Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, diğer ekspresyon konakçılarında üretilemeyen miligram miktarlarda Miran Kinlin üç ve böcek hücre kültürünü verimli bir şekilde üretmektir. Bu, KINLIN üç genini taşıyan rekombinant bir bao virüsü oluşturmak için tasarlanmış bir bao virüsü ile birlikte bir KINLIN üç transfer vektörü olan COT transektasyonu ile elde edilir. İkinci adım olarak, virüs, gelecekteki adımlar için yeterli miktarda virion üretmek üzere böcek hücrelerinin içinde büyütülür.

Daha sonra böcek hücreleri, hızlı sıvı kromatografisi ile saflaştırmamıza izin vermek için büyük miktarlarda Kinlin üç proteini üretmek üzere enfekte edilir. SDS sayfa analizi ve boyut dışlama kromatografisine dayalı olarak miligram miktarlarında yüksek saflıkta fonksiyonel kinlin üçünün üretilebileceğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin bakterilerde üç ekspresyon çırpmak gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, makula virüsü ile enfekte böcek hücresi ekspresyonunun rekombinant protein verimini on kat artırmasıdır.

Bu prosedür için SF dokuz hücreleri, mililitre penisilin başına 100 mikrogram ve mililitre streptomisin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş SF 902 ortamı kullanılarak süspansiyon halinde kültürlenir ve muhafaza edilir. Bao virüsü üretimi için, hücreler mililitre başına beş çarpı 10 ila beş ila bir çarpı 10 ila altı hücre arasında bir yoğunluk aralığına kültürlenmelidir. SF dokuz hücresini transfeksiyon için hazırlamak için, penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş iki mililitre SF 902 ortamında steril altı kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyusu başına yaklaşık bir kez 10 ila altı hücreye bakın, SF dokuz hücreyi plastik kuyucukların tabanına yapışması ve böylece tek katmanlı bir rekombinant balo virüsü oluşturması için davlumbazda oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bırakın plazmid, DNA ve BMid DNA'yı tek katmanlı bir SF dokuz kültürüne manşon transekte ederek.

Ekspresyon vektörü papin nöron firması T üç, fare KINLIN üç gen firması T üç'e sahiptir. P 10'un kontrolü altında, BAO viral promotörü, arka orta ile rekombinasyona izin vermek için yan bao viral dizilerine sahiptir ve her transfeksiyon için aşağı akış saflaştırması için bir C terminali tıslama altı etiketini kodlar, bir ila iki mikrogram saflaştırılmış MFI T yapar, 0.5 mikrogram saflaştırılmış B mid ile üç ve antibiyotiksiz 100 mikrolitre SF 902 SFM yapar. Bu, ayrı bir tüpte çözelti A'dır, iki reaktifte altı mikrolitre hücre etkisini antibiyotik olmadan 100 mikrolitre SF 902 SFM ile seyreltin.

Her transfeksiyon reaksiyonu için, çok sayıda transfekt gerekiyorsa, azaltılmış sıvı işlemesi için burada bir ana karışım oluşturulabilir. Bu çözelti B.İki çözelti A ve B'yi, transfeksiyon başına yaklaşık 200 mikrolitre kullanarak karıştırın ve 20 dakika sonra lipid DNA kompleksleri oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, lipid DNA komplekslerini antibiyotiksiz SF 902 SFM transfeksiyonu başına 800 mikrolitre ile seyreltin. Ardından, SF dokuz hücreli tek katmanlı ortamı dikkatlice aspire edin ve AB çözeltisini ve ortam karışımını SF dokuz tek katmanlı üzerine dikkatlice pipetleyin.

Hücrelerin kurumasını önlemek için nemlendirilmiş bir ortam oluşturmak için, transfekte edilmiş hücreleri gece boyunca 27 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Altı kuyulu tabağı nemli bir kağıt havluyla birlikte plastik ışıklı bir kaba koyun. Ertesi gün, antibiyotiksiz SFM'ye bir mililitre daha SF 900 ekleyin Her tek katmanlı kültüre, hücreleri beş gün daha 27 santigrat derecede inkübe edin.

Beş gün sonra, rekombinant bao virüsünü doğrudan kültür ortamından hasat edin ve temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş dakika boyunca 1000 Gs'de santrifüjleme ile herhangi bir SF dokuz hücre kalıntısını netleştirin. Oda sıcaklığında, elde edilen süper isimlerde bulunan ve P bir olarak gösterilen virüsü temiz bir tüpe aktarın, P bir virüs neslinin, mililitre başına 10 ila yedi PFU'luk bir viral titreye sahip olduğu varsayılabilir.

