Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, anti-nükleer antikorları taramak için dolaylı bir immünofloresan testi kullanmaktır. Bu, hasta serumunun hep iki substrat lamı ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Bağlanmamış hasta serumu yıkanır, bağlı oto antikorlar daha sonra spesifik floresein etiketli konjugat ile inkübe edilir ve bağlanmamış reaktif yıkanır.

Bir floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde, oto antikor pozitif numuneler, oto antikorun mevcut olduğunu gösteren bir floresan paterni ile bağlandığı hücre veya çekirdek bölgelerine karşılık gelen bir elma yeşili floresan sergileyecektir. Sonuç olarak, arna'nın varlığı, bağ dokusu hastalıklarının teşhisine yardımcı olmak için kullanılabilir. Dolaylı immünofloresan yönteminin katı faz Eliza gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, Hep iki hücreli substratın, doğal konfigürasyonlarında eksprese edilen 100'den fazla antijen içermesidir.

Bu, klinik olarak anlamlı hemen hemen tüm O antikorlarının tanımlanmasına izin verir, bu da dolaylı immünofloresan yöntemi çok özel bir teknik olduğu için katı yüz teknikleriyle mümkün değildir. Bu yönteme yeni olan kişiler, slayt işleme prosedüründe uzmanlaşmak için zamana ve pratiğe ihtiyaç duyarlar. Mikroskop görüntülerini yorumlamak ve ilgili kalıpları tanımlamayı öğrenmek de ustalaşması zaman alan bir beceridir.

Doğru reaktifler ve araçlarla sonuçlar daha tutarlı ve yorumlanması daha kolaydır. Prosedürü göstermek, İmmünofloresan Asay Geliştirme Laboratuvarı'ndan bir teknoloji uzmanı olan Cassandra Bryant olacak. Reaktifleri ambalajından çıkarın ve her bir öğenin oda sıcaklığına gelmesine izin verin, reaktifleri hazırlayın ve hasta serumunu yöne göre seyreltin, ekleme slaytları barkodludur ve otomatik sistemlere kolayca entegre edilebilir.

Bu yordam el ile slayt işlemeyi gösterir. Bununla birlikte, yüksek verimli laboratuvarlar, barkod tarama özelliklerine sahip otomatik slayt işleme ekipmanını tercih edebilir. Inova cihazları, iş akışı sonuçları ve raporlama üzerinde kontrol sağlayan merkezi bir akıllı ağ aracılığıyla bağlanır.

IFA için. Bu, transkripsiyonun ve ilgili hataların işlenmesi ve ortadan kaldırılmasından kaynaklanan pozitif hasta tanımlaması ile sonuçlanır. Uygun slayta bir damla pozitif kontrol ve bir damla negatif kontrol dağıtın.

Wells, kalan kuyucuklara 20 ila 25 mikrolitre seyreltilmiş hasta serumu pipetler. Her seferinde bir slaydı işleyin. Slaytı, altında nemli bir kağıt havlu bulunan bir boyama kabına yerleştirin, kabı örtün ve slaytı 30 dakika inkübe edin.

Nemli koşullar, alt tabakanın kurumasını önleyecek ve bu da yapay lekelenmeye neden olabilir. Bu inkübasyon süresi boyunca, hastanın serumundaki anti-nükleer antikorlar, her bir oyuğa sabitlenen hücrelerin antijenlerine bağlanacaktır. İnkübasyon süresinden sonra, alt tabakaya zarar vermemek için serumu hafif bir yıkama tamponu kullanarak durulayın.

Slaytı, akış doğrudan alt tabakaya işaret etmeyecek şekilde hafifçe eğin. Slaytların bu oryantasyonu, numunelerin kuyucuklar arasında çaprazlanmasını önlemeye de yardımcı olacaktır. Fazla yıkama tamponunu hafifçe vurun ve slaytı yıkama tamponu içeren bir Copeland kavanozuna yerleştirin.

