streptomisin eklemek, RPMI doku kültür ortamı 1 L hazırlayın. Not: Önerilen doku kültür ortamı, RPMI, DMEM ile değiştirilebilir. </li><li> % 5 kolajenaz &quot;D&quot; çözeltisi (doku kültürü ortamında 9 ml kolajenaz &quot;D&quot; 5 ml) hazırlayın. </li><li> % 100,% 80 ve% 40: Üç farklı konsantrasyonlarda Percoll çözeltisi olun. Şu konsantrasyonlar 1 numune için hesaplanır. Oda sıcaklığında çözümler tutun. <ol><li> Percoll çözeltisi (stok çözeltiden) seyreltilmemiş Percoll 9 ml ekleyin; PBS 10x 1 ml ekleyin. </li><li> Percoll çözeltisi:; Percoll 8 ml% 100 eklemek PBS 1x 2 ml ekleyin. </li><li> Perkol çözüm:Percoll% 80 4 ml; 1x PBS içinde 4 ml. </li></ol></li><li> (FACS) tampon sıralama floresan-aktive edilmiş hücre için 1 L olun; 5 ml% 10 BSA (% 0.1 BSA), 1 ml% 10 sodyum azid (0.1%), 2 ml EDTA maddesi, 1 x PBS ile 1000 ml&#39;ye ekleyin. </li></ol> Böbrek sindirim 2. Hazırlanması <ol><li> , Gerekli kurumsal onayı edinilen standart yöntemlerle fareler kurban ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve mevcut yönetmelik ve hayvan bakım yönergeleri izleyerek olması. <ol><li> Pentobarbital (0.07 mg / kg) ile fare anestezisi. </li><li> Kansızlaştırma geçin. </li><li> Bir cerrahi masaya yatar pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile karın bölgesinde püskürtün. </li></ol></li><li> Petri kabına kollajenaz D çözeltisinin 10 ml ilave edilir. </li><li> Çıkarın ve her fareden her ikisi de böbrek açarlar. <ol><li> Için sternum karın derisi ve karın zarı aracılığıyla bir orta hat kesi yaparak üşüme boşluğu açınpubis. </li><li> Tarafına lateral olarak bağırsak hareket ile sol böbrek Açığa. </li><li> Dikkatlice forseps ile sol kapsülü ayrı. Not: Kapsül böbrek çevreleyen şeffaf bir katman olarak görünür ve kısmen perinefrik adipoz doku ile kaplı. </li><li> Bir cerrahi makas kullanarak pedikül damarlarını keserek sol böbrek çıkarın. </li><li> Sağ böbrek için aynı işlemi tekrarlayın. Not: sağ böbrek daha kranial ve orta hat (pedicels kısa olan) daha yakındır. </li></ol></li><li> Petri kabı içine böbrek yerleştirin. </li><li> Normal bir metal şekillendirme bıçağı kullanılarak küçük parçalar halinde böbrek doku (boyut olarak 1-2 mm) kesme ve (Şekil 1) 37 ° C kuluçka makinesi içinde 30-45 dakika boyunca kolajenaz çözeltisi içine parçaları yerleştirin. </li></ol> Böbrek sindirimden Böbrek Mononükleer Hücreleri (KMNC) 3 eklenmiştir. Hazırlanması <ol><li> Böbreğin, bir hücre süspansiyonu elde edilirmekanik olarak doku kültürü ortamı içinde 25 ml bir süzgeç (70 um) ve tekrar süspansiyon ile karıştırın doku bozarak sindirim. </li><li> Hücre süspansiyonu topak haline 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Çok yavaş ve dikkatli bir şekilde% 40 Percoll çözeltisi 4 ml pelet yeniden askıya ve yavaşça bir transfer plastik bir pipet ile% 80 Percoll çözeltisi üzerine 4 ml kaplar. Bu açıkça bir saydam tabaka ile birbirinden ayrılmış iki aşamada neden olur. Bunun üzerine lipidler tekabül eden san bir tabaka olacaktır. </li><li> Fren kapalı modunda santrifüj ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aspirasyon ile sarı ve kalın üst tabakası (yaklaşık 1-2 ml) sökün. </li><li> Bir transfer pipeti ile iki fazın arayüzünden hafif beyazımsı saydam tabaka toplayın. Çok dikkatli doku kültür ortamı ihtiva eden 2 ml, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve bu süspansiyon daha sonra bir toplam hacmin orta bölgesinin 13 ml ekleyin15 mi. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje </li><li> Ortamın 1 ml numune yeniden süspanse edin. </li><li> Bir menositometrede mavisi ile dışlama kullanarak KMNC sayısını saymak ve Böbrek başına ml başına KMNC numaraları gibi sonuçları ifade eder. </li><li> Bir kez yukarıdaki gibi yıkayın. </li></ol> KMNC 4. Hematopoetik İzolasyonu (CD45 +) Hücreler (Aşama I) <ol><li> Çalışan tampon 90 ul içine 10 7 hücreleri yeniden süspanse. </li><li> CD45 mikro-10 ul ilave edin ve 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe </li><li> Reaksiyonu durdurmak için çalışan tampon 1 ml ilave edilir. Çalışan tampon 500 ul, 4 ° C ve tekrar süspansiyon 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Mıknatıslarında yerleştirerek manyetik sütun hazırlayın ve çalışan tampon içinde 3 ml ile yıkayın. </li><li> Manyetik kolonundan hücre süspansiyonu geçmek ve sütundan geçer etiketlenmemiş hücreleri toplamak. </li><li> Runn 3 ml hücreler üç kez yıkayıntampon ing. Daha sonra çıkış maddesinin toplar. </li><li> Ayırıcı ve pipet sütunlar üzerine çalışan tampon 5 ml sütun çıkarın ve hemen etiketli kısmını dışarı floş. Bu fraksiyon, CD45 + hücreleri içerir. Hücreleri saymak. </li><li> Böbrekler, farklı T-hücreleri alt-mutlak sayısını hesaplamak için akış sitometrisi ile pozitif hücrelerin yüzdesi (Şekil 2) ile KMNC toplam sayısı çarpın. </li></ol> Negatif Seçim ile CD45 + Hazırlık DN T Cell 5. İzolasyonu (Aşama II) <ol><li> Aşağıdaki biyotinile edilmiş antikorların her biri 2.5 ul (0.5 mg / ml, 1.25 ug) ekleyin, anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc reseptörü (CD16/32), anti-MHC class II (IA b), anti- Her 10 7 hematopoietik hücreler için CD1d PBS-57 tetramer. </li><li> Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 1 ml anti-Biotin, mikro-boncuklar ekleyin. </li><li> Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> T tüpü yerleştirinO mıknatıs ve tükenmesi geçin. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak negatif fraksiyonunda DN T hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için canlı hücreler sayılır. </li><li> Ilk kapısı CD45 +, ikinci kapısı TCRαβ +: Bu yolluk strateji izleyerek akış sitometri ile DN T hücrelerinin saflığını kontrol edin. CD1d + hücreleri hariç. CD8 + vs arsa CD4 + T hücrelerini DN (Şekil 3) tespit etmek. </li><li> Saflık yüzdesi ile belirlenen toplam sayısı çarpın. Not:% 90&#39;dan fazla saf DN T hücre popülasyonu içinde bu protokol kullanılması,. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu tür otoimmün hastalıklar, kanser, graft tolerans ve akut böbrek hasarı (AKI) da dahil olmak üzere böbrek hastalıkları, birincil olarak farklı patolojik koşullarda karıştıktan çünkü DN T hücrelerinde artan bir ilgi vardır, 8, 13, glomerülonefrit. Bu nedenle, daha iyi bir DN T hücrelerinin patofizyolojik fonksiyonları ve karakterize etmek için bir ihtiyaç vardır. Ancak, şu anda CD4 ve CD8 T hücreleri ile karşılaştırıldığında, bu hücrelerin fonksiyonu içinde anlayışında bir eksikliği vardır. Önemli bir neden,...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Periferik αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negatif (DN) T hücreleri fenotip ve işlevlerini 1-4 sahip çeşitli tiplerin ayrılır. DN T hücreleri, tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çok daha farklı hastalık modellerinde 4-6 patofizyolojik bağışıklık tepkilerine dahil edilmektedir. DN T hücrelerinin artan çeşitli bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesi ve allotransplant tolerans modülasyonunda rol benzersiz bir bağışıklık hücresi bir türüdür. 4-6, 9 Bunlar dalak ve lenf düğümleri (periferal kan ve sekonder lemfoid organlarda nadirdir .) Ancak, normal böbrek ve bağırsak epitel 10-12 önemli sakinleri vardır. Çok az kararlı halde böbrekte işlevlerine yaklaşık 7 ve böbrek transpl ile bağlantılı akut böbrek hasarı (AKI) gibi patolojik koşullar altında bilinirkarınca. Çünkü her oyuncunun rolünü tanımlayan, alloresponses de dahil olmak üzere bağışıklık tepkilerini düzenleyen farklı bağışıklık hücrelerinin karmaşık rolleri alloresponses anlamak ve yeni terapötik tasarımı önemlidir. Ve fizyolojik koşullar altında, farklı hastalık, böbrekte bulunan DN T hücrelerinin önemli sayıda göz önüne alındığında, DN T hücreleri transplant alıcılarında kritik farelerde ve insanlarda bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkileri düzenlenmesinde bir rol oynayabilir ve alloresponses muhtemeldir. Hala dağınık delil olsa Biriken hem patojenik ve bağışıklık fonksiyonları DN T hücrelerini implicates ama neden ve nasıl belli bir zararlı ya da baskılayıcı fonksiyonunu sergilemek ve çevre onları nasıl etkilediğini de anlaşılamamıştır. Nedeniyle böbrekte düşük bolluğu nedeniyle, izolasyon geliştirilmiş yöntemler gerekmektedir. T DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol bulunmamaktadıro non-lenfoid dokular. Bizim protokol böbrekten DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif eder; Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, çeşitli lenfoid olmayan dokular için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Laminer akış başlığı&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Veya eşdeğeri ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemositometre Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Atmosfer kontrollü inkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 & derece; % 5 CO2)</td></tr> <tr><td>ile C Analitik akış sitometresi</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche 11088858001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll ve nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>%0.1 sodyum azid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tampon fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA tamponu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ mikro boncuklar</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Biotin mikro boncuklar&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (klon: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (klon: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Pasifik Mavisi&nbsp; (ab zinciri, klon: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>FITC eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biyotinile (GK1.5)</td> <td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biyotinile ve nbsp; (Klon 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC sınıf II (I-A b) biyotinile</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Çalıştırma Tamponu - MACS Ayırma Tamponu&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J fareler</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Böbrekler - Lenf Düğümleri</td></tr><tr><td>Petri kabı&nbsp;</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 & # 956; M filtresi&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Piston&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Tüpler 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Tüpler 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Veya eşdeğer ekipman&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galser tetramer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

