Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, diğer ekspresyon konakçılarında üretilemeyen Miran Kinlin three'den miligram miktarlarda, böcek hücre kültürü içinde verimli bir şekilde üretmektir. Bu işlem, KINLIN three transfer vektörünün, rekombinant bir bao virüsü oluşturmak için modifiye edilmiş bir bao virüsü omurgasıyla COT transeksiyonu yoluyla birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak virüs, sonraki aşamalar için yeterli miktarda virion üretmek amacıyla böcek hücreleri içerisinde amplifiye edilir.

Ardından, hızlı sıvı kromatografisi yoluyla saflaştırma yapabilmek için yüksek miktarlarda Kinlin three proteini üretmek amacıyla böcek hücreleri enfekte edilir. SDS page analizi ve boyut dışlama kromatografisine dayalı olarak, yüksek saflıkta fonksiyonel kinlin three proteininin miligram düzeyindeki miktarlarda üretilebildiği sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, bakterilerde kindling three ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, baculovirus ile enfekte edilmiş böcek hücresi ekspresyonunun rekombinant protein verimini on kat artırmasıdır.

Bu prosedür için kullanılan SF nine hücreleri, mililitrede 100 mikrogram penisilin ve mililitrede 100 mikrogram streptomisin ile desteklenmiş SF 902 besiyerinde süspansiyon halinde kültüre edilir ve muhafaza edilir. Bao virüsü üretimi için hücreler, mililitrede 5 × 10⁵ ile 1 × 10⁶ hücre yoğunluğu aralığına kadar kültüre edilmelidir. SF nine hücrelerini transfeksiyon için hazırlamak üzere, steril bir altı kuyuklu doku kültürü plakasının her kuyucuğuna, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş 2 mL SF 902 besiyeri içerisinde yaklaşık 1 × 10⁶ hücre ekleyin; SF nine hücrelerinin plastik kuyucukların tabanına yapışıp bir monokatman oluşturması için hücreleri çeker ocak altında oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bekletin. Rekombinant balo virüsü üretimi, plazmid DNA ve BMid DNA'nın bir monokatman SF nine kültürüne birlikte transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir.

pAPIN neuron firm T3 ekspresyon vektörü, P10 BAO viral promotörünün kontrolü altında olan fare KINLIN3 geninin firm T3 versiyonunu taşır; vektör, back mid ile rekombinasyona izin vermek için çevreleyici BAO viral dizilere sahiptir ve sonraki saflaştırma işlemleri için C-terminalinde bir his6 etiketi kodlar. Her transfeksiyon için 1-2 µg saflaştırılmış MFI T3, 0,5 µg saflaştırılmış B mid ve antibiyotiksiz 100 µL SF 902 SFM kullanılarak bir karışım hazırlayın. Bu, çözelti A'dır. Ayrı bir tüpte, 6 µL Cellfectin 2 reaktifini antibiyotiksiz 100 µL SF 902 SFM ile seyreltin.

Birçok transfeksiyon gerekiyorsa, sıvıla taşıma işlemlerini azaltmak için her transfeksiyon reaksiyonu için burada bir ana karışım (master mix) hazırlanabilir. Bu, çözelti B'dir. Her transfeksiyon başına yaklaşık 200 µL olacak şekilde A ve B çözeltilerini karıştırın ve lipid DNA kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin; 20 dakika sonra, lipid DNA komplekslerini transfeksiyon başına 800 µL antibiyotiksiz SF 902 SFM ile seyreltin. Ardından, SF 9 hücre monotaban besiyerini dikkatlice aspire edin ve AB çözeltisi ile besiyeri karışımını dikkatlice SF 9 monotabanının üzerine pipetleyin.

Hücrelerin kurumasını önlemek amacıyla nemli bir ortam oluşturmak için, transfekte edilen hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 27 °C'de gece boyunca inkübe edin. Altı kuyucuklu plağı, nemli bir kağıt havlu ile birlikte plastik kapaklı bir kaba yerleştirin. Ertesi gün, her bir monokatman kültüre antibiyotiksiz SFM içeren ek bir mililitre SF 900 ekleyin ve hücreleri 27 °C'de beş gün daha inkübe edin.

Beş gün sonra, rekombinant bao virüsünü doğrudan kültür ortamından hasat edin ve temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir SF nine hücre kalıntısını 1000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek temizleyin. Oda sıcaklığında, sonuç olarak ortaya çıkan süpernatantta bulunan ve P1 olarak adlandırılan virüsü temiz bir tüpe aktarın. P1 virüs neslinin beklenen viral titresinlele 1 × 10⁷ PFU/ml olduğu varsayılabilir.

