PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Bu prosedürün genel amacı, model hücrelerini poli dimetil suoksan veya PDMS'nin elastik bir zarı üzerinde germektir. Bu, A-P-D-M-S tabakasının yerleştirilmesi ve ardından PDMS üzerinde bir mikro desenin uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Mikro desenli PDMS levhası daha sonra germe cihazına monte edilir ve üstüne orta boy bir tutma havuzu yerleştirilir.

Daha sonra, hücreler mikro desenli PDMS tabakasının yüzeyine kaplanır ve bağlanmamış hücreleri çıkarmak için yıkamadan önce desene yapışmasına izin verilir. Son adım, hücreleri germek için PDMS içeren hücreye bir uzatma uygulamaktır. Sonuç olarak, video mikroskobu, hücre gerilmesinde mitotik memeli hücrelerinin geri çekme liflerine kuvvet uygulanmasının hücrenin deformasyonuna yol açtığını göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, dış kuvvetlerin bölünme gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri gibi biyomekanik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, önceden yapılmış bir tabakadan yaklaşık 35 x 20 milimetrelik bir PDMS parçasını kesmeye başlamak için bir bölme hücresine kuvvet uygulamak istediğimizde aklımıza geldi. Burada, ticari olarak temin edilebilen ince bir PDMS tabakası kullanılır, çünkü ısmarlama ile karşılaştırıldığında daha tekrarlanabilir ve kırılma olasılığı daha düşüktür. PDMS'yi seçin.

Üst ve alt koruyucu plastik katmanları çıkarın ve PDMS'yi plastik bir petri kabına yerleştirmek için cımbız kullanın. Daha sonra PDMS'yi dakikada 30 salınımda bir döndürücü üzerinde beş dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayın. Yıkamanın ardından üzerine hava akıtarak yüzeyi kurulayın.

Daha sonra, PDMS'yi ultraviyole ampullerden yaklaşık beş santimetre uzakta beş dakika boyunca derin ultraviyole ışıkla aydınlatın. Bu arada, metin protokolünde açıklandığı gibi bir E-D-C-N-H-S çözeltisi hazırlayın. Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır, çünkü çözeltinin reaktivitesi birkaç saat içinde bozulur.

PDMS tabakalarını Petri kabından Petri kabının aydınlatılmamış kapağına aktarın. Bu, PDMS'nin çevresinin çok hidrofobik olmasını ve kolaylaştırmasını sağlayacaktır. Bir sonraki adım.

E-D-C-N-H-S solüsyonunu PDMS üzerine pipetleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kuluçka dönemini takiben. Fazla E-D-C-N-H-S'yi suyla durulayın.

Daha sonra, PLL aşılı PEG çözeltisini ekleyin ve inkübasyonu takiben oda sıcaklığında üç saatten gece boyunca inkübe edin, fazla PLL aşılı peg'i PDMS'den suyla durulayın. PDMS şimdi PLL aşılı PEG ile pasifleştirilir veya işlevselleştirilir ve dört santigrat derecede birkaç gün saklanabilir. PDMS yerini desenlemek için, desenleme için mikro özellikleri taşıyan sentetik bir kuvars fotoğraf maskesi üzerine A-P-D-M-S levhası.

PLL aşılı PEG'yi taşıyan PDMS tarafını, fotoğraf maskesinin krom tarafına bakacak şekilde yerleştirin. Ardından, ultraviyole ampullerden yaklaşık beş santimetre uzakta fotoğraf maskesi aracılığıyla yedi dakika boyunca aydınlatın. Aydınlatmanın ardından.

Maskenin ve PDMS'nin üzerine su ekleyin, ardından PDMS'yi maskeden yavaşça soyun, önceden pasifleştirilmiş PDMS'yi germe cihazına takın. PDMS'nin bir tarafını sedyenin sabit kısmına takın. PDMS tabakasını çok fazla sıkıştırmadan diğer tarafı sedyenin hareketli kısmına sabitleyin.

