Name: Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik beynindeki nöral kök ve progenitör hücrelerinin hücre döngüsü ilerlemesini EdU ve BrdU analogları ile değerlendirmeyi. Bu yöntem, genotoksik stresin beyin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Şerefe-ENVIRONNEMENT - bu sonuçlara yol açan araştırma Electricité de France (EDF) dan ve l&#39;Agence Nationale de la Recherche dan, 323.267 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı n ° etti et Santé-Travail&#39;in (ANR-SEST, Neurorad).

1.. Hayvan Prosedürleri Bu protokol 24 Kasım Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, 1986 (86/609/EEC) uygun olarak dizayn edilmiştir ve hayvan refahı (CETEA-CEA DSV IdF&#39;nin) bizim kurumsal komitesi tarafından onaylandı. <ol><li> Edu / BrdU ve E14.5 gebe farelerin ışıması (Şekil 2A) ile Enjeksiyonlar. <ol><li> PBS içinde 5 mg / ml &#39;de ml BrdU ve 1 mg / at edu içinde bir çözeltisi hazırlandı. Hamile farelere, bir 25 G iğne kullanılarak edu çözeltinin 100 ul&#39;lik bir intra-peritoneal enjeksiyon (IP) yapın. 1.5 saat sonra, 0 Gy veya 2 Gy (0.6 Gy / dk) fareler (toplam vücut ışınlaması) ışın tedavisi. Hemen sonra, hamile farelere, bir 25 G iğne kullanılarak BrdU çözeltisi (IP) 200 ul enjekte edilir. </li></ol></li><li> Embriyonik beyin koronal dilimlerinin hazırlanması. <ol><li> Radyasyona maruz bırakıldıktan sonra 1 saat ya da 4 saat sonra, karbon dioksit ile gebe farelerin euthanize. </li><li> Karın Cavi açınmakas kullanarak üç santimetre üzerinde ty. Boynuzları her iki ekstremite kesit tarafından rahim kalanından iki rahim boynuzları ayırın. PBS% 0.6 glikoz içeren bir Petri kabı içine rahim boynuzları aktarın. Embriyoları izole etmek için forseps ile rahim boynuzları açın. Forseps kullanarak her bir embriyonun amniyon kesesi çıkarın. </li><li> Forseps ile embriyonik kafaları inceleyin ve 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehit (PFA, pH = 7.4) O / N daldırılarak bunları düzeltmek </li><li> 4 ° C de en az bir gece boyunca PBS içerisinde embriyonik kafaları durulayın Kafalar birkaç gün boyunca PBS içinde tutulabilir. </li><li> Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi bir vakum infiltrasyon işlemcisi kullanılarak parafine gömme kafa. Gömme Başlıkları da etanol ve Xylen banyoları için kimyasal bir başlık altında gerçekleştirilir ve daha sonra parafin banyoları için bir 65 ° C fırın içinde olabilir. </li><li> Bir mikrotom ile 5 mikron kalınlığında koronal kesitler hazırlamak. </li><li> Polilizin kaplı mikroskop lamı üzerine monte edin. &lt;/ Li&gt; <li> Slaytlar, birkaç ay boyunca oda sıcaklığında (RT) tutulabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Edu / BrDU Boyama <ol><li> Parafinden arındırma lamların ve antijen maskelenmesinin <ol><li> 5 dakika boyunca tolüen 3 hamam slaytların daldırma ile parafine gömülmüş beyin bölümleri Deparaffinize. </li><li> % 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve 5 dk H2O içinde: Aşağıdaki gibi etanol konsantrasyonunun azaltılması her çözümler 2 banyoları içinde 3 dakika için rehidrate Slaytlar birkaç saat boyunca deiyonize edilmiş su içinde tutulabilir. </li><li> Sitrat çözeltisi (10 mM, pH 6) içinde 10 dakika için dilimleri kaynatılır ve daha sonra 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde inkübe edilir. </li></ol></li><li> Edu boyama <ol><li> Üreticinin protokolüne göre edu algılama yapın. 