Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, antinükleer antikorları taramak için dolaylı bir immünofloresan analiz yöntemi kullanmaktır. Bu işlem, hasta serumunun Hep-2 substrat lamları ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Bağlanmamış hasta serumu yıkanarak uzaklaştırılır; ardından bağlanan otoantikorlar, floresein işaretli spesifik konjugat ile inkübe edilir ve bağlanmamış reaktif yıkanarak uzaklaştırılır.

Floresan mikroskobuyla incelendiğinde, otoantikor pozitif örnekler, otoantikorun bağlandığı hücre veya çekirdek bölgelerinde, antijenin mevcut olduğunu belirten bir floresan paterni şeklinde elma yeşili floresan gösterecektir. Nihayetinde, ANA varlığı bağ dokusu hastalıklarının teşhisine yardımcı olmak için kullanılabilir. İndirekt immünofloresan yönteminin katı faz ELISA gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, Hep 2 hücre substratının doğal konfigürasyonlarında eksprese edilen 100'den fazla antijen içermesidir.

Bu durum, indirekt immünofloresan yöntemi oldukça uzmanlık gerektiren bir teknik olduğu için katı faz teknikleriyle mümkün olmayan, klinik olarak ilgili neredeyse tüm O antikorlarının tanımlanmasına olanak tanır. Bu yöntemde yeni olan bireylerin, lam işleme prosedüründe yetkinleşmek için zamana ve pratiğe ihtiyacı vardır. Mikroskop görüntülerinin yorumlanması ve ilgili paternleri tanımlamayı öğrenmek de ustalaşılması zaman alan bir beceridir.

Doğru reaktifler ve araçlar kullanıldığında, sonuçlar daha tutarlı olur ve yorumlanması daha kolaylaşır. Prosedürü, İmmünofloresan Analiz Geliştirme Laboratuvarı'ndan teknolog Cassandra Bryant uygulamalı olarak gösterecektir. Reaktifleri ambalajlarından çıkarın ve her bir maddenin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin, reaktifleri hazırlayın ve hasta serumunu prospektüsteki talimatlara göre seyreltin; lamlar barkodludur ve otomatik sistemlere kolayca entegre edilebilir.

Bu prosedür, manuel lam işlemeyi göstermektedir. Bununla birlikte, yüksek kapasiteli laboratuvarlar, barkod tarama özelliklerine sahip otomatik lam işleme ekipmanlarını tercih edebilirler. Inova cihazları, iş akışı sonuçları ve raporlama üzerinde kontrol sağlayan merkezi bir akıllı ağ üzerinden birbirine bağlanmıştır.

IFA için. Bu durum, işlem sırasında pozitif hasta tanımlanmasını sağlar; transkripsiyon ve ilgili hataları önler. Uygun lama bir damla pozitif kontrol ve bir damla negatif kontrol damlatın.

Kalan kuyucuklara 20 ila 25 µL seyreltilmiş hasta serumu pipetleyin. Her seferinde tek bir lam işleyin. Lamı, tabanında nemli bir kağıt havlu bulunan bir boyama kabına yerleştirin, kabın kapağını kapatın ve lamı 30 dakika boyunca inkübe edin.

Nemli koşullar, substratın kurumasını önleyerek artefakt boyanmaların oluşmasını engelleyecektir. Bu inkübasyon süresi boyunca, hastanın serumundaki anti-nükleer antikorlar, her bir kuyucuğa fikse edilmiş hücrelerin antijenlerine bağlanacaktır. İnkübasyon süresinin ardından, substrata zarar vermemek için serumu yumuşak bir yıkama tamponu akımıyla durulayın.

Akışın doğrudan substrat üzerine gelmemesi için lamı hafifçe eğik tutun. Lamların bu şekilde konumlandırılması, kuyucuklar arasındaki numunelerin birbirine karışmasını önlemeye de yardımcı olacaktır. Fazla yıkama tamponunu hafifçe vurarak uzaklaştırın ve lamı yıkama tamponu içeren bir Copeland kavanozuna yerleştirin.

Yıkama adımı için inkübasyon süresi yaklaşık beş dakika olmalıdır. Lamları yıkama tamponundan çıkarın ve hafifçe vurun. Fazla yıkama tamponunu uzaklaştırmak için her bir kuyucuğa bir damla floresan konjugat uygulayın.

NA testi için, IgG FC spesifik bir konjuge kullanımı önerilir. Lamları nemlendirilmiş kap içerisinde 30 dakika boyunca inkübe edin ve boyama kapağını yeniden kapattığınızdan emin olun. Konjuge ışığa duyarlıdır ve kapak, lamları ışığa maruz kalmaktan koruyacaktır.

Bu inkübasyon süresi boyunca konjuge, hücre antijenlerine bağlanmış olan hastanın anti-nükleer antikorlarına bağlanacaktır. Konjugenin bu bağlanması, inkübasyonun ardından kuyucuklarda floresan oluşumuyla sonuçlanır. Lamı yıkama tamponu ile yıkayın.

Daha önce yapıldığı gibi, bir lamelini kağıt havlu üzerine yerleştirin ve lamelin alt kenarına kesintisiz bir hat şeklinde montaj medyumu uygulayın. Her bir lamı yıkama tamponundan çıkarın ve lamı hafifçe vurun. Fazla yıkama tamponunu uzaklaştırmak için, lamın alt kenarını lamelin kenarına değdirin.

Slaytı, üzerindeki kapatma camının üzerindeki bağlama ortamı