Name: PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, mikro desenli PDMS elastik membran üzerindeki hücrelere tek yönlü germe kuvveti uygulama yöntemini. Bu teknik, mitotik memeli hücrelerinde mekanik deformasyonu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Fransa Institut Curie, Paris, tarafından kurulmuştur. Mekanik sedye Damien Cuvelier (Institut Curie) tarafından tasarlanan ve Grem tarafından üretilen (mecanique-grem.com). PDMS desenleme Ammar Azioune (Bordeaux II Üniversitesi) tarafından geliştirilmiştir.

1.. PDMS pasivasyon <ol><li> PDMS bir parça kesin yaklaşık olarak önceden yapılmış tabakasından x 20 mm 35 mm (örneğin, GelPak, malzeme tabloda listelenen gibi). </li><li> Plastik üst ve alt koruma tabakaları çıkarın (gerekli ise) ve Petri çanağı (muamele edilmiş kültür hücre) bir plastik PDMS yerleştirmek için cımbız kullanın. </li><li> / Dakika 30 salınım ile bir karıştırıcı üzerine 5 dakika için% 70 etanol ile PDMS yıkayın. </li><li> Bunun üzerine akan hava ile yüzeyi kurulayın. </li><li> Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, 5 dakika için derin UV (λ = 180 nm) ile aydınlatma imkanını (lamba referans malzemeleri tabloya bakın; parametreleri farklı lambalar için değişir). </li><li> Her bir parça PDMS için EDC / NHS çözeltisi 200 ul (solüsyonun reaktivitesi saat meselesi çürükleri için bu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır) hazırlayın. PH 6.0 &#39;da 0.05 M MES + 0.5 M NaCl tampon, 1 ml için, Sülfo-NHS 11.5 mg ve 19.2 mg EDC ekleyin. </li><li> TransferiIşıklı edilmemiştir Petri kabı, bir kapağa Petri kabı PDMS levhalar. Bu PDMS çevresi çok hidrofobik olmasını sağlamak ve bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır. </li><li> EDC / NHS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Su ile EDC / NHS durulayın. </li><li> PLL-PEG-g çözelti (10 mM HEPES pH 8.6 içinde 0.5 mg / ml) ilave edilir ve 3 saat için oda sıcaklığında gece boyunca ikinci inkübe edin. </li><li> Su ile PLL-PEG-g durulayın. (G-PLL-PEG ile işlevselleştirilmiş) pasifleştirilmiş PDMS 4 ° C&#39;de birkaç gün boyunca saklanabilir </li></ol> 2. PDMS desenlendirilmesi <ol><li> PDMS levha alın ve desenlendirme için microfeatures taşıyan bir sentetik kuvars photomask üzerine yerleştirin (bkz. Şekil 1). PLL-g-PEG photomask krom yan bakan taşıyan PDMS tarafını yerleştirin. </li><li> Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, fotomaske yoluyla, 7 dakika boyunca yanar.</li><li> Maske + PDMS üzerine su ekleyin ve yavaş yavaş maske kapalı PDMS soyun. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süre ile pH 8.6 de HEPES tamponu içinde 50 mg / ml &#39;de fibronektin çözeltisi ile inkübe edin. Bu diğerleri ECM proteinleri kullanmak mümkündür, ancak bunlar bu protokol ile test edilmemiştir. </li><li> PBS ile durulayın. </li></ol> 3. Cihaz montaj <ol><li> Germe cihazı (sorun giderme için Tartışma) üzerine önceden pasifize PDMS monte edin. <ol><li> Sedyenin sabit kısmına PDMS bir tarafı takın. </li><li> PDMS tabakanın çok fazla sıkıştırma olmadan sedyenin mobil kısmına diğer tarafı düzeltildi. </li></ol></li><li> Kalın bir PDMS bıçak içinde PDMS bir dikdörtgen (22 mm x 19 mm) kesme ve (Şekil 2 ye bakınız) hücreleri ve medya koruyacaktır bir havuz (ya da çerçeve) elde etmek için içine bir dikdörtgen kesin. </li><li> Bu havuzu PDMS altında silikon gres ekleyin ve bir med oluşturmak için PDMS levha üstüne yerleştirinyum havuzu muhafaza eder. Yağ germe sırasında PDMS tabaka üzerine havuzun kayma sağlayacaktır. </li></ol> 4. Hücreleri Desenlendirme <ol><li> Versene ile% 50 confluency kültür şişesi hücreleri çıkarın. </li><li> Hücre sayımı ve 200,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon bunları. </li><li> Havuzda hücre süspansiyonu 1 ml (ek ayrıntılar için Tartışma) ekleyin. </li><li> Hücreler (RPE-1 hücreleri, 10 dakika ve HeLa hücreleri 20 dakika sürer, hücre tipine bağlı olarak) 10-30 dakika boyunca desen bağlanan olsun. </li><li> Yavaşça dengelenmiş ortamda (inkübatör ortamı dengeye) ile yüzen hücreleri yıkayın. </li><li> Hücreler desenleri birkaç saat boyunca yayalım (RPE-1 en az 2 saat gerekir; HeLa hücreleri 3 saat ihtiyacınız olacak). </li><li> PDMS tatili durumda, buharlaşma ve orta sızıntıyı önlemek için havuz üstünde bir lamel ekleyin. </li><li> Ters bir mikroskop cihazı koymak ve görüntüleme başlar. Immersiyon yağı ob kullanmaktan kaçınınnedeniyle odaklanma sorunları için çalışmaz gibi alamayarak hedeflere ulaşamama riski. </li></ol> 5. Germe <ol><li> X-, y-ve z-ekseni (özellikle x) &#39;de aşama pozisyon düzeltme sırasında mikrometrik vidasını. Aşama pozisyon PDMS genişletme ve odak kaybına karşı koymak için düzeltilmesi gerekmektedir. (TARTIŞMA paragraf &quot;streç sırasında&quot; bak). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Bu teknik çok kez kullanılan ve iyice test olmasına rağmen, başarısız bir deney yol açabilir çeşitli kritik adımlar vardır. PDMS Hakkında: Bu iş için, GelPak, piyasada mevcut ince PDMS levha kullanılmıştır. Alternatif PDMS yaprak PDMS karışımı doğrudan döküm alınabilir. Daha tekrarlanabilir ve özel yapılmış PDMS&#39;nin kıyasla kırmak için daha az olasıdır, çünkü GelPak kullanmanızı öneririz. Cihaz hakkında: Bu ...