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 triton X-100 hücreleri geçirgenliği. </li><li> Iyonu giderilmiş su içinde 10X solüsyon seyreltilmesi ile 1X tampon edu katkı hazırlayın. Bu çözelti taze yapılmış ve aynı Da kullanılmalıdıry. </li><li> Edu Alexa Fluor 488 azitle dahil, Edu reaksiyon kokteyl hazırlayın. Aksi takdirde, reaksiyon en iyi şekilde devam olmaz, Tablo 2&#39;de listelenen sırada aşağıdaki maddeleri eklemek için önemlidir. Hazırlık 15 dakika içinde edu reaksiyon kokteyl kullanın. </li><li> Permeabilization tampon (adım 2.1.1) çıkarın, sonra PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Edu kokteyl Reaksiyon 150 ul, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Edu reaksiyon kokteyl kaldırmak, sonra PBS ile bir kez yıkayın. </li></ol></li><li> BrdU boyama <ol><li> % 7,5 keçi serumu ve PBS içinde% 7.5 fetal sığır serumu ile çökelti tamponu hazırlayın. Beyin dilimleri üzerinde doyurma tampon 150 ul bir lamel koymak ve spesifik olmayan bağlanma antikoru engellemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Lamel çıkarın. Satürasyon tamponu içinde 1/300 seyreltilmiş fare anti-BrdU birincil antikor, 150 ul, / a lamel koymak ve O inkübe4 ° C &#39;de N </li><li> Lamel çıkarın, daha sonra PBS 3 kez yıkayın. </li><li> Satürasyon tamponu içinde 1/400 seyreltilmiş keçi anti-fare-Alexa594 ikincil antikor, 150 ul, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Lamel çıkarın, daha sonra PBS kez yıkayın. </li><li> Nükleer boyama: 4 150 ul &#39;, PBS içinde 1 ug / ml&#39; de ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin, bir lamel koymak ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir. </li><li> Orta montaj slaytlar monte edin. </li></ol></li></ol> 3. Analizi <ol><li> Bir 20X objektif veya konfokal mikroskop ile bir floresan mikroskobu altında beyin bölümleri inceler ve dosya ayıran olarak üç kanal (488 nm, 594 nm ve UV) görüntü elde. </li><li> Photoshop yazılımı ile görüntüler yığını. </li><li> Dorsomedial serebral duvarın bir standart sektörde beyin bölümlerini analiz. Bu sektör, medial-yanal boyutta 100 um ve 10 μ 18 kutuları (veya daha fazla) ayrılmıştırgibi görüntülerde üst üste bir ızgara (Şekil 1) kullanılarak radyal boyutta m yükseklik 31, daha önce tarif edildiği. <ol><li> Örneğin ilk kutusu olarak ızgara hizalama ventriküler sınırına uzun eksenine paralel olan, ventriküler yüzeyindedir. Sonra her bin etiketli edu, BrdU&#39;yu ve / veya piknotik çekirdekleri (apoptotik çekirdekler karşılık) numara. Çekirdeği iki bidonları içinde eşit alanları kaplar zaman onun büyük bir kısmını, ya da alt bin içerir bin iki bidonları sınırında bulunan bir çekirdek numara. </li></ol></li><li> İstatistiksel analiz. </li></ol> Embriyo başına en az iki kortikal dilim analiz edin. Farklı litre en az 3 embriyo üzerinde deney tekrarlayın. Sonuçlar, ortalama (SEM) ortalama ± standart hatası olarak verilmelidir. İstatistiksel analizler iki yönlü ANOVA ve Bonferroni çoklu karşılaştırma posthoc testleri kullanılarak Graphpad Prism ile yürütülmektedir.