Gerekirse bir plak SA gerçekleştirilebilse de, P bir viral stoğu SF'yi kullanana kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın, süspansiyonda rekombinant balo virüsünün amplifikasyonu için kullanılan dokuz hücre, mililitre başına 1.4 kez 10 ila altı hücre yoğunluğunda olmalı ve kültür, toplam şişe hacminin 20'de birini işgal etmelidir. Örneğin, iki litrelik bir şişede 50 mililitre. Genel olarak optimum vao virüsü amplifikasyonu ve protein üretimi için, SF dokuz hücresi boyut olarak tek tip ve küresel olmalıdır.

Aşağıdaki formülü kullanarak SF dokuz hücre kültürünü, çok sayıda enfeksiyon veya 0.1'lik MOI'de P bir viral stok ile enfekte edin. P one enfekte böcek kültürünü 27 santigrat derecede 100 RPM'de 72 saat çalkalayarak inkübe edin. Üç gün sonra, beş dakika boyunca 1000 Gs'de santrifüjleme ile hücreleri ortamdan ayırarak virüsü hasat edin.

Oda sıcaklığındaki transferde, arıtılmış virüs ortamı temiz bir tüpe zenginleştirir. Bu viral stok, P iki olarak gösterilir ve beklenen viral titre, mililitre başına iki kez 10 ila sekiz PFU'dur. Bu viral stoğu kullanana kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın, elde edilen hücre peletlerini daha sonra rekombinant virüs üretiminin doğrulanması için eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Bu işleme başlamak için, süspansiyon ve SF 902 s fm'de yeterli miktarda SF dokuz hücre kültürü büyütün. Mililitre penisilin başına 100 mikrogram ve mililitre streptomisin başına 100 mikrogram ile desteklenmiştir. Toplam kültür hacminin şişe hacmine oranı bir ila beş olmalıdır.

Süspansiyon kültürlerini 27 santigrat derecede inkübe edin ve mililitre başına altı hücre olmak üzere iki kez 10 ila altı hücre hücre yoğunluğuna ulaşana kadar 100 RPM'de çalkalayın. SF dokuz kültürleri, mililitre başına iki kez 10 ila altı hücre yoğunluğunda olduğunda, balo virüsü enfeksiyonu için hazırdırlar. Kültürleri% 1 fetal sığır serumu nihai konsantrasyonu ve ardından P iki viral stok ile destekleyin.

Enfekte olmuş kültürleri enfeksiyondan 72 saat sonra 100 RPM'de çalkalanarak 27 santigrat derecede inkübe eden bir MOI vermek için, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 GS'de santrifüjleme ile SF dokuz hücreyi eksprese eden rekombinant poli histamin etiketli lin üçünü hasat edin. Elde edilen hücre peletini kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede veya uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu prosedür buz üzerinde çözdürme ile başlar.

Vao virüsünün donmuş peletleri, SF dokuzunu rekombinant kinlin üçünü eksprese eder ve Resus, peletleri lizis tamponu ile süspanse eder. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri lizis tamponu ile beş ila 10 dakika inkübe ettikten sonra, daha fazla hücre bozulması için homojen bir reçine süspansiyonu elde edilene kadar girdaplayın. Numuneyi bir buz banyosunda sonikleştirin.

Lizatı, dört santigrat derecede bir saat boyunca 48.000 GS'de santrifüjleme ile netleştirin. Elde edilen süper isimleri, dakikada bir mililitre hızında dört santigrat derecede lizis tamponu ile önceden dengelenmiş beş mililitre hacimli bir hist tuzağı sütununa yükleyin. Protein elüsyonu, tampon değişimi ve protein konsantrasyonu için sonraki adımlar burada gösterilmeyecektir, ancak beraberindeki makalede ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Tampon değişim protein çözeltisi elde edildikten sonra, dakikada 0.5 mililitre hızında bir ACTA FPLC kullanarak önceden dengelenmiş beş mililitre hacimli, yüksek tuzak heparin HP kolonuna uygulayın. Bağlı KINLIN üç, aynı tamponda mililitre rekombinant histamin etiketleri başına 10 milimolar oranında artan doğrusal bir sodyum klorür gradyanı kullanılarak ima edilir. KINLIN üç'ün, proteini konsantre ettikten sonra yaklaşık 0.6 molar sodyum klorürde elüte olması beklenir, son adım, boyut dışlama kromatografisi kullanarak proteini tampon olarak değiştirmek, saflaştırılmış proteini bir SUEx S 210 30 kolonuna uygulamak, proteinleri boyuta göre saflaştırmaktır

Kolondan ima edilen protein, 280 nanometrede emici kullanılarak fraksiyonlanır ve izlenir. Rekombinant virüs üretiminin başarısı, rekombinant Kinlin üç ve COT TRANSFEKTE EDILMIŞ SF dokuz hücresinin varlığının SDS sayfası ve bu temsili Batı kanında görüldüğü gibi Western analizi ile değerlendirilerek doğrulandı. Büyük ölçekli deneylerde SF dokuz hücre. Rekombinant KINLIN üç, immobilize metal afinite kromatografisi ile kısmen saflaştırıldı.