Yıkama aşaması için inkübasyon süresi yaklaşık beş dakika olmalıdır. Slaytları yıkama tamponundan çıkarın ve hafifçe vurun. Fazla yıkama tamponunu çıkarmak için, her bir oyuğa bir damla floresan konjugat uygulayın.

Bir NA testi için, IgG FC'ye özgü bir konjugatın kullanılması önerilir. Slaytları nemlendirilmiş kapta 30 dakika inkübe edin ve boyama kapağını değiştirdiğinizden emin olun. Eşlenik ışığa duyarlıdır ve kapak, slaytları ışığa maruz kalmaktan koruyacaktır.

Bu inkübasyon süresi boyunca, konjugat, hastanın hücre antijenlerine bağlanmış olan anti-nükleer antikorlarına bağlanacaktır. Bu eşlenik bağlanma, inkübasyonu takiben kuyucuklarda floresan varlığına neden olur. Slaytı yıkama tamponu ile yıkayın.

Daha önce olduğu gibi, bir kağıt havlu üzerine bir kapak fişi yerleştirin ve montaj ortamını kapak mendilinin alt kenarına sürekli bir çizgi halinde uygulayın. Her bir sürgüyü yıkama tamponundan çıkarın ve sürgüye hafifçe vurun. Fazla yıkama tamponunu çıkarmak için, sürgünün alt kenarını kapak fişinin kenarına dokundurun.

Sürgüyü, kapak kızağı üzerindeki montaj ortamı, hava kabarcığı kapağı kaymadan sürgünün üst kenarına akacak şekilde yavaşça kapak kızağı üzerine indirin, optimum miktarda montaj ortamı da dahil olmak üzere, mükemmel bir görünüm için pratik yapan bir tekniktir. Karanlık bir odada bulunan floresan mikroskop ile slaytlar, tüm kuyu taraması 20 x veya 25 x objektif ile yapılmalıdır. Floresan hücre dağılımını ve homojenliğini değerlendirmek için 40 x objektife geçin.

Pozitiflik ve örüntü ile ilgili son yorumu yapmak için pozitif ve negatif kontrollere bakın. Negatif kontrol tamamen karanlık görünmeyebilir, ancak genellikle düşük seviyeli spesifik olmayan floresan görüntüler. Pozitif kontrol, çekirdekte parlak elma yeşili floresan gösterecektir.

Pozitiflik, bir artıdan dört artıya kadar bir reaktivite derecelendirme ölçeği kullanılarak derecelendirilebilir. Manuel yorumlamaya ek olarak, slaytlar otomatik floresan mikroskobu ile yüklenebilir ve taranabilir. Karanlık odaya gerek yoktur.

Uygun slayt tipini seçerek bir proje oluşturduktan sonra, cihaz her bir kuyucuktaki hücrelerin yüksek çözünürlüklü dijital görüntülerini alır ve saklar. Ek olarak, Nova view floresan ışık yoğunluğunu ölçer ve sonuçları pozitif veya negatif olarak sınıflandırır ve pozitif numuneler için model tanıma sağlar. Görüntüler, operatör tarafından yüksek çözünürlüklü bir bilgisayar monitöründe görüntülenir ve Nova View'ın son yorumlanmasına, revizyonuna ve onaylanmasına olanak tanır.

Onaylanan sonuçlar üzerine sonuç raporları oluşturulabilir. Çekirdek içindeki kurucu protein yapılarına oto-antikor bağlanması, homojen, benekli sentromer, nükleolar ve nükleer nokta dahil olmak üzere beş ana nükleer modelle sonuçlanır. Burada gösterildiği gibi homojen bir desen tanımlamak için, mitotik veya bölünen hücreleri tanımlayın.

Mitotik hücreler, genellikle dinlenme hücrelerinden daha belirgin olan katı homojen floresan gösterir. Dinlenme hücresi çekirdekleri, yaygın boyama ile tek tip olmalıdır. Bu karakteristik model, büyük olasılıkla, çift sarmallı DNA'ya karşı otoantikorların sonucudur.

