PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Bu prosedürün genel amacı, polidimetilsiloksan (PDMS) elastik bir membran üzerindeki desenli hücreleri germektir. Bu işlem, önce PDMS tabakasının hazırlanması ve ardından PDMS üzerine bir mikro desen uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Mikro desenli PDMS tabakası daha sonra germe cihazına monte edilir ve üzerine bir ortam tutma havuzu yerleştirilir.

Ardından, hücreler mikro desenli PDMS tabakasının yüzeyine ekilir ve bağlanmamış hücreleri uzaklaştırmak için yıkama işlemi uygulanmadan önce desenlere tutunmaları beklenir. Son adım, hücreleri germek için hücre içeren PDMS'ye bir uzama uygulanmasıdır. Son olarak, hücre germe sırasında mitotik memeli hücrelerin retraksiyon liflerine kuvvet uygulanmasının hücre deformasyonuna yol açtığını göstermek için video mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, biyomekanik alanındaki "dış kuvvetlerin bölünme gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri nelerdir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, bölünen bir hücreye kuvvet uygulamak istediğimizde ortaya çıktı; öncelikle önceden hazırlanmış bir tabakadan yaklaşık 35 x 20 milimetre boyutlarında bir PDMS parçası kestik. Burada, özel yapım PDMS'e kıyasla daha tekrarlanabilir olduğu ve kırılma olasılığının daha düşük olması nedeniyle ticari olarak mevcut ince bir PDMS tabakası kullanılmıştır.

Plastiğin üst ve alt koruyucu katmanlarını çıkarın ve PDMS'i plastik bir petri kabına yerleştirmek için cımbız kullanın. Ardından PDMS'i, dakikada 30 salınım yapan bir rotator üzerinde beş dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın. Yıkama işleminin ardından, yüzeyin üzerinden hava akışı sağlayarak kurutun.

Ardından, PDMS'i ultraviyole lambalardan yaklaşık beş santimetre uzaklıkta, beş dakika boyunca derin ultraviyole ışığa maruz bırakın. Bu sırada, metin protokolünde açıklandığı şekilde bir E-D-C-N-H-S çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin reaktivitesi birkaç saat içinde azaldığı için, çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.

PDMS levhaları Petri kabından, ışığa maruz kalmamış olan Petri kabı kapağına aktarın. Bu işlem, PDMS çevresinin çok hidrofobik olmasını sağlayacak ve bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.

E-D-C-N-H-S solüsyonunu PDMS üzerine pipetleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla E-D-C-N-H-S'yi su ile yıkayarak uzaklaştırın.

Ardından, PLL aşılanmış PEG çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında üç saatten bir geceye kadar inkübe edin; inkübasyonun ardından, PDMS üzerindeki fazla PLL aşılanmış PEG'i su ile durulayın. PDMS artık PLL aşılanmış PEG ile pasivize edilmiş veya fonksiyonelleştirilmiş durumdadır ve dört derece santigrat sıcaklıkta birkaç gün boyunca saklanabilir. PDMS'yi desenlemek için, bir PDMS tabakasını desenleme için mikro özellikler içeren sentetik kuvars bir foto maske üzerine yerleştirin.

PLL aşılanmış PEG içeren PDMS tarafını, fotomaskenin krom tarafına bakacak şekilde yerleştirin. Ardından, ultraviyole ampullerden yaklaşık beş santimetre uzaklıkta, fotomaske üzerinden yedi dakika boyunca ışınlayın. Işınlamanın ardından.

Maske ve PDMS üzerine su ekleyin, ardından PDMS'yi yavaşça maskeden soyun; daha önce pasivize edilmiş PDMS'yi germe cihazına yerleştirin. PDMS'nin bir tarafını germe cihazının sabit kısmına takın. Diğer tarafı, PDMS tabakasını çok fazla sıkıştırmadan cihazın hareketli kısmına sabitleyin.