Bu şekildeki ana jel görüntüsü, nikel afinitesinin SDS sayfasını göstermektedir, saflaştırılmış rekombinant murin, kinlin, BAO virüsü ile enfekte olmuş SF'de eksprese edilen üç, dokuz hücre emilen protein, jel görüntüsünün üzerinde gösterilen bir ole gradyanı kullanılarak ima edildi. MW, moleküler ağırlık belirtecini gösterir, LYS tüm hücre lizatıdır, FT içinden geçen akış, WI birinci yıkama ve WII yıkama ikidir. Western blot analizi, rekombinant protein üzerindeki tasarlanmış his etiketinin varlığını doğrulamak için elüsyon fraksiyonları kullanılarak da gerçekleştirildi.

Daha sonra, kısmen saflaştırılmış KINLIN üç, bir heparin kolonu kullanılarak iyon değişim kromatografisi ile homojenliğe yakın bir şekilde saflaştırıldı. Bu panel, mavi renkte 280 nanometrede gözlemlenen elusiyen profilini gösterir ve 0.05 molar ila 1.0 molar arasında bir sodyum klorür konsantrasyon aralığı kullanılarak yeşil ile gösterilen doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında kaçan tek bir simetrik tepe gösterir. Alt panel, 75 kilodalton proteini Kinlin üçünün varlığını gösteren fraksiyone elüsyonun SDS sayfa analizinin sonuçlarını gösterir.

Son adım olarak, KINLIN üç saflığı, agregaları uzaklaştırmak ve homojenlik elde etmek için boyut dışlama kromatografisi ile parlatıldı. Bu temsili jel filtrasyon elisiyen profili, Tris HCL pH 7.5 150 milimolar sodyum klorürde bir SUEx S 200 ve 20 santigrat derecede bir milimolar DTT kullanılarak saflaştırılmış Kinlin üçlüdür. Elüsyon hacmine bağlı olarak, KINLIN üç, 75 kilodaltonluk bir protein için beklendiği gibi göç eder ve bu da ağırlıklı olarak monomerik olduğunu düşündürür.

Bu sonraki şekil, mililitre başına 14.5 miligramda K üç etiketli yüksek konsantrasyonlu saflaştırılmış rekombinant kinlinin SDS sayfasından elde edilen sonuçları göstermektedir. Miligram miktarlarında yüksek saflıkta tam uzunlukta fare, kinlin üç ve böcek hücresi kültürünün üretimi, proteinin kapsamlı yapısal çalışmalarına ve biyokimyasal analizine izin verecektir. Bu çalışmada, KINLIN üç için hangi tamponların stabilize edici olduğunu belirlemek için termo zemin bazlı bir termo kaydırma testi de gerçekleştirildi.

KINLIN üç, sodyum klorür konsantrasyonuna karşı iki boyutlu bir pH ekranı içeren çeşitli tamponlara seyreltildi. Üst panel, geçiş sıcaklıklarının 3 boyutlu bir histogramıdır ve alt panel, hesaplanan ortalama 50.4 santigrat dereceden geçiş sıcaklığındaki değişimi gösterir. Çubuklar, karşılık geldikleri sıcaklık aralığına göre renklendirilir.

KINLIN üçün, 55 santigrat derece tutarlı bir geçiş sıcaklığı ile 7.0 ila 9.0 PA aralığında yüksek sodyum klorür konsantrasyonlarında stabil olduğu gözlendi. Kinlin üçünün geçiş sıcaklığının 7.0 ila 7.5 PA aralığında yaklaşık 55 santigrat derece olduğu da gözlendi. Sodyum klorür konsantrasyonundan bağımsız olarak.

Bu videoyu izledikten sonra, son derece saf fonksiyonel rekombinant çıranın nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Derinlemesine biyofiziksel karakterizasyon ve daha fazla araştırma için üç. Benzer yaklaşımlar, hazırlanması zor olan diğer protein örneklerinde de kullanılabilir ve bu gibi durumlarda uygulanmasını öneririz.