böbrek gelen Çift negatif αβ t hücreleri İzolasyon

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Lenfoid olmayan dokulardan DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol, çeşitli immün yanıtların onların daha çok rapor katılımı rağmen bulunmamaktadır. DN T hücreleri Allotransplantlar 1-6 bağışıklık ve oto-bağışıklık yanıtlarını ve tolerans düzenlenmesinde implike edilmiştir özel bir immün hücre türüdür. DN T-hücreleri, periferik kan ve sekonder lemfoid organlarda (dalak ve lenf düğümleri) nadir, ancak, fakat normal böbrekte önemli sakinleri vardır. Çok az nedeniyle çevrede kendi azlığı onların patofizyolojik işlevi 7 hakkında bilinmektedir. Biz son zamanlarda sürekli halde ve iskemi reperfüzyon yaralanması esnasında böbrek 8&#39;de bu nüfusun kapsamlı bir fenotipik ve fonksiyonel analiz nitelendirdi. DN T hücresi işlevinin analizi büyük ölçüde böbrek kendi izolasyon için bir protokol geliştirilerek artırılacaktır. Burada, biz isolatio sağlayan bir roman protokol açıklarMurin böbrekten oldukça saf ab CD4 + CD8 + T hücreleri ve T hücre DN n. Kısaca, biz kollajenaz kullanılarak böbrek doku sindirmek ve yoğunluk gradyanı ile böbrek mononükleer hücreleri (KMNC) izole. Bu KMNC den% 70 &#39;den% 3 hematopoietik T hücreleri zenginleştirmek için iki aşama takip eder. İlk adım, CD45 + izolasyon kiti kullanılarak hematopoietik hücrelerin pozitif seçim oluşur. İkinci aşamada, DN T hücreleri negatif CD4, CD8 ve MHC sınıf II monoklonal antikorlar ve CD1d α-GalCer tetramer kullanılarak olmayan arzu edilen hücreler ayrılmasıyla izole edilmektedir. Bu strateji,% 90&#39;dan fazla saf DN T hücre popülasyonu yol açar. , FACS analizi ile, ardından yukarıda belirtilen antikorlar ile lekeleme yüzey saflığını teyit etmek için kullanılır.

Yabani tip C57BL / 6 (B6), böbrek böbrek başına yaklaşık 1.5-2.1 x 10 6 mononükleer hücreleri içerir. Yaklaşık olarak en fazla% 10 CD45 + hematopoietik hücrelerdir. % 5 kolajenaz ile sindirme ile ve ardından, Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi böbrek tek çekirdekli hücreleri (KMNC) hazırlanması için, böbrekler küçük parçalar halinde kesilir. Bu KMNC tabakası (Şekil 2, sol panel) toplamak için, bir yoğunluk gradyan santrifüj gerçekleştiril...

DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Bu prosedürün genel amacı, fare böbreğinden saf ve çift negatif T hücrelerinin nasıl izole edileceğini açıklamaktır. Bu işlem, öncelikle böbreğin bir kollajenaz çözeltisi ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, mononükleer hücreler yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılır ve hematopoetik CD 45 pozitif hücreler pozitif seçim yöntemiyle toplanır.Nihayetinde, çift negatif T hücreleri negatif seçilim yoluyla izole edilebilir. 1998 yılında ekibimiz, mevcut dogmanın aksine, bağışıklık hücrelerinin ve özellikle de T hücrelerinin akut böbrek hasarına aracılık ettiğini bulmuştur. Böbrek ve kalpte incelenebilecek bu hücrelerin sayısı çok azdı, bu nedenle bunları daha iyi incelemek için bir teknik geliştirdik.Hem normal böbrekte hem de hasar sırasında, CD4 veya CD8 bulunmayan çift negatif T hücrelerinden oluşan bir hücre popülasyonunun yüksek miktarda olduğunu görmemiz bizi şaşırttı. Bunları daha iyi incelemek ve mekanizmalarını araştırmak için kullanılan detaylı ve geliştirilmiş teknik, gelecek videoda açıklanacaktır. 2001 yılından beri çift negatif T hücrelerini çalışmaktayız ve yakın zamanda, farklı biyolojik immün yanıtlar için kullanılabilecek saf bir popülasyon elde etmek amacıyla bu hücrelerin izolasyonuna yönelik bölgesel yöntemi modifiye etmek için Dr. Rob'un laboratuvarı ile iş birliği yaptık.Bu yöntem böbrekteki bağışıklık hücreleri hakkında bilgi sağlayabilse de, cerrahi işleme başlamadan önce lenfatik olmayan dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İlk olarak, doku toplamak için bir Petri kabına 10 milliliters collagenase D ekleyin. Ardından, ötanize edilmiş bir farenin abdominal bölgesini %70 ethanol ile spreyleyin.Ardından, sternumdan pubise kadar abdominal deri ve peritona boyunca orta hat insizyonu yapın ve ardından sol böbreği açığa çıkarmak için bağırsağı yan tarafa doğru lateral olarak kaydırın. Böbreği çevreleyen şeffaf bir tabaka olarak görünen ve kısmen perinefrik adipoz doku ile kaplı olan sol kapsülü belirleyin ve pens yardımıyla böbrekten dikkatlice ayırın. Daha sonra dokuyu çıkarmak için pedikül damarı cerrahi makasla kesin ve böbreği Petri kabına yerleştirin.Ardından sağ böbreği çıkardıktan sonra, böbrek dokusunu bir ila iki milimetrelik küçük parçalara ayırmak için standart bir metal şekillendirme bıçağı kullanın. Parçaları 37 °C'de 30 ila 45 dakika boyunca kollagenaz çözeltisinde sindirin ve ardından böbrek mononükleer hücrelerini izole etmek için böbrek bulamacını 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek mekanik olarak parçalayın. Hücre süspansiyonunu 25 ml doku kültürü ortamında yeniden süspande edin.Ardından hafifçe çalkaladıktan sonra, hücreleri santrifüjle çöktürün ve pelletini 4 mL %40'lık Percoll çözeltisinde yeniden süspande edin. Sonrasında, plastik bir transfer pipeti kullanarak Percoll'lü hücre çözeltisini 4 mL %80'lik Percoll çözeltisinin üzerine nazikçe ekleyin; böylece yarı saydam bir tabaka ile net bir şekilde ayrılmış iki faz oluşturun. Hücreleri, frenleme kapatılmış halde, oda sıcaklığında 1500 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından kalın, sarı, lipid içeren üst tabakadan yaklaşık 1-2 mL aspire edin.