Name: Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesisden Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile makrofajlarda fagosom olgunlaşmasını ve phagolysosome biyogenezini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, immün hücre fonksiyonlarını zamansal çözünürlükle inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının eleştirel okuma için fagosom Biyoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Helmholtz Genç Araştırmacı hibe (Girişimi ve Helmholtz Derneği Ağ fonları) ve Öncelikli Programı Alman Araştırma Konseyi (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) içinde SPP1580 Grant tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Aşağıdaki bölümde sunulan yöntem ve sınırlamalar kritik adımları görüşecek. Ayrıca, biz, onların çözümleri ile yaygın sorunlardan bazıları bağlamak olası değişiklikler tanıtmak ve bizim yöntemin avantajları yanı sıra, bu yaklaşıma uygun tamamlayıcı yöntemler dikkate alacaktır. Boncuk yüzeye IgG bağlanması da dahil olmak üzere boncuklar, preparasyonu, önemlidir ve unfresh preparasyonlar kullanımından kaçınılmalıdır. Buna ilave olarak, dekstran taze her deney öncesi donmuş stok (seyreltilmiş v...

Makrofajlar dahil olmak üzere, profesyonel fagositlerin, bağışıklık sisteminde önemli bir oyun. Doğuştan gelen bağışıklık sistemindeki ilk savunma hattı olmasının yanı sıra, aynı zamanda bir rol 1-3 sunulması da sinyalizasyon ve antijen ile edinilmiş bağışıklık aktivasyonunda kritik bir rol oynamaktadır. Profesyonel fagositlerin işlevi çok yönlü iken, fagosom olgunlaşma profesyonel fagositlerin 4,5 bakterisit ve antijen işleme fonksiyonlarının kritik bir omurgadır. Reseptör aracılı yutulma ve bakteriler gibi bir fagositik hedef, alımından sonra, olgunlaşmamış fagosom etkileşim ve endositik ağ bölümlerinde ve çeşitli diğer hücresel organel 6 değişim karmaşık ve iyi ayarlanmış bir dizisi boyunca geçer. Bileşiklerin yapısı, bu hücresel varlıklar olarak düzenlenmesi ile değiştirilir ve füzyon olayların zamanlama luminal phagosomal ortamı ve phagos belirleromal membran bileşimi ve böylece 7, olgunlaşan fagozomun 8 kaderi. Fagosom olgunlaşma fizyolojik alaka, kaçmak tutuklama veya fagosom olgunlaşmasını 9 yıkmak için çeşitli hücre içi patojenler tarafından istihdam çeşitli stratejiler ile örneklenmiştir. Hidrolitik enzim ve olgun fagozomun 7 arasında anti-bakteriyel faktörler bir kısmı ile endows geç endozomal / lızozomal bölmeli fagozomun füzyon: Bu stratejilerin çoğu doğrudan ya da dolaylı olarak fagosom olgunlaşma sürecinin son ve kritik aşamaya önlemek , 8,10. Doğal fizyolojik bir durum kullanılan ediliyor, özellikle deneysel ayarları altında etkilenen olumlu ya da olumsuz olması halinde, bu nihai ve kritik adım Analizi nedenle phagosomes olgunlaşma durumu hakkında güçlü göstergeler ile bize sağlayabilir ve. Geç endozomal / lizozomal bölmesis genellikle çeşitli varlığı ile erken endositik bölmelerden tanımlanmış ve ayırt edici endositik yolunun terminal bölmeleri, spesifik, marker moleküllerin sahne olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, diğerleri 11 arasında Lizozomal ilişkili membran proteinleri (lambalar) gibi hidrolitik enzimler veya membran bileşenleri için. Terminal endositik bölmeleri-bundan böyle lizozomlar-da fagositik / endositik yolunun 12 sonunda sindirim son aşamaları için ana konum olarak hizmet basitçe olarak anılacaktır. Bu şekilde, sindirilemez sondalar hücre dışı ortamdan endositoz ve makropinositoz yoluyla yüklenebilir ve alımı ve Chase belirlenmiş bir döngü takip sonra 13,14 birikir lizozomlara endositik yolu aracılığıyla taşınır. 