Yüksek organizmalarda bir doku oluşturan hücreler mekanik gerilimler ve dış ortamdan ya da çevreleyen hücrelerden 1,2 dan ya geliyor germe güçlerine tabidir. Hücreler uyum ve doku bütünlüğünü korumak için bu güçlere direnmek gerekir. Bu tür güçler de kalkınma 3,4 sırasında dokular morfogenezisi önemlidir. Kültürlü hücreler üzerinde mekanik kuvvet uygulayarak bir doku içinde neler olabileceğini taklit etmek bir yoldur, ancak hücre şekli ve hücre deformasyon 5,6 nicel ve bağımsız kontrolü ile. Bunun için, çeşitli teknikler kullanılabilir. Bir (bütün hücre veya bunun bir parçası), örneğin, AFM veya 7,8 türevleri ya da hücrelerin büyüdüğü alt tabakanın esneme kullanılarak hücreler üzerinde basın olabilir. Bu yazıda anlatılan yöntem hücreleri ile kaplı bir uçak substratı germek için nasıl gösterir. Bu teknik, ilk olarak değerlendirmek için geliştirilmiştir kuvvetlerinin rolü m üzerine uygulananitotic memeli hücreleri 9. Mitotik hücreler geri çekme elyafların yoluyla alt-tabakaya bağlı kalmak ve membran germe da mitotik iğin dönmesini tahrik lifleri üzerine bir kuvvet uygulamıştır. Yapışkan birleştirme micropatterns ve germe kuvvetleri ilgi ve tek tek hücreler şeklinde bağımsız kontrol elde etmektir. Bu, tek eksenli germe uygulanır ise, mükemmel bir şekilde izotropik yuvarlak şekil, bir oval hücre uzatmak için, örneğin mümkündür. Hücreler micropatterns platted değilseniz, tek eksenli en hücreler germe ekseni ile hizalanan uzun bir eksene sahip olan, hücre uzaması sonucu germe. Bu, uzun eksen hizalama ve hücrelere uygulanan gerilme etkisinin etkisini ayırmak için daha sonra zordur. Cihaz, uzun zaman atlamalı floresan mikroskobu da dahil olmak üzere herhangi bir canlı hücre görüntüleme için uygun olan, ve uyuşturucu deney sırasında ilave edilebilir. Derin UV&#39;lerin micropatterning yöntemi 10Azioune ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve ark. PDMS 11 Desen nitelendirildi Azioune et al. 12 de protokol uzanan Mevcut Carpi et al. 13 içeren bir video versiyonu