İki fazın ara yüzeyindeki hafif beyazımsı yarı saydam tabakayı yeni bir transfer pipeti kullanarak, iki mililitre doku kültürü ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Ardından, toplam hacmi 15 mililitreye tamamlamak için 13 mililitre ortam ekleyin. Yıkama ve sayım işleminden sonra, hücreleri 90 µL çalışma tamponunda 1 × 10⁷ konsantrasyonuna seyreltin.Ardından hücreleri 10 µL CD 45 mikroboncukları ile 4 °C'de inkübe edin. 15 dakika sonra, reaksiyonu durdurmak için 1 mL yürütme tamponu ekleyin. Daha sonra hücreleri santrifüjle çöktürün ve yeniden kullanın.Peleti 500 µL taze çalıştırma tamponu içerisinde süspande edin. Ardından, bir kolonu boncuk ayırma mıknatısına yerleştirin ve kolonu 3 mL çalıştırma tamponu ile durulayın. Sonrasında, hücre süspansiyonunu manyetik kolondan geçirin ve kolondan geçen işaretlenmemiş hücreleri toplayın.Hücreleri içeren tüpü, her seferinde akışı toplayarak, üç mililitre çalışma tamponu ile üç kez yıkayın ve ardından kolonu mıknatıstan çıkarın. Kolonun üzerine beş mililitre çalışma tamponu pipetleyin ve CD 45 pozitif hücreleri içeren etiketli fraksiyonu hemen yıkayarak dışarı aktarın. Ardından hücreleri saydıktan sonra, her 1 × 10⁷ hematopoetik hücre için bu biyotinize antikorların her birinden 2,5 mikrolitre ekleyerek 4 °C'de inkübe edin.30 dakika sonra, hücreleri bir mililitrelik anti biotin mikroboncukları ile dört derece Celsius'ta yarım saat daha inkübe edin. Mıknatısa yeni bir kolon yerleştirin ve ardından, bu kez negatif fraksiyonu toplayacak şekilde hücreleri az önce gösterildiği gibi kolona yükleyin. Son olarak, negatif fraksiyondaki toplam çift negatif T hücresi sayısını belirlemek için canlı hücreleri sayın ve bu sayıyı akış sitometrik analizi ile belirlenen saflık yüzdesi ile çarpın.C57BL/6 tipi böbreklerin her biri yaklaşık olarak 1,5 ila 2,1 × 10⁶ mononükleer hücre içerirken, bunların %10'undan azı hematopoetik CD45 pozitif hücrelerdir. Böbrek mononükleer hücre tabakasını toplamak için uygulanan yoğunluk gradyanı santrifüjasyonundan sonra, CD45 pozitif hücreler, CD45 pozitif manyetik boncuk ayırımı ile yaklaşık %80 ila %95 oranında daha fazla saflaştırılabilir. Zenginleştirilmiş hematopoetik CD45 pozitif hücrelerin yaklaşık %30 ila %60'ı çift negatif T hücreleridir.CD 45 pozitif hücrelerin negatif seleksiyonu ile CD 4 pozitif, CD 8 pozitif, MHC sınıf II pozitif ve tetramer pozitif hücrelerin uzaklaştırılması, %90 ila %95 saflıkta yüksek derecede saflaştırılmış çift negatif T hücreleri ile sonuçlanır. Bu protokol kullanılarak, fare başına 0,5 × 10⁶ hematopoetik CD 45 pozitif manyetik olarak işaretlenmiş hücre elde etmek mümkündür. Bu prosedür, farklı dokulardaki çift negatif T hücrelerinin biyolojik fonksiyonlarının ve mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Video, immünomanyetik hedefleme ve periferik kan mononükleer hücre süspansiyonundan ayırma yoluyla B hücrelerini saflaştırmanın bir yolunu açıklıyor. Yöntem, istenmeyen hücre tiplerinin, manyetik ayırma yoluyla heterojen hücre süspansiyonundan tükenecek olan spesifik hücre yüzey proteinlerini hedefleyen spesifik antikorlar veya ligandlar (manyetik parçacıklara bağlı) ile etiketlenmesini içerir.