Gerektiğinde plak SA yapılabilse de, P1 viral stokunu kullanıma kadar dört derece Celsius'ta karanlıkta saklayın; rekombinant balo virüsünün amplifikasyonu için süspansiyon şeklinde kullanılan SF9 hücreleri 1,4 × 10⁶ hücre/mL yoğunlukta olmalı ve kültür, toplam flask hacminin yirmide birini kaplamalıdır. Örneğin, iki litrelik bir flaskta 50 mL. Genellikle optimum vao virüs amplifikasyonu ve protein üretimi için SF9 hücreleri boyutca tekdüze ve küresel olmalıdır.

Aşağıdaki formülü kullanarak, SF nine hücre kültürünü 0,1 enfeksiyon çokluğu veya MOI ile P one viral stok ile enfekte edin. P one enfekte edilmiş böcek kültürünü 27 °C'de, 100 RPM çalkalama ile 72 saat boyunca inkübe edin. Üç gün sonra, hücreleri 1000 Gs'de beş dakika santrifüj ederek medyumlardan ayırıp virüsü hasat edin.

Oda sıcaklığında, berraklaştırılmış virüsle zenginleştirilmiş medyumu temiz bir tüpe aktarın. Bu viral stok P2 olarak adlandırılır ve beklenen viral titresi mililitre başına 2 × 10⁸ PFU'dur. Bu viral stoğu kullanıma kadar 4 °C'de, karanlıkta saklayın; elde edilen hücre peletlerini, rekombinant virüs üretiminin daha sonra onaylanması için -20 °C'de saklayın.

Bu prosedüre başlamak için, süspansiyonda ve 100 µg/mL penisilin ile 100 µg/mL streptomisin ilaveli SF 902 s fm içinde yeterli hacimde SF nine hücre kültürü büyütün. Toplam kültür hacminin erlen hacmine oranı bir beşe olmalıdır.

Süspansiyon kültürlerini, hücre yoğunluğu 2 × 10⁶ hücre/mL seviyesine ulaşana kadar 27 °C'de 100 RPM hızında çalkalayarak inkübe edin. SF9 kültürleri 2 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğa ulaştığında, balo virüsü enfeksiyonu için hazır hale gelirler. Kültürleri %1 son konsantrasyonda fetal bovine serum ile destekleyin ve ardından P2 viral stokyla takviye edin.

1 MOI sağlamak için, enfekte kültürleri 27 °C'de, 100 RPM çalkalamayla enfeksiyondan 72 saat sonra inkübe edin; rekombinant poli-histidin etiketli lin three eksprese eden SF nine hücrelerini oda sıcaklığında, 1000 ×g'de 20 dakika santrifüj ederek hasat edin. Elde edilen hücre peletini kullanıma kadar -20 °C'de veya uzun süreli saklama için -80 °C'de muhafaza edin. Bu prosedür, buz üzerinde çözdürme işlemi ile başlar.

Rekombinant kinlin three ve Resus eksprese eden vao virüsü enfekte SF nine dondurulmuş peletleri, lizis tamponu ile süspande edilir. Resüspande edilen hücreler lizis tamponu ile 5 ila 10 dakika inkübe edildikten sonra, hücrelerin daha fazla parçalanması için homojen bir resüspansiyon elde edilene kadar vortekslenir. Numune, buz banyosunda sonikasyon işlemine tabi tutulur.

Lizatı, 4 °C'de bir saat boyunca 48,000 GS hızında santrifüj ederek berraklaştırın. Elde edilen süpernatantı, 4 °C'de lizis tamponu ile önceden dengelenmiş beş mililitre hacmindeki bir histrap kolonuna dakikada bir mililitre hızla yükleyin. Protein elüsyonu, tampon değişimi ve protein konsantrasyonuna yönelik sonraki adımlar burada gösterilmeyecek olup beraberindeki makalede detaylandırılmıştır.

Tampon değişimli protein çözeltisi elde edildikten sonra, ACTA FPLC kullanarak bu çözeltiyi, önceden dengelenmiş beş mililitre hacimli bir high trap heparin HP kolonuna dakikada 0.5 mililitre hızla uygulayın. Bağlanan KINLIN 3, aynı tampon içerisinde mililitre başına 10 milimolar hızla artan doğrusal bir sodyum klorür gradyanı kullanılarak elüe edilir. KINLIN 3'ün yaklaşık 0.6 molar sodyum klorür değerinde elüe olması beklenir; protein konsantre edildikten sonraki son adım, boyut dışlama kromatografisi kullanarak proteinin tampon değişimini gerçekleştirmektir. Purifiye edilmiş proteini bir Superdex 200 10/300 GL kolonuna uygulayın ve kolona dakikada 0.5 mililitre hızla tampon uygulayarak proteinleri boyutlarına göre saflaştırın.