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>Farklı kalınlık/yapışkanlık mevcuttur. Bir alternatif, PDMS&nbsp; kendini.</td></tr><tr><td>Silikon gres</td><td>GE Bayer Silikonlar</td><td>Baysilone-Macun</td><td>Bu biyouyumlu</td></tr><tr><td>Germe cihazı</td><td>GREM m & eacute; canique</td><td>Sedye 2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N- (3-Dimetilaminopropil) -N ve prim; -etilkarbodiimid hidroklorür)</td> <td>Sigma</td><td>3450</td><td>-20 ° C'de 6 ay kararlı; C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu)</td> <td>Sigma</td><td>56485</td><td>Nemden koruyun</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (Zürih)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sentetik Kuvars fotoğraf maskesi</td><td>Toppan</td><td></td> Sığır plazması Sigma F1141 & nbsp'den <td>Kuvars Fibronektin'de standart ikili fotoğraf maskesi alın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>;</td></tr></tbody></table>

pdms zarında micropatterned hücreler germe

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mekanik kuvvetler hücreleri üzerinde uygulanan ve / veya dokular, çok sayıda süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Bir polidimetilsiloksan görüntüleme ile uyumlu (PDMS) membran üzerine kaplanmıştır hücreleri uzatmak için bir cihaz geliştirdiler. Bu teknik, tekrarlanabilir ve çok yönlüdür. PDMS zar, belirli bir geometri için hücreler veya dokular sınırlandırmak amacıyla micropatterned edilebilir. İlk adım, bir derin UV tekniği ile PDMS membran üzerine micropatterns yazdırmaktır. PDMS zar daha sonra mekanik bir sedye üzerinde monte edilir. A odası boyunca uzanan kayma sağlamak için biyo-uyumlu yağı ile membran üzerine bağlıdır. Hücreler ekildi ve micropatterns birkaç saat boyunca yayılmasına izin verilir. Numune mikrometrik bir vida kullanımı ile birden çok kez gerilmiş gerek gerilmemiş edilebilir. Bu (% 30 civarında) tam ölçüde streç uygulamak için bir dakikadan az sürer. Burada sunulan tekniği için gerekli olan bir motorlu aygıt içermezhızlı bir şekilde ve / veya bilgisayar kontrollü gerilme tekrarlanan germe döngüsünden pplying, ancak bu uygulanabilir. Hücrelerin germe veya doku hücre kuvvetler, mekanik stres veya doku morfolojilerinden hücre yanıtı ile ilgili sorularınız için ilgi olabilir. Bu video sunumu görünüşte basit deney bu tür yaparken ortaya çıkabilecek tipik sorunları önlemek için nasıl gösterecektir.

<html> Bu ekran protokol sunulan teknik mitotik memeli hücrelerinin geri çekme lifleri üzerinde kuvvetlerinin uygulanmasını izin verdi. Gerçekten de, hücre bölünmesi esnasında, mitotik aşamasında, memeli hücreleri bir küre şeklini alır ve alt-tabakaya bağlı olan ince bir zar ile çevrili aktin kabloları geride bırakmak için çekin. Bu kablolar (geri çekilme lifler), bölünme girmeden önce hücre geometri hafızası vardır. PDMS ince film bir fotomaske aracılığıyla derin UV micropatterns yapmak (Şekil 1) hücre ...

Bu el yazması tek yönlü germe kullanarak yapışık hücreler ve dokular üzerindeki kuvvetleri uygulamak ya da serbest bırakmak için bir teknik sunuyor.