PDMS çok fazla sıkıştırılırsa boyu kısalır ve bu durum, aynı gerilme mesafesi için gerilimin daha fazla olması nedeniyle kırılmalara yol açabilir. Vidaların iyice sıkıldığından emin olun, aksi takdirde PDMS tabakası gerilme başladığında veya deneyin ilerleyen aşamalarında kayacaktır. Ardından, PDMS'yi bir saat boyunca fibronectin çözeltisi ile inkübe edin.

Oda sıcaklığında diğer hücre dışı matris proteinlerinin kullanılması mümkündür, ancak bunlar bu protokol ile test edilmemiştir. Son adım olarak, PDMS'yi fosfat tamponlu salin ile durulayın. Ardından, kalın bir PDMS tabakasından dikdörtgen şeklinde bir PDMS parçası kesin.

Ardından içeride başka bir dikdörtgen kesin. Hücreleri ve medyumu tutacak bir havuz oluşturmak için, bu dikdörtgen şeklinde kesilmiş PDMS'in altına silikon gres ekleyin ve medyumu tutacak bir havuz oluşturmak için bunu PDMS tabakasının üzerine yerleştirin. Gres, hücreleri desenlemek için germe işlemi sırasında havuzun PDMS tabakası üzerinde kaymasına olanak sağlayacaktır.

İlk olarak, %50 konfluensle bir kültür flaskındaki hücreleri ayırın. Hücreler süspansiyona girdiğinde, bireysel hücrelerin desene bağlanmasını sağlamak için agregatları parçalamak amacıyla 200 microliter uçlu bir pipetle birkaç kez pipetleyin. Ardından, havuzun içine bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücre tipine bağlı olarak, hücrelerin paternlere bağlanması için 37 °C'lik bir inkübatörde 10 ila 30 dakika bekleyin. Hücreler paternlere tutunduktan sonra, yüzer hücreleri uzaklaştırmak için dengelenmiş besiyeri ile nazikçe yıkayın.

Besiyerini bir aspirasyon pipetiyle çekerken aynı zamanda yeni besiyeri ekleyin. Ayrılmamış hücreleri yıkayıp uzaklaştırmak için yeterli akışı sağlamak ve aynı zamanda hücrelerin besiyeri içinde kalmasını sağlamak kritik önem taşır. Ardından, PDMS'nin kırılması durumunda buharlaşmayı ve besiyeri sızıntısını önlemek için havuzun üzerine bir lamellik yerleştirin ve hücrelerin desenler üzerinde birkaç saat boyunca yayılmasına izin verin.

Ardından cihazı ters mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme işlemine başlayın. Odaklama sorunları nedeniyle çalışmayacağı için yağ daldırma objektiflerin kullanımından kaçının. Mikro desenli hücreleri germek için x, y ve Z eksenlerinde sahne konumunu düzelterek mikrometrik vidayı çevirin.

PDMS'in genişlemesini ve odak kaybını dengelemek için sahne konumunun düzeltilmesi gerekir. Bu video protokolünde sunulan teknik, substratın metafaz başlangıcında gerilmesi yoluyla mitotik memeli hücrelerin retraksiyon liflerine kuvvet uygulanmasına olanak sağlamıştır. Bu retraksiyon liflerinden bazıları hücre gövdesinden uzaklaştırılmış ve bu durum, mitotik hücre korteksine mekanik bir kuvvet uygulanmasıyla sonuçlanmıştır; bunu başarmak için hücre, oval bir desen üzerine ekilmiştir.

Desenleme, foto maske aracılığıyla yuvarlak desenlerin baskısı sırasında PDMS'nin gerilmesiyle gerçekleştirilir. Germe işleminden sonra, desen bir daire haline gelecek şekilde substrat gerilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin makro desenler üzerine nasıl ekilebileceği ve ardından substrata nasıl germe kuvvetleri uygulanabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.