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cerebral+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+he+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li>
<li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+nuclei+IN+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li>
<li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+vertebrate+central+nervous+system%3A+revised+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li>
<li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+cerebral+cortex%3A+Boulder+Committee+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li>
<li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li>
<li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon%3A+a+major+site+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li>
<li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li>
<li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li>
<li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells%3A+putting+a+speed+limit+on+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li>
<li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li>
<li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li>
<li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+p53+and+Fas%2FCD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li>
<li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li>
<li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li>
<li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+kinetics+and+radiation+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology+and+Related+Studies+in+Physics%2C+Chemistry%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246, 629-634 (1989).</li>
<li>Weinert, T. A., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RAD9+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+evidence+that+its+function+acts+posttranslationally+in+cell+cycle+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).</li>
<li>Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li>
<li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia%3A+a+new+explanation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li>
<li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li>
<li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+p21waf1%2Fcip+-dependent+G1%2FS+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li>
<li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12(2012).</li>
<li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+%28EdU%29+and+5-bromo-2%27-deoxyuridine+%28BrdU%29+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li>
<li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li>
<li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-iT+EdU+Imaging+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).</li>
<li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early%2C+middle%2C+and+late+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li>
<li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li>
<li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Edu 1.5 saat katılmasıyla göre burada anlatılan deneysel tasarım önce ışınlama izin hemen sonra ışınlama ve BrdU birleşme NSPCs bir sonra S ve G2 / M kontrol noktaları etkinleştirmek mümkün ancak 1 st saat boyunca G1 / S noktası değildir gösteri fetal fare beyninde genotoksik stres. Bize özel olarak, S fazına girişin oranını takdir izin edu sadece 1 saat farenin kurban öncesinde, ışınlama ve BrdU sonra farklı zamanlarda enjekte edildiği ve diğer deneyler gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler NSPC vivo <s...