Kolondan elüye edilen protein fraksiyonlarına ayrılır ve 280 nanometrede absorbans kullanılarak izlenir. Rekombinant virüs üretiminin başarısı, SDS page ve Western analizi ile COT TRANSFekte SF nine hücrelerindeki rekombinant Kinlin three varlığının değerlendirilmesiyle doğrulanmıştır; bu durum, anti hiss six antikoru kullanılarak altı küçük ölçekli SF nine kültüründen alınan bu temsilci Western blot görüntüsünde görülmektedir. Virüs amplifiye edilip büyük ölçekli deneylerde SF nine hücrelerini enfekte etmek için kullanıldıktan sonra, her örnekte 75 kilodaltonluk hiss etiketli bir proteine karşılık gelen net bir bant görülmüştür. Rekombinant KINLIN three, immobilize metal afinite kromatografisi ile kısmen saflaştırılmıştır.

Bu şekildeki ana jel görüntüsü, BAO virüsü ile enfekte edilmiş SF nine hücrelerinde eksprese edilen ve nikel afinite yöntemiyle saflaştırılmış rekombinant murin kinlin üçün SDS-PAGE analizini göstermektedir. Absorbe edilen protein, jel görüntüsünün üzerinde gösterilen bir elüsyon gradyanı kullanılarak elüye edilmiştir. MW moleküler ağırlık markerını, LYS tüm hücre lizatını, FT akış pasajını (flow-through), WI birinci yıkamayı ve WII ikinci yıkamayı ifade eder. Rekombinant protein üzerindeki mühendislik ürünü his etiketinin varlığını doğrulamak için elüsyon fraksiyonları kullanılarak Western blot analizi de gerçekleştirilmiştir.

Ardından, kısmen saflaştırılmış KINLIN three, heparin kolonu kullanılarak iyon değişim kromatografisi ile neredeyse homojen hale gelene kadar daha fazla saflaştırılmıştır. Bu panel, 0,05 molar ile 1,0 molar arasındaki sodyum klorür konsantrasyon aralığında, yeşil ile belirtilen doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında elüye olan tek bir simetrik piki gösteren, 280 nanometrede gözlemlenen elüsyon profilini mavi renkte sunmaktadır. Alt panel, fraksiyonlara ayrılmış elüsyonun SDS PAGE analiz sonuçlarını göstererek 75 kilodaltonluk Kinlin three proteininin varlığını kanıtlamaktadır.

Son bir adım olarak, agregatların uzaklaştırılması ve homojenlik sağlanması amacıyla KINLIN three saflığı boyut dışlama kromatografisi ile artırılmıştır. Bu temsili jel filtrasyon elüsyon profili, Tris HCL pH 7.5, 150 millimolar sodyum klorür ve bir millimolar DTT içeren ortamda, 20 degrees Celsius sıcaklıkta SUEx S 200 kullanılarak saflaştırılmış Kinlin three'ye aittir. Elüsyon hacmine dayanarak, KINLIN three'nin 75 kilodalton'luk bir protein için beklendiği şekilde göç ettiği görülmektedir; bu durum proteinin ağırlıklı olarak monomerik olduğunu göstermektedir.

Sıradaki şekil, 14,5 mg/mL konsantrasyondaki yüksek derecede saflaştırılmış rekombinant kinlin 3'ün (K3 olarak etiketlenmiş) SDS-PAGE sonuçlarını göstermektedir. Böcek hücre kültürü ile yüksek saflıkta, tam uzunluktaki fare kinlin 3'ten miligram miktarlarda üretim yapılması, proteinin kapsamlı yapısal çalışmalarına ve biyokimyasal analizlerine olanak sağlayacaktır. Bu çalışmada ayrıca, hangi tamponların kinlin 3'ü stabilize ettiğini belirlemek amacıyla Thermofluor tabanlı bir termal kayma (thermo shift) analizi gerçekleştirilmiştir.

KINLIN three, pH'e karşı sodyum klorür konsantrasyonundan oluşan iki boyutlu bir taramayı kapsayacak şekilde çeşitli tamponlar içinde seyreltilmiştir. Üst panel, geçiş sıcaklıklarının 3B histogramıdır ve alt panel, 50.4 °C olan hesaplanmış ortalamadan itibaren geçiş sıcaklığındaki değişimi göstermektedir. Çubuklar, karşılık geldikleri sıcaklık aralıklarına göre renklendirilmiştir.

KINLIN three'ün, 7,0 ile 9,0 arasındaki PA aralığında, yüksek sodyum klorür konsantrasyonlarında 55 °C'lik tutarlı bir geçiş sıcaklığı ile stabil olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca, sodyum klorür konsantrasyonundan bağımsız olarak, 7,0 ile 7,5 arasındaki PA aralığında Kinlin three'ün geçiş sıcaklığının yaklaşık 55 °C olduğu gözlemlenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, derinlemesine biyofiziksel karakterizasyon ve daha ileri araştırmalar için yüksek saflıkta fonksiyonel rekombinant kindling üretmenin nasıl yapıldığına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Benzer yaklaşımlar, hazırlanması zor olan diğer protein örnekleri için de kullanılabilir ve bu tür durumlarda uygulanmasını öneririz.