Negatif İmmünomanyetik Seçim: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden B Hücrelerini Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) düşük konsantrasyonlu CD4+Vδ1+γδ T hücreleri popülasyonunun manyetik etiketlemeye dayalı izolasyonu için bir protokol gösterilmektedir. FITC konjuge anti-Vδ1 antikorları, manyetik anti-FITC mikro boncuklar ve anti-CD4 antikor kaplı süperparamanyetik boncukların bir kombinasyonu kullanılarak, CD4 + Vδ1 + T hücreleri PBMC popülasyonundan başarılı bir şekilde saflaştırılabilir.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden CD4+ Vδ1+ γδ T Hücrelerinin Seçici İzolasyonu

Burada, yakın zamanda gösterdiğimiz gibi, ekstratimik bir αβ T hücresi progenitörü olan periferik Vδ1+CD4+ T hücrelerinin kıt T hücresi varlığının izolasyonu ve klonlanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, bu hücrelerin ex vivo kültürde kantitatif olarak izole edilmesine, klonlanmasına ve verimli bir şekilde genişletilmesine izin verir.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

Böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için güvenilir ve verimli teknikler, sonraki uygulamalar için gereklidir. Bu, az sayıda böbrek bağışıklık hücresinin yüzey antikoru etiketlemesini gerektirir. Burada, görünüşte bu amaca ulaşan böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için özlü bir yöntem açıklıyoruz.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

Burada böbrek Perivasküler Stromal bütün organ perfüzyon sindirim enzimleri ve NG2 hücreli zenginleştirme dayalı hücreleri (kPSCs) için bir roman klinik sınıf izolasyon ve kültür yöntem mevcut. Bu yöntemle, hücresel tedavi için yeterli hücre sayıları elde etmek mümkündür.

İnsan böbrek Perivasküler Stromal hücreler için bir roman klinik sınıf izolasyon yöntemi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

Bu protokol, güvenli ve iyi tolere edilen fare çift taraflı böbrek lenfadenektomisi için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar.

Sırın İki Taraflı Renal Lenfadenektomisi

Öğrenin, fare böbreğinden çift negatif T hücrelerini izole etme yöntemini. Bu protokol, immünoloji ve böbrek hastalıkları araştırmalarında yüksek saflıkta hücre elde etmeyi sağlar.

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

Daha fazla video keşfet