Embriyonik beyin gelişimi sırasında, serebral korteksin projeksiyon nöronlar nöral kök ve progenitör hücrelerin (NSPC) farklı türde oluşan bir yalancı epitel bu satırları yan ventrikül, ventriküler bölge oluşturulur. NSPC arasında, nöral kök hücre olarak hizmet eden radyal glial hücreleri (RGC), (INM) interkinetic nükleer göç tabi tutulur: bunlar ventriküler bölgesinin bazal sınırında ventrikül ve S-fazı yüzeyinde mitoz yerine (VZ) 1., 2,3. Bölündüklerinde ya simetrik iki RGC oluşturmak için ya da asimetrik bir RGC ve bir nöron veya bir ara progenitör hücre (IPC) 4, 5 üretir. IPC son bir simetrik bölünme sonra da iki olgunlaşmamış projeksiyon nöronları 6-8 üretmek bölge subventricular denilen bir üstteki çoğalan tabakası (SVZ), göç. RGC aksine, IPC (9 gözden) Inm girmezler. Yeni üretilen nöronlar Migrkortikal plaka (CP) 10, 8 onların nihai hedefe ulaşmak için ara bölge (IZ) ile radyal lifleri boyunca radyal yedik. Tüm bu olayların mükemmel zamanlama doğru kortikal gelişim için gereklidir. Örneğin nöral projenitör popülasyonlarının farklılaşma çoğalmasından anahtar G1 faz süresi 11, 12 tarafından kontrol edilir. G1 fazının uzatılması hücre farklılaşması ile bu şekilde ilişkilidir. Bu tür (13 gözden) iyonize radyasyon, bozan beyin gelişimi gibi genotoksik stres. Biz ve diğerleri NSPC radyasyon kaynaklı apoptoz 14, 15,16 derece yatkın olduğunu göstermiştir. İyonlaştırıcı ışınım çoğalan hücrelere en ağır hasarı DNA çift iplikli kırılmalara neden. Bisiklet hücrelerde DNA Damage Müdahale (DDR) esas bir bileşeni, G1 / S ya da G2 / M geçişlerinde ve S esnasında hücre siklüs kontrol noktalarının aktivasyonufaz (intra-S kontrol noktası) 17-21. Bunlar, DNA hasarı tamiri ya da çok hasar görmüş hücrelerin ortadan kaldırılması için zaman sağlamak için, hücre döngüsü ilerlemesini bloke eder. Sonuç olarak, hücre ölümü hem de gecikmiş hücre döngüsü ilerlemesi radyasyona maruz 22-24 iyonize yanıt beyin gelişimini değiştirebilir. Bu ışınlanmış fare embriyonik beyin NSPC hücre döngüsü kontrol noktası aktivasyonunu değerlendirmek için bir yöntem geliştirmektir, böylece ilginçti. Hücre döngüsünün ilerlemesi rutin bir timidin analogu, 5-Bromo-2&#39;-deoksiüridin (BrdU) &#39;nin bileşimi kullanılarak takip edilir. BrdU DNA çoğaltma işlemini hücre döngüsünün S fazı esnasında dahil edilmektedir. BrdU karşı bir antikorun kullanılması BrdU darbesi sırasında S fazında olan hücreler daha sonra belirlenmesini sağlar. Bir yeni timidin analogu, 5-etinil-2&#39;-deoksiuridin (EGT), floresan azit ile tespit edilir. Edu ve B tespit etmek için farklı yolları<html> RDU hücre döngüsü ilerlemesinin çalışma için yararlı olan iki timidin analogları aynı anda algılama sağlayan, 25, çapraz reaksiyona girmezler. Genellikle hücreler ilk edu ile darbeli ve daha sonra her iki birleştirmeleri arasındaki süre sonrası 25, 26 bir çift sürer BrdU, ile birlikte titreşim uygulanır. Edu ihtiva eden kültür ortamı içinde BrdU eklenmesi edu hariç olmak üzere DNA&#39;ya BrdU tercihli olarak dahil sonuçlanır ise sadece BrdU dahil 27 ortam sonuçlara eşit mol ya da eşit molar yarım BrdU ile edu 25 eşzamanlı eklenmesi. Bu, normal olarak önce ikinci etiketin ilave etmek için kültür ortamından birinci etiket çıkarmak için gerekli olan yıkama adımları ortadan kaldırarak çift etiketleme protokolü kolaylaştırır. Bu, aynı zamanda, S fazına girişin ya da hücre nüfusunun çıkış kesin zamanlama belirlemek için yıkama adımları mümkün olmayan in vivo çalışmada,, için özel bir önem taşımaktadır. t &quot;&gt; Son zamanlarda, edu ve BrdU 23, 24,22 kullanılarak embriyonik fare beyninde çift nabız da etiketlenmesi için bir yöntem utero ışınlama sonra hücre döngüsü ilerlemesini ve NSPC İNM analiz etmek için geliştirilmiştir. Üstelik gösterilmiştir sırasında, bu S fazı, fare hücreleri ilk Ökromatin bölgeleri ve daha sonra perisentrik heterokromatine 28,29,30 çoğaltmak. İlginçtir, interphasic çekirdeklerinde kümelenmiş farklı kromozomlar perisentrik heterokromatinin da chromocenters olarak bilinen ve parlak odakları olarak DAPI boyama tarafından kolayca tespit heterokromatik odağı oluşturması. Bu nedenle, ökromatin ve chromocenters diferansiyel Edu ve BrdU boyamaları daha doğrusu NSPC S fazı ilerlemesini analiz için bize yardımcı oldu. Bu yöntem, bu kontrol noktası genom istikrar açısından kritik olması gerekiyordu çünkü oldukça şaşırtıcı NSCP 22-24 G1 / S kontrol noktasında, belirgin eksikliği gösteri sağladı. Çeşitli expedu ve BrdU bakliyat çeşitli kombinasyonlarına dayanan tasarımları erimental ventral ve dorsal telencephalon hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmek için kullanılmıştır. Burada, E14.5 fare embriyo utero ışınlama sonraki ilk 4 saat içinde NSPC akut DNA hasarının çalışma sağlayan protokollerin bir örnek verir.

