HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi + Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri Ex vivo Co-kültür sistemi.

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, HIV V bir, enfekte CD dört pozitif T hücrelerinin plazmositoid dendritik hücreler veya PDC'ler tarafından doğuştan gelen algılamasını değerlendirmektir. Bu ilk olarak CD dört pozitif T hücresinin H HIV V ile enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, enfekte olmuş T hücreleri PDC'lerle birlikte kültürlenir.

18 ila 22 saat sonra, kokültürlerden süpernatanlar, PDC tip bir interferon üretiminin miktar tayini için geri kazanılır. Sonuçta, tip bir interferon üretimi, insan kanının, izole edilmiş PDC'nin CD dört pozitif T hücreli H HIV bir enfeksiyona duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, HIV'in bir enfekte CD dört T-hücresinin plazmositoid litik hücreler tarafından tanınması gibi, patojenin tanınmasında erken doğuştan gelen bağışıklık tepkisini yöneten viral ve konak faktörünü incelemek için yararlı olabilir.

Bu protokoller tip bir interferonu ölçmeyi amaçlasa da, interfer gama, TNF alfa veya akrabalar gibi enfekte T hücrelerinin tanınması üzerine PC'ler tarafından salınan diğer biyoaktif molekülleri tespit etmek için kolayca değiştirilebilirler Primer CD'nin enfeksiyonu için dört pozitif T hücresi, insan periferik kanını aktive ederek başlar, CD dört pozitif T hücresini 48 saat boyunca PHAL ile izole eder. Hücreleri, enfeksiyondan en az üç gün önce rekombinant IL iki ile desteklenmiş tam ortamda tutun. Daha sonra biyogüvenlik seviyesi üç laboratuvarda, enfeksiyondan iki gün sonra farklı enfeksiyon sayıları kullanarak T hücrelerini HIV bir virüsü ile enfekte edin.

Hücre kültürlerini GFP, BST iki ve CD dört ekspresyonu açısından değerlendirin. Biyogüvenlik seviye iki tesisindeki ko-kültür deneyleri için yalnızca %20 ila %50 GFP pozitifliğine sahip kültürleri kullanın. Daha sonra, mononükleer hücreleri, kan alımından sonraki yarım saat içinde yoğunluk gradyan santrifüjleme ile bir insan periferik kan örneğinden izole edin.

Daha sonra, istenen hücre soylarının fizyolojik oranlarda izole edildiğini doğrulamak için hücreleri uygun antikorlarla boyayın. Hücreleri soğuk tutmak için hızlı çalışmak. Üreticinin tavsiyelerine uyarak yalıtılmış PBMC içindeki PDC'leri zenginleştirmek için bir PDC negatif seçim kiti kullanın.

Daha sonra, zenginleştirmenin saflık yüzdesini ve I LT yedi ve BDCA iki gibi PDC'ye özgü yüzey belirteçlerinin nispi miktarlarını grip sitometrisi ile onaylayın. Zenginleştirilmiş numuneler en az %40 PDC içermelidir, şimdi 220 mikrolitre algılama hücresini, 96 oyuklu U alt plakada oyuk başına 30 mikrolitre enfekte T hücresi ile birlikte kültürleyin Yalnızca algılama veya hedef hücreleri içeren kontrol kuyularını dahil edin, bu kuyucukları tam ortam ile 250 mikrolitrelik bir nihai hacme ayarlayın. Bilinen toll benzeri reseptör agonistlerine PDC yanıtlarını değerlendirmek için, uygun kuyucuklara bir TLR yedi veya TLR dokuz agonisti ekleyin ve plakayı 18 ila 22 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Ko-kültürün sonunda, hücreleri 96 kuyu V'luk bir alt plakaya aktarın ve plakayı 400 Gs ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanları 96 kuyulu düz bir alt plakaya aktarın. Resus, hücre peletlerini %2 paraform aldehit içinde askıya alır ve hücreleri ileri ve yan saçılma grafiğinde ayırt etmek için boyutlarını ve granülasyonlarını kullanarak akış sitometrisi ile analiz eder.