15-17 endocyticprobes gibi organik sindirilemez polimer dekstran gibi floresan mikroskobu için fluorofor-konjuge problar yaygın olarak kullanılmaktadır. <p clasBu yöntemde, s = &quot;jove_content&quot;&gt; biz phagosomes için lızozomal luminal içerik teslim analiz ederek fagosom olgunlaşmasını araştırmak fagositik kargo olarak IgG kaplı mikroboncuk kullanımını tarif eder. Canlı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) ve konfokal lazer tarama mikroskobu ile time-lapse video görüntülemede lizozomların bir kolaylıkla saptanabilir marker olarak flüorofor-konjuge dekstran prob kullanarak, yüksek olan phagosomes içine kargo teslim dinamik sürecini takip zamansal çözünürlük. Daha sonra istatistiksel olarak Microsoft Excel kullanarak analiz ve GraphPad yazılımı 14,18 kullanarak sunulan, toplanan time-lapse görüntüleme verileri, açık kaynak kodlu ve serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı, Fiji (veya ImageJ) kullanılarak değerlendirilebilir anlatacağız. Bizim yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler fagosom olgunlaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye ayarları ve faktörler kullanılarak dizayn edilebilir; hemen her otyapışık birincil veya hücre hattı fagositik hücrelerin kendi türü de dahil olmak üzere fonksiyon deneyler genetik kaybı gen nakavt ve knock-down, mutantlar veya füzyon proteinleri, fagositik-hedefler, microbead kaplama bileşikleri, endozomal / lizozomal sondaları ve faktörlerin böyle bir ifade diğerleri arasında sitokinler, kimyasal inhibitörleri veya siRNA bu yöntemin temel yaklaşım uygulanabilir tüm değişkenlerdir. Biz aşağıdaki gibi bu yöntemin hedefi ve temel gereksinimlerini tanımlar: <ul type="disc"><li> Yöntemin Hedef: fagositik canlı hücreler yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fagosom olgunlaşma, doğrudan nicel ve nitel gözlem ve analiz sağlamaktır. </li><li> Fagositik yük: Bir uygun şekilde kaplanmış mikro parçacık veya biyolojik hedef. Burada kolayca Fc-γ reseptörü aracılığıyla fagositoz ile içselleştirilir 3 um küresel polistiren mikro-IgG kaplı kullanın. Seçenek olarak ise, bir mikroorganizma ya da kaplanmış mikrofon, retina reseptör hücrelerde mevcut olduğu için roparticle kullanılabilir. </li><li> Fagositik hücreler: Uygun fagositik reseptörlerini sentezleyen Yapışık fagositik hücreler. Burada bol Fc-γ reseptörlerini ifade fare primer BMMs kullanın. Alternatif olarak, dendritik hücreler (DC), monositler veya fagositik epitel hücreleri ya da bunların mutantlan ya da genetik knock-out varyantlar kullanılabilir. </li><li> Lizozomal kargo: Bir floresan etiketli lizozomal prob. Burada, Texas Red-konjüge edilmiş dekstran 70,000 kiloDalton (Dex70kD) lizozomlara luminal yük olarak kullanılır. Alternatif olarak, bu asitlik veya indirgeyici kapasitesi phagosomal özellikleri için bir hücre bölmesi veya organel ya da uygun bir prob, floresan bir saptanabilir marker ile etiketlenebilir fagosom olgunlaşma ilerlemesini incelemek için kullanılabilir. </li><li> Örneğin, molekülleri, kimyasal bileşikler, gen knock-down, ya da olabilir mutant proteinlerin geçici ifadesini sinyalizasyon: etkileyen faktörler. Burada, biz Förg varbasitlik uğruna böyle bir faktör biri kullanılması, ancak mutant protein ifade ve Kasmapour vd. 18. phagosomes fagositozunu veya şartlar ve hareketlilik etkileyebilir ve / olabilir Herhangi bir faktör bakın lütfen knock-down etkileyen faktörler ile yeni bir örnek ya da olgunlaşma phagosomes etkileşim bölmeleri potansiyel olarak kullanılabilir. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamı (D-MEM)</td> <td>PAA, Avusturya</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fenol kırmızısı içermeyen Modifiye Kartallar Ortamı (D-MEM)</td> <td>PAA, Avusturya</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>PAA, Avusturya</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAA, Avusturya</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Avusturya</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>PAA, Avusturya</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Cam alt çanak (35 mm & boş;, # 1.5)</td> <td>WillCo Wells, Hollanda</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM cam alt çanak, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Almanya</td><td>627871</td><td>Alternatif: Segmentli</td></tr><tr><td>Karboksilatlı lateks mikrokürecikler</td> olarak mevcuttur <td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Farklı çaplarda mevcuttur, 3 &mu kullandık; m</td></tr><tr><td>Polistiren mikropartiküller</td><td>Kisker Biotech, Almanya</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Almanya</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>fare bütün IgG</td><td>Rockland, ABD</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC çapraz bağlayıcı</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga Omnifix -F</td><td>B.Braun, Almanya</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; G iğnesi (0.45 * 25 mm)</td> <td>B.Baun, Almanya</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Avusturya</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Gibco, ABD</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES hidrat</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & mu; M şırıngaya monte filtre</td><td>Sartorius, Almanya</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı makrofagların içinde phagolysosome biogenesis&#39;den Çalışması

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Fagositik hücreler kaldırma ve phagosomes istila mikroorganizmaları ortadan kaldırarak, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynamaktadır. Fagosom olgunlaşma olgunlaşmamış bir fagosom sitoplazmada çeşitli hücresel organellere ve bölmeleri ile iyi yönetilen bir etkileşimler yoluyla köklü dönüşüme uğrar sırasında karmaşık ve sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Onların litik ve bakterisidal özellikleri ile phagosomes donatarak fagositik hücrelerin fizyolojik fonksiyonu için gerekli olan bu süreç, lizozomlar ve phagosomes için olgunlaşma son ve kritik aşama olarak kabul edilir fagolizozomları arasında biyotekvinin ile phagosomes füzyonu sona eriyor. Bu raporda, biz phagolysosome biyotekvinin bir özelliğidir içerik dağıtım, fagosom için lizozoma dinamik süreci kalitatif ve kantitatif analiz için canlı hücre görüntüleme bazlı yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, phagocy için bir model olarak IgG kaplı mikro-boncuklar kullanırbir lizozomal luminal yük prob olarak apoptosisi ve fluorofor ile konjüge edilmiş dekstran molekülleri, zaman atlamalı görüntüleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak canlı makrofajlarda gerçek zamanlı olarak phagosomes için lysosmal dinamik içerik teslim takip etmek amacıyla. Burada ayrıntılı olarak arka plan, hazırlık aşamaları ve diğer laboratuvarlar bu yöntemin kolay ve hassas bir dağıtım sağlamak için adım adım bir deney düzeneği tarif. Bizim tanımlanan metot basit, sağlam, ve en önemlisi, kolayca farklı sistemlerde ve örneğin çeşitli fagositik hücreler türleri, kayıp-fonksiyon deneyleri, farklı prob kullanımı gibi çeşitli deneysel ayarları altında phagosomal etkileşimleri ve olgunlaşmasını çalışmak için adapte edilebilir, ve Fagositik parçacıklar.