PDMS çok fazla sıkıştırılırsa, kısalır ve bu, aynı gerilme mesafesi için gerginlik daha büyük olacağından frenlemeye neden olabilir. Vidaların iyice sıkıldığından emin olun, aksi takdirde esneme başlar başlamaz veya daha sonra deney sırasında PDMS tabakası kayacaktır. Daha sonra, PDMS'yi bir saat boyunca fibronektin çözeltisi ile inkübe edin.

Oda sıcaklığında, diğer hücre dışı matriks proteinlerini kullanmak mümkündür, ancak bunlar bu protokolle test edilmemiştir. Son adım olarak, PDMS'yi fosfat tamponlu tuzlu su ile durulayın. Ardından, kalın bir PDMS levhasında bir dikdörtgen PDMS kesin.

Sonra içine başka bir dikdörtgen kesin. Hücreleri ve ortamı tutacak bir havuza sahip olmak için, bu dikdörtgen kesimli PDMS'nin altına silikon gres ekleyin ve orta bir tutma havuzu oluşturmak için PDMS tabakasının üzerine yerleştirin. Gres, hücreleri desenlendirmek için germe sırasında havuzun PDMS tabakası üzerinde kaymasına izin verecektir.

İlk olarak, hücreleri %50 co akıcılığında bir kültür şişesinden ayırın. Hücreler süspansiyon halinde kaldıktan sonra, agregaları parçalamak için 200 mikrolitrelik bir uçla birkaç kez pipetleyin, bu da tek tek hücrelerin desene bağlanmasını sağlayacaktır. Ardından, havuza bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücreye bağlı olarak hücrelerin desenlere 10 ila 30 dakika bağlanmasına izin verin. 37 santigrat derece inkübatöre yazın. Hücreler desenlere bağlandıktan sonra, hücreleri yıkamak için yüzen hücreleri dengeli ortamla nazikçe yıkayın.

Ortamı aspirasyonlu bir pipetle çıkarırken aynı anda ortam ekleyin. Hücreleri ortama batırılmış halde tutarken, bağlanmamış hücreleri yıkamak için yeterli akıyı korumak çok önemlidir. Ardından, PDMS'nin kırılması durumunda buharlaşmayı ve orta sızıntıyı önlemek için havuzun üstüne bir örtü fişi ekleyin ve hücrelerin desenler üzerinde birkaç saat yayılmasına izin verin.

Ardından cihazı ters çevrilmiş bir mikroskoba koyun ve görüntülemeye başlayın. Odaklanma sorunları nedeniyle çalışmayacakları için yağa daldırma hedeflerinin kullanımından kaçının. Mikro desen hücrelerini germek için, x, y ve Z eksenlerindeki sahne konumunu düzeltirken mikrometrik vidayı çevirin.

PDMS'nin genişlemesini ve odak kaybını önlemek için sahne konumunun düzeltilmesi gerekir. Bu video protokolünde sunulan teknik, metafazın başlangıcında substratı gererek mitotik memeli hücrelerinin geri çekme lifleri üzerine kuvvetlerin uygulanmasına izin verdi. Bu geri çekme liflerinin bir kısmı hücre gövdesinden çekildi, bu da gerilmeden önce mitotik hücrelerin korteksine uygulanan mekanik bir kuvvetle sonuçlandı, bunu başarmak için hücre oval bir desen üzerine kaplandı.

Desenleme, fotoğraf maskesi aracılığıyla yuvarlak desenlerin izlenimi sırasında PDMS'nin gerilmesiyle yapılır. Gerildikten sonra, alt tabaka, desen bir daire haline gelecek şekilde gerilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücreleri makro desenler üzerinde nasıl plakalayabileceğinizi ve ardından alt tabakaya germe kuvvetleri uygulayabileceğinizi iyi anlamış olmalısınız.