<table><tbody><tr><td>EdU</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10044</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>B5002</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>IBL 637</td><td>BDT BIO Uluslararası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissu Tek VIP</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM 2125 RT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa 488 görüntüleme kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C10083</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>GE Sağlık</td><td>RPN202</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Keçi anti fare-Alex594</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11001</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Polisin slayt</td><td>Termo bilimsel</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>20012-068</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prizma yazılımı</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Sürüm 5.0c</td></tr><tr><td>Photoshop yazılımı</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genotoksik stres sonrası nöral kök ve fare gelişmekte beyin progenitör hücrelerinin değerlendirilmesi hücre döngüsü İlerlemesi

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Serebral korteks nöronlar embriyonik beynin lateral ventriküller astar bir yalancı epiteli oluşturan nöral kök hücrelerin farklı (NSPC), beyin gelişimi sırasında oluşturulur. Gibi iyonize radyasyon gibi genotoksik stresler, NSPC yüksek duyarlılığı ile ilgili gelişen beyin üzerinde son derece zararlı etkileri vardır. Dahil hücresel ve moleküler mekanizmaların açıklanması, hasarlı doku, hücre döngüsü boyunca NSPC ilerlemesi belirlemek için güvenilir bir yöntem gerektirir hücreleri, bu özel tiplerinin DNA hasarı yanıtın karakterizasyonu bağlıdır. Burada hamile farelerde embriyonik ve koronal beyin bölümlerinde bu iki timidin analogları daha saptanmasında edu ve BrdU ardışık intraperitonal enjeksiyonlar göre bir yöntem gösterilmektedir. Edu ve BrdU hem S fazında kopyalayan hücre DNA olarak dahil edilmiştir ve iki farklı teknikler (azid ile tespit edilir ya dabunların aynı anda algılanmasını kolaylaştırmak spesifik bir antikor, sırasıyla). Edu ve BrdU boyama daha sonra dorsal telencephalon standart bir bölgede ventriküler kenar onun mesafesinin bir fonksiyonu olarak her bir NSPC çekirdeği için belirlenir. Bu nedenle bu çift etiketleme tekniği DNA hasarına tepki olarak hücre siklüs hapsinin yol açan bir hücre döngüsü kontrol noktası aktive olması, bu ikinci hücre döngüsü yoluyla ilerleme hücreleri ayırt sağlar. Deneyin bir örnek edu hemen sonra ışınlama ve BrdU önce enjekte edilmiş ve ışınlama sonra 4 saat içinde analiz yapılmıştır ki, sunulmuştur. Bu protokol ışınlanır edilmiş hangi hücre döngüsü faz fonksiyonunda NSPC akut DNA hasarı yanıtın doğru bir analizini sağlar. Bu yöntem, canlı dokuda, hücre devir gelişiminin belirli bir tedavinin etkisini tespit etmek amacıyla kolayca yer değiştirebilir diğer sistemlerin etmektir.

Şekil 2&#39;de tarif edilen deneyde, edu sadece ışınlama sonrası ışınlama ve BrdU önce 1.5 saat uygulanmıştır. Hücrelerin Dört tip sonra Edu veya BrdU, her ikisi veya hiçbiri ya birleşmesiyle göre, 1 veya 4 saat sonrası ışınlama hazırlanan kortikal dilimleri ayırt edilmiştir (Şekil 2A ve 2B). Önemli olarak, ne de edu BrdU eklenmesi de radyasyon kaynaklı apoptosis (veriler gösterilmemiştir) seviyesini değiştirdi. Ayrıca, boyama yöntemleri EDU ve BrdU sadece algılama S-Fa...

Timidin iki analoglarının Yönetimi, edu ve BrdU, hamile farelerde embriyonik fare beyninde sinir ve progenitör hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin analizine izin verir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında iyonizan radyasyon içeren genotoksik stres, etkilerini belirlemek için yararlıdır.

Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

assessing-cell-cycle-progression-neural-stem-progenitor-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak fiziksel (boyutu ve iç boyu) ve floresan özelliklerine bağlı olarak kök sinir hücrelerini yenilenebilir bir kaynaktan (NSC'lerde) den nöronal progenitör hücre üretimi ve daha sonra saflaştırma için yeni bir yöntem gösterilmektedir.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Öğrenin, fare embriyonik beynindeki nöral kök ve progenitör hücrelerinin hücre döngüsü ilerlemesini EdU ve BrdU analogları ile değerlendirmeyi. Bu yöntem, genotoksik stresin beyin gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılır.

Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi

Daha fazla video keşfet