Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fagositlerde fagozom olgunlaşması ve fagolizozom biyogenezinin gerçek zamanlı dinamik sürecini yakalamaktır. Bu, lizozomal bölmelerin görselleştirilmesini ve luminal yükünün fagozomlara aktarılmasını sağlamak için hücrelerin lizozomal bölmelerinin floresan konjuge dex ipliği ile yüklenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, fagositik bir model görevi gören mikropartiküller eklenir.

Daha sonra, lizozomal materyalin fagozomlara verilmesi, canlı satış görüntüleme ve ardından dijital görüntü işleme kullanılarak analiz edilir. Fagozom olgunlaşma sürecini ölçmek için sonuçlar, lizozomal içeriğin fagozomlara verilmesine bağlı olarak çeşitli faktörlerin fagozom olgunlaşma süreci üzerindeki etkisini göstermektedir. Sabit hücrelerde makrofaj olgunlaşmasının değerlendirilmesi gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip kantitatif okumadır Texas kırmızı etiketli 70 kilodalton DExT iplikçik veya Dex 70 KD'yi PBS'de mililitre başına 20 miligramda çözerek başlayın ve alikotları eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, Dex 70 KD stoğunu tam hücre kültürü Docos, modifiye eagles ortamı veya DMEM'de mililitre başına yaklaşık bir miligrama seyreltin. DExT iplikçik alikotunu ultrasonik su banyosunda beş dakika boyunca sonikleştirin. Ardından, çözeltideki herhangi bir topaklanmayı veya kirletici maddeyi çıkarmak için çözeltiyi bir mikro santrifüjde maksimum hızda beş dakika santrifüjleyin.

SuperAgent'ı dikkatli bir şekilde yeni bir tüpe taşıyın ve alttaki peletten kaçının. Daha sonra çözeltiyi, tam hücre kültüründe mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin. DMEM ve filtre.

Çözeltiyi 0.22 mikrometre şırıngaya monte edilmiş bir filtre ile sterilize edin. Daha sonra, iki mililitre kemik iliğinden türetilmiş fare makrofajlarına, mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonuna bakın. Kaplanmamış bir cam alt tabakta DMEM'de, hücreleri% 5 karbondioksit tamponlu bir atmosferde 37 santigrat derecede en az 12 saat inkübe edin.

Bağlanmayı ve alıştırmayı sağlamak için, bağlanmayı ve alıştırmayı sağlamak için, ortamı aspire edin ve cam alt tabağa iki mililitre savaş öncesi DExT iplikçik DMEM ekleyin ve ardından hücreleri inkübasyondan sonra iki ila sekiz saat inkübe edin. Hücreleri ön ısıtmalı tam DMEM ile üç kez yıkayın. Son durulamadan sonra ortamı aspire edin ve iki mililitre tam DMEM ekleyin.

Hücreleri dört ila 12 saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri önceden ısıtılmış fenol kırmızısı içermeyen tam DMEM ile durulayın ve görüntülemeye başlamadan en az 30 dakika önce iki mililitre tam filtrelenmiş fenol kırmızısı içermeyen DMEM ekleyin. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan% 1 IgG kaplı pancar süspansiyonunun bir alikotunu oda sıcaklığına getirin.

Çözeltiyi ultrasonik bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra ikinci sınıf bir biyogüvenlik kabini altında, hücrelere bir ila altı mikrolitre boncuk süspansiyonu ekleyin. Süspansiyonu cam alt tabakta nazikçe karıştırmak için bir pipet kullanarak yoğun boncuk bulutunu dağıtın.

Daha sonra numuneyi mikroskoba getirin ve ilgilenilen bölgeye odaklanın. Hızlandırılmış görüntülemeden önce. Her yedi ila 20 saniyede bir kare yakalayabilmek için tarama, hız büyütme ve çözünürlük dahil olmak üzere ayarları optimize edin.

Kullanılan görüntüleme sistemine ve problara göre uyarma emisyon ayarlarını ayarlayın ve aşırı fotoğraf ağarmasını önlemek için ayarları optimize edin. Ardından hızlandırılmış videoyu yakalayın ve mikroskobunuzun yerel dosya biçiminde kaydedin. Videoyu JPG veya PNG gibi sıkıştırılmış biçimlerde dışa aktarmaktan kaçının.

Ardından, yeniden düzenlenmiş araç menüleri ve ücretsiz olarak sunulan ek yerel eklentiler içeren bir görüntü işleme paketi içeren Fiji ve Image J dağıtımını başlatın. İndirmek. Dosyayı Fiji'de açın ve değerlendirilecek videoyu seçin. Ardından seçenekleri, filtreleri ve ölçüm parametrelerini beraberindeki metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın.

Daha sonra, tam olarak oluşmuş bir yeni oluşmakta olan boncuk fagozomunun oluştuğu ve F asidik kabın kapatıldığı çerçeveyi not ederek görüntüleri tarayın. İçselleştirilmiş boncuk üzerinde dairesel bir ilgi alanı veya yatırım getirisi seçmek için Oval seçim aracını kullanın. Seçimin boncuğun dış kenarına sıkıca oturduğundan emin olun.

Ardından analize gidin ve ölçümü gerçekleştirmek için ölç'e tıklayın. Sonuç, sonuçlar başlıklı ayrı bir pencerede görüntülenecektir. Bir sonraki ilgi çerçevesinde, boncuğun hareket etmesi durumunda ROI'nin konumunu ayarlayın ve sonuçlar penceresindeki listeye eklenecek olan ölçümü tekrarlayın.

Analiz edilen her çerçeve, etiket sütunundaki değere göre tanımlanabilir. İlgili tüm çerçevelerin ölçümünü tamamladıktan sonra, int den sütunundaki değerleri bir elektronik tablo uygulamasına kopyalayın. int den sütunu, seçilen alanın yoğunluklarını gösterir.

Bu yöntemler kullanılarak, DExT iplikçik probları ile yüklenmiş kemik iliği kaynaklı makrofajların net görüntüleri yakalandı. Bu görüntü, hücrenin burada belirtilen IgG kodlu boncuğun alımını tamamladığı sıfır zamanına aittir. Burada gösterilen görüntüler, daha iyi görünürlük için sahte renkliydi ve fagozomu, alımdan sonra sıfırdan 85 dakikaya kadar gösteriyordu.

Ölçülen fagozom, ROI kesikli çizgi ile özetlenir ve fagozomdaki dekstran iletimi ve birikimi örnekleri oklarla gösterilir. Grafikler daha sonra bu görüntülerden oluşturuldu ve zaman içinde fagozom ile sinyal ilişkisinin net bir zamansal eğilimini gösterdi. Bu grafik, burada gösterilen iki hücreden ortalama 10 fagozomu temsil eder.

Mutlak sinyal yoğunluğu genellikle analiz edilen her fagozom arasında değişmekle birlikte, zamansal eğilim normalde çok benzerdir. Dex 70 KD'nin Fagozomlara teslimi, fagositozdan 35 ila 40 dakika sonra bir platoya ulaşıldı. Bu videoyu izledikten sonra, hızlandırılmış konfokal mikroskopi kullanarak fagozom olgunlaşmasını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.