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Bu prosedürün genel amacı, polidimetilsiloksan (PDMS) elastik bir membran üzerindeki desenli hücreleri germektir. Bu işlem, önce PDMS tabakasının hazırlanması ve ardından PDMS üzerine bir mikro desen uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Mikro desenli PDMS tabakası daha sonra germe cihazına monte edilir ve üzerine bir ortam tutma havuzu yerleştirilir.Ardından, hücreler mikro desenli PDMS tabakasının yüzeyine ekilir ve bağlanmamış hücreleri uzaklaştırmak için yıkama işlemi uygulanmadan önce desenlere tutunmaları beklenir. Son adım, hücreleri germek için hücre içeren PDMS'ye bir uzama uygulanmasıdır. Son olarak, hücre germe sırasında mitotik memeli hücrelerin retraksiyon liflerine kuvvet uygulanmasının hücre deformasyonuna yol açtığını göstermek için video mikroskobu kullanılır.Bu yöntem, biyomekanik alanındaki "dış kuvvetlerin bölünme gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri nelerdir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, bölünen bir hücreye kuvvet uygulamak istediğimizde ortaya çıktı; öncelikle önceden hazırlanmış bir tabakadan yaklaşık 35 x 20 milimetre boyutlarında bir PDMS parçası kestik. Burada, özel yapım PDMS'e kıyasla daha tekrarlanabilir olduğu ve kırılma olasılığının daha düşük olması nedeniyle ticari olarak mevcut ince bir PDMS tabakası kullanılmıştır.Plastiğin üst ve alt koruyucu katmanlarını çıkarın ve PDMS'i plastik bir petri kabına yerleştirmek için cımbız kullanın. Ardından PDMS'i, dakikada 30 salınım yapan bir rotator üzerinde beş dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın. Yıkama işleminin ardından, yüzeyin üzerinden hava akışı sağlayarak kurutun.Ardından, PDMS'i ultraviyole lambalardan yaklaşık beş santimetre uzaklıkta, beş dakika boyunca derin ultraviyole ışığa maruz bırakın. Bu sırada, metin protokolünde açıklandığı şekilde bir E-D-C-N-H-S çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin reaktivitesi birkaç saat içinde azaldığı için, çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.PDMS levhaları Petri kabından, ışığa maruz kalmamış olan Petri kabı kapağına aktarın. Bu işlem, PDMS çevresinin çok hidrofobik olmasını sağlayacak ve bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.E-D-C-N-H-S solüsyonunu PDMS üzerine pipetleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla E-D-C-N-H-S'yi su ile yıkayarak uzaklaştırın.Ardından, PLL aşılanmış PEG çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında üç saatten bir geceye kadar inkübe edin; inkübasyonun ardından, PDMS üzerindeki fazla PLL aşılanmış PEG'i su ile durulayın. PDMS artık PLL aşılanmış PEG ile pasivize edilmiş veya fonksiyonelleştirilmiş durumdadır ve dört derece santigrat sıcaklıkta birkaç gün boyunca saklanabilir. PDMS'yi desenlemek için, bir PDMS tabakasını desenleme için mikro özellikler içeren sentetik kuvars bir foto maske üzerine yerleştirin.PLL aşılanmış PEG içeren PDMS tarafını, fotomaskenin krom tarafına bakacak şekilde yerleştirin. Ardından, ultraviyole ampullerden yaklaşık beş santimetre uzaklıkta, fotomaske üzerinden yedi dakika boyunca ışınlayın. Işınlamanın ardından.Maske ve PDMS üzerine su ekleyin, ardından PDMS'yi yavaşça maskeden soyun; daha önce pasivize edilmiş PDMS'yi germe cihazına yerleştirin. PDMS'nin bir tarafını germe cihazının sabit kısmına takın. Diğer tarafı, PDMS tabakasını çok fazla sıkıştırmadan cihazın hareketli kısmına sabitleyin.PDMS çok fazla sıkıştırılırsa boyu kısalır ve bu durum, aynı gerilme mesafesi için gerilimin daha fazla olması nedeniyle kırılmalara yol açabilir. Vidaların iyice sıkıldığından emin olun, aksi takdirde PDMS tabakası gerilme başladığında veya deneyin ilerleyen aşamalarında kayacaktır. Ardından, PDMS'yi bir saat boyunca fibronectin çözeltisi ile inkübe edin.Oda sıcaklığında diğer hücre dışı matris proteinlerinin kullanılması mümkündür, ancak bunlar bu protokol ile test edilmemiştir. Son adım olarak, PDMS'yi fosfat tamponlu salin ile durulayın. Ardından, kalın bir PDMS tabakasından dikdörtgen şeklinde bir PDMS parçası kesin.Ardından içeride başka bir dikdörtgen kesin. Hücreleri ve medyumu tutacak bir havuz oluşturmak için, bu dikdörtgen şeklinde kesilmiş PDMS'in altına silikon gres ekleyin ve medyumu tutacak bir havuz oluşturmak için bunu PDMS tabakasının üzerine yerleştirin. Gres, hücreleri desenlemek için germe işlemi sırasında havuzun PDMS tabakası üzerinde kaymasına olanak sağlayacaktır.İlk olarak, %50 konfluensle bir kültür flaskındaki hücreleri ayırın. Hücreler süspansiyona girdiğinde, bireysel hücrelerin desene bağlanmasını sağlamak için agregatları parçalamak amacıyla 200 microliter uçlu bir pipetle birkaç kez pipetleyin. Ardından, havuzun içine bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Hücre tipine bağlı olarak, hücrelerin paternlere bağlanması için 37 °C'lik bir inkübatörde 10 ila 30 dakika bekleyin. Hücreler paternlere tutunduktan sonra, yüzer hücreleri uzaklaştırmak için dengelenmiş besiyeri ile nazikçe yıkayın.Besiyerini bir aspirasyon pipetiyle çekerken aynı zamanda yeni besiyeri ekleyin. Ayrılmamış hücreleri yıkayıp uzaklaştırmak için yeterli akışı sağlamak ve aynı zamanda hücrelerin besiyeri içinde kalmasını sağlamak kritik önem taşır. Ardından, PDMS'nin kırılması durumunda buharlaşmayı ve besiyeri sızıntısını önlemek için havuzun üzerine bir lamellik yerleştirin ve hücrelerin desenler üzerinde birkaç saat boyunca yayılmasına izin verin.Ardından cihazı ters mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme işlemine başlayın. Odaklama sorunları nedeniyle çalışmayacağı için yağ daldırma objektiflerin kullanımından kaçının. Mikro desenli hücreleri germek için x, y ve Z eksenlerinde sahne konumunu düzelterek mikrometrik vidayı çevirin.PDMS'in genişlemesini ve odak kaybını dengelemek için sahne konumunun düzeltilmesi gerekir. Bu video protokolünde sunulan teknik, substratın metafaz başlangıcında gerilmesi yoluyla mitotik memeli hücrelerin retraksiyon liflerine kuvvet uygulanmasına olanak sağlamıştır. Bu retraksiyon liflerinden bazıları hücre gövdesinden uzaklaştırılmış ve bu durum, mitotik hücre korteksine mekanik bir kuvvet uygulanmasıyla sonuçlanmıştır; bunu başarmak için hücre, oval bir desen üzerine ekilmiştir.Desenleme, foto maske aracılığıyla yuvarlak desenlerin baskısı sırasında PDMS'nin gerilmesiyle gerçekleştirilir. Germe işleminden sonra, desen bir daire haline gelecek şekilde substrat gerilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin makro desenler üzerine nasıl ekilebileceği ve ardından substrata nasıl germe kuvvetleri uygulanabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makalede kompleks anizotropik çift eksenli mekanik deformasyona karşı tek bir hücre yanıtları araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilen yeni bir germe platformu sunmak.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Hücre davranışının nanotopografik modülasyonunun incelenmesi için küçük nanodesenli kalıplardan geniş bir nanodesenli substrat alanı üretmek için bir protokol sunulmuştur.