Görüntüleme için hücrelerin ve boncukların doğru hazırlama kritik önem taşır. Şekil 1 BMMs için Optimize edilen protokolüne bağlı olarak tohumlama, prob yükleme ve bu yöntemde ilk görüntüleme adımlar, ana hatlarını göstermektedir. Bu protokol parametreleri hücreleri ve kullanılacak olan sondaların türüne bağlı olarak test edilmiş ve optimize edilmesi bu nedenle önemlidir. Önceden yüklenmiş hücrelere IgG kaplı boncuk ilave edildikten sonra, bu büyütme önceden tanımlanmış ayar...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fagositoz yapan hücrelerde fagozom olgunlaşması ve fagolizozom biyogenezinin gerçek zamanlı dinamik sürecini yakalamaktır. Bu, lizozomal kompartmanların görselleştirilmesini ve lüminal kargonun fagozomlara aktarılmasını sağlamak için hücrelerin lizozomal kompartmanlarının floresan konjuge dekstran ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, fagositik bir model görevi gören mikropartiküller eklenir.Ardından, lizozomal materyalin fagozomlara iletimi, canlı hücre görüntüleme ve ardından gelen dijital görüntü işleme kullanılarak analiz edilir. Fagozom olgunlaşma sürecini nicelleştirmek amacıyla sonuçlar, lizozomal içeriğin fagozomlara iletimine dayanarak çeşitli faktörlerin fagozom olgunlaşma süreci üzerindeki etkisini gösterir. Sabitlenmiş hücrelerde makrofaj olgunlaşmasının değerlendirilmesi gibi mevcut yöntemlere göre bu tekniğin temel avantajı, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip nicel okumadır. Texas red ile işaretlenmiş 70 kilodalton DExT dizisini veya Dex 70 KD'yi PBS içerisinde 20 mg/mL konsantrasyonda çözerek başlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın.Ardından, Dex 70 KD stok çözeltisini, tam hücre kültürü Docos, modifiye eagles ortamı veya DMEM ile yaklaşık bir miligram per mililitre olacak şekilde seyreltin. DExT strand alikotunu ultrasonik su banyosunda beş dakika boyunca sonike edin. Daha sonra, çözeltideki topaklanmaları veya kontaminantları gidermek için çözeltiyi bir mikro santrifüjde maksimum hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.Alt kısımdaki peleti almamaya dikkat ederek SuperAgent'ı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Ardından çözeltiyi, tamamlanmış hücre kültürü DMEM ve filtreleme işlemi sonrası mililitre başına 20 micrograms konsantrasyonundaki son çalışma konsantrasyonuna seyreltin.Çözeltiyi 0,22 mikrometre şırınga montajlı filtre aracılığıyla sterilize edin. Ardından, kemik iliği kaynaklı fare makrofajlarını mililitrede 5 × 10⁴ hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde iki mililitre hacminde hazırlayın. Kaplanmamış cam tabanlı bir kap içerisindeki DMEM ortamında, hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit tamponlu atmosferde en az 12 saat boyunca inkübe edin.Yapışmayı ve yapışma sonrası aklimatizasyonu sağlamak için besiyerini aspire edin, cam tabanlı kaba iki mililitre ön ısıtılmış DExT strand DMEM ekleyin ve ardından hücreleri iki ila sekiz saat boyunca inkübe edin. Hücreleri ön ısıtılmış komple DMEM ile üç kez yıkayın. Son durulamadan sonra besiyerini aspire edin ve iki mililitre komple DMEM ekleyin.Hücreleri 4 ila 12 saat boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri önceden ısıtılmış fenol kırmızısı içermeyen komple DMEM ile durulayın ve görüntüleme başlamadan en az 30 dakika önce iki mililitre komple filtrelenmiş fenol kırmızısı içermeyen DMEM ekleyin. Sonrasında, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan %1 IgG kaplı boncuk süspansiyonunun bir alikotunu oda sıcaklığına getirin.Çözeltiyi ultrasonik bir su banyosunda iki ila üç dakika boyunca sonike edin. Ardından, sınıf iki biyogüvenlik kabini altında, hücrelere bir ila altı µL boncuk süspansiyonu ekleyin. Cam tabanlı kapta süspansiyonu pipet yardımıyla nazikçe karıştırarak yoğun boncuk bulutunu dağıtın.Ardından numuneyi mikroskoba götürün ve ilgilenilen bölgeye odaklanın. Zaman ayarlı görüntüleme öncesinde; her yedi ila 20 saniyede bir kare yakalayabilmek için tarama, hız, büyütme ve çözünürlük dahil olmak üzere ayarları optimize edin.Uyarılma emisyon ayarlarını kullanılan görüntüleme sistemine ve problara göre düzenleyin ve aşırı fotobleaching'i önlemek için ayarları optimize edin. Ardından time lapse videoyu kaydedin ve mikroskobunuzun yerel dosya formatında saklayın. Videoyu JPG veya PNG gibi sıkıştırılmış formatlarda dışa aktarmaktan kaçının.Ardından, yeniden düzenlenmiş araç menüleri ve ücretsiz olarak sunulan ek yerleşik eklentiler içeren bir görüntü işleme paketine sahip olan Fiji ve Image J dağıtımını başlatın.