Benekli desenin önemli bir özelliği, metafaz mitotik hücrelerinin madeni para yuvası görünümüdür. Bu hücrelerin kromozomal bölgesi negatiftir. Dinlenen hücreler, çekirdekler boyunca bir beneklenme modeli gösterir.

Beneklenme kaba veya ince olarak tanımlanabilir. Rota beneklenmesi, SM ve RNP'ye karşı otomatik antikorların sonucudur. İnce beneklenme, S-S-A-S-S-B'ye ve RNA polimeraza karşı otomatik antikorlara bağlı olabilir.

DFS paterni yoğun, ince benekli olarak adlandırılır ve DFS 70'e karşı otomatik antikorların göstergesidir. Mitotik hücreler benekli lekelenme gösterirken, dinlenme hücreleri çekirdek boyunca eşit olarak dağılmış ince benekler gösterir. Bu durumlarda, DFS 70 otoantikorları sağlıklı bireylerde bağ dokusu hastalığı olan hastalara göre yaygın olduğu için doğrulayıcı testler yapılmalıdır.

Sentromer modelini tanımlamak için kuyucukları tarayın ve mitotik veya bölünen hücreleri tanımlayın. Bölünen hücreler, genellikle metafaz çubuğu olarak adlandırılan, birbirleriyle yakın ilişki içinde çok sayıda gizli beneğe sahiptir. Dinlenme hücreleri, çekirdek boyunca dağılmış yaklaşık 40 ila 60 ayrı benek gösterir.

Sentromer paterni, nükleolar paterne sahip sentromer proteinlerine karşı otoantikorlarla ilişkilidir. Mitotik hücrelerde kromozomal bölgenin boyanması değişkendir. Nükleolar model, dinlenen hücre çekirdeğinin nükleoplazmasının zayıf, benekli veya homojen boyanması ile birlikte çekirdeklerin homojen veya benekli boyanması ile ilişkilidir.

Bu patern, RNA polimeraz, üç fibrilin ve PM SCL antikorlarına karşı otoantikorlar ile ilişkilidir. Nükleer nokta deseni, negatif metafaz, mitotik hücreler ve dinlenme hücresi çekirdeğindeki birkaç ayrı nokta ile ilişkilidir. Bu karakteristik patern genellikle SP 100 PML veya P 80 kolan otoantikorlarının sonucudur.

Bu antikorlar primer biliyer siroz ve otoimmün hepatit ile ilişkilidir. Gösterilen resimde, nükleer nokta deseni, mitokondriyal antijenlere karşı otomatik antikorlara bağlı sitoplazmik lekelenmeyi göstermektedir. Anti-nükleer antikor tespiti ve örüntü tanıma, hasta teşhisine yardımcı olmak için önemli bir araç olarak hizmet eder.

Çeşitli paternlerin önemini anlamak, klinisyenlerin ve laboratuvar personelinin uygun takip testlerini gerçekleştirmesini sağlar. Anti-nükleer antikor modellerini doğru bir şekilde tanımlamak için en önemli faktörler, yüksek kaliteli bir hücre substratının seçilmesi ve slaytların tutarlı ve iyi bir teknikle işlenmesidir. Slayt okuması geleneksel olarak karanlık odalarda floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir ve hücre döngüsü ve hücre morfolojisi bağlamında çeşitli modellere aşina olan eğitimli teknoloji uzmanları tarafından yapılır.

Son birkaç yılda, slaytların otomatik olarak okunması, bu tür cihazların otomatik iş akışı sağlaması ve okuma ve yorumlama tutarlılığının artırılması için dijital görüntüleme sistemleri geliştirilmiştir. Ayrıca, barkodlu slaytların kullanılmasıyla, süreç boyunca numune izlenebilirliği, olası kayıt hatalarını ortadan kaldırır ve veri bütünlüğünü ve hasta güvenliğini artırır. Bu videoyu izledikten sonra, dolaylı immünofloresan prosedürünün her adımının nasıl gerçekleştirileceği ve klinik olarak ilgili antinükleer antikor modellerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.