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Burada, açıklar gerilebilir, Çift Kanal imalatı, organ çip mikrosıvısal hücre kültür cihazlar organ düzeyi işlevlerine içinde in vitrorecapitulating için bir iletişim kuralı mevcut.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

Burada DNA programlı yapıştırma kullanarak mikropattern hücrelere tek hücreli çözünürlükte bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, cam bir slaytta DNA oligonükleotid desenleri oluşturmak için bir tezgah üstü fotolithografi platformu kullanır ve daha sonra hücre zarlarını ticari olarak mevcut tamamlayıcı oligonükleotidlerle etiketler. Oligoların hibridizasyonu programlanmış hücre yapıştırılması ilesonuçlanır.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Bu protokol, Manyetik Arşimet etkisine dayalı mürekkepsiz, etiketsiz, substrattan bağımsız, yüksek verimli bir hücre desenleme yöntemini açıklar.

Manyetik-Arşimet Stratejisini Kullanarak Hücre Modellemesi

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Gömülü demir parçacıkları içeren ultra yumuşak bir silikon elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) kullanılarak üretilen dinamik ve geri dönüşümlü bir sertlik test platformu sunuyoruz. Bu yeni tahlil, temas rehberliği de dahil olmak üzere hücre fenotiplerinde ortaya çıkan zamana bağlı fiziksel değişiklikleri incelemek için uygundur. Burada, manyetikler kullanılarak matriks sertleşmesi üzerine yenidoğan sıçan kardiyomiyosit hizalamasını ölçüyoruz.

Kardiyomiyosit Hizalamasındaki Değişiklikleri Yönlendirmek için Mikro Desenli Manyeto-Reolojik Elastomerler

Öğrenin, mikro desenli PDMS elastik membran üzerindeki hücrelere tek yönlü germe kuvveti uygulama yöntemini. Bu teknik, mitotik memeli hücrelerinde mekanik deformasyonu incelemek için kullanılır.

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Daha fazla video keşfet