İndir. Dosyayı Fiji'de açın ve değerlendirilecek videoyu seçin. Daha sonra seçenekleri, filtreleri ve ölçüm parametrelerini beraberindeki metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde ayarlayın.Ardından, tamamen oluşmuş bir başlangıç boncuk fagosomunun oluştuğu ve F asidik çanağının kapandığı kareyi not ederek görüntüleri tarayın. İçselleştirilmiş boncuk üzerinde dairesel bir ilgi alanı veya ROI seçmek için Oval seçim aracını kullanın. Seçimin boncuğun dış kenarına tam olarak oturduğundan emin olun.Ardından analiz (analyze) bölümüne gidin ve ölçümü gerçekleştirmek için ölç (measure) butonuna tıklayın. Sonuç, sonuçlar (results) başlıklı ayrı bir pencerede görüntülenecektir. İlgilenilen bir sonraki karede, boncuk hareket etmişse ROI konumunu ayarlayın ve ölçümü tekrarlayın; bu ölçüm, sonuçlar penceresindeki listeye eklenecektir.Analiz edilen her kare, etiket sütunundaki değere göre tanımlanabilir. İlgili tüm karelerin ölçümü tamamlandıktan sonra, int den sütunundaki değerleri bir hesap tablosu uygulamasına kopyalayın. int den sütunu, seçilen alanın yoğunluklarını göstermektedir.Bu yöntemler kullanılarak, DExT zincir probları yüklenmiş kemik iliği kaynaklı makrofajların net görüntüleri yakalanmıştır. Bu görüntü, hücrenin burada belirtilen IgG kodlu boncuğun alımını henüz tamamladığı sıfırıncı zamana aittir. Burada gösterilen görüntüler, daha iyi görünürlük için yalancı renklendirilmiş olup, alımdan sonraki sıfır ile 85 dakika arasındaki fagozomu tasvir etmektedir.Ölçülen fagozom, ROI kesikli çizgiyle belirtilmiştir ve dekstranın fagozoma iletimi ile burada birikmesi oklarla gösterilmiştir. Daha sonra bu görüntülerden grafikler oluşturulmuş olup, bu grafikler sinyalin fagozomla olan etkileşiminin zaman içindeki belirgin temporal eğilimini göstermektedir. Bu grafik, burada gösterilen iki hücreden alınan 10 fagozomun ortalamasını temsil etmektedir.Mutlak sinyal yoğunluğu analiz edilen her fagosom arasında genellikle farklılık gösterse de, zamansal eğilim normalde oldukça benzerdir. Dex 70 KD'nin fagosomlara iletiminde, fagositozdan sonraki 35 ila 40 dakika içinde bir platoya ulaşılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, zaman ayarlı konfokal mikroskopi kullanarak fagosom olgunlaşmasının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) tip 1 ile veya bu virüs olmadan enfekte olmuş canlı hücrelerde hücre merkezine doğru hareket eden fagozomların hızını, floresan enfekte hücreleri tanımlamak için eğirme disk konfokal floresan mikroskobu ve fagozomları tespit etmek için parlak alan mikroskobu kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Burada, Candida albicans mantarları ve zimozan ve IgG kaplı boncuklar dahil olmak üzere 0,5 μm'den büyük partiküller gibi patojenlerin fagositozu sırasındaki olayların erken kaskadlarını görselleştirmek ve ölçmek için mikroskop tabanlı bir tekniği açıklıyoruz.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Bu çalışma, memeli hücrelerinde Godanti Bhasma (GB) parçacıklarının fagositik işlenmesini, hücresel alımlarını, vakuol dinamiklerini, asitleşmelerini ve bozunmalarını karakterize ederek aydınlatmaktadır. Bu bulgular sadece temel fagositoz mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda GB'yi yeni terapötik stratejiler geliştirmek için umut verici bir model sistem olarak kurar.

Memeli Hücrelerinde Godanti Bhasma Tarafından Tetiklenen Fagositozun Sıralı Hücresel Olaylarının Araştırılması

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile makrofajlarda fagosom olgunlaşmasını ve phagolysosome biyogenezini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, immün hücre fonksiyonlarını zamansal çözünürlükle inceler.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması

Daha fazla video keşfet