Hcbl interferon alfa beta raportör hücreleri kullanarak biyoaktif tip bir interferonu ölçmek için, önce raportör hücreleri 96 kuyulu düz tabanlı bir plakada kuyu başına 50.000 hücre yoğunluğunda 180 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar kaplar. Daha sonra, her bir oyuka iki kez 20 mikrolitre yeni hasat edilmiş ko-kültür süpernatantı ekleyin, bir dizi dahili standart kontrol ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 18 ila 22 saat boyunca inkübe edin 180 mikrolitre kuantum mavisi çözeltisinde raportör hücrelerden salınan alkalin fosfataz seviyelerini belirlemek için yeni bir düz tabanlı plakanın her bir oyuğuna. Daha sonra her bir oyuğa 20 mikrolitre indüklenmiş HEC PLU interferon alfa beta hücreleri süpernatanları ekleyin ve standart interferon kontrol kuyucuklarında renk gelişene kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuantum mavisi çözeltisi, enzimin varlığında pembeden mor maviye değişir. Son olarak, 620 ila 655 nanometrede salgılanan alkalin fosfataz seviyelerini değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanın ve interferon standart eğrisinin doğrusal kısmından ekstrapolasyon yoluyla tip bir interferon konsantrasyonunu belirleyin. Primer hücrelerin değişken doğası nedeniyle, bu temsili nokta grafiklerinde gösterildiği gibi CD 14 pozitif miyeloid ve CD üç pozitif T hücrelerinin normal oranlarının gözlenmesi önemlidir.

Ayrıca, taze izole edilmiş PBMC kültürlerinde daha yüksek ileri saçılma ve CD üç seviyeleri ile tanımlanan sadece düşük sayıda aktive edilmiş T hücresi arzu edilir. En önemlisi, PDC'lerin nispi yüzdesinin belirlenmesi gerekir, ancak bu yüzde %0,2 ila %1,2 arasında değişebilir. Bu aralığın her iki ucunda da anormal bir algılama fenotipi de gözlenir. PDC'lerin negatif seleksiyon kullanılarak zenginleştirilmesi, farklı donörlerden alınan bu iki temsili nokta grafiğinde görüldüğü gibi, genellikle %50 ila %95 PDC saflığı sağlar.

Genel deneyin prototipik bir örneği sonraki birkaç şekilde gösterilmiştir. Bu temsili çalışmada. MT dört hücre, ko-kültür sırasında% 30 enfeksiyon elde etmek için P ve l 4.3 GFP, IRIS NF vahşi tip veya delta VPU ile enfekte edildi.

Daha önce tarif edildiği gibi, sadece vahşi tip virüslü enfeksiyonlar, yüzey BST iki'nin önemli bir aşağı regülasyonuna neden oldu. Büyüklük ve taneciklikteki farklılıkları nedeniyle, MT dört hücresi, bilinen TLR yedi veya TLR dokuz agonisti varlığında sadece pbmc ko-kültür sonrası akış sitometrisi ile p BMC'lerden kolayca ayırt edilebilir veya pbmc hiv ile temas halinde olan bir enfekte hücre önemli miktarda tip bir interferon salgılar. Sahte enfekte MT dört hücreli veya enfekte olmuş bir MT dört hücreli Pbmc ko-kültüründe tek başına pbmc'de interferon tespit edilmedi, burada sunulan örnekte, HIV ile enfekte olmuş bir MT dört hücrenin pbmc tarafından doğuştan algılanmasının VPU varlığında önemli ölçüde azaldığı bulundu.

Bu prosedürü denerken, tüm kontaminasyon kaynaklarını önlemeyi unutmamak önemlidir. Her zaman endotoksin içermeyen solüsyonlar kullanın. Mikoplazma kontaminasyonlarını rutin olarak kontrol etmeyi ve hücrelerinizi herhangi bir antibiyotik olmadan kültürde tutmayı unutmayın, çünkü kontrollü bakteriyel enfeksiyonlar bile PBM'ler tarafından algılanabilir.

PC'lerin çok kırılgan hücreler olduğunu unutmayın. Sınırlı bir ömürleri vardır ve prosedür zamanında gerçekleştirilmezse yanıt verme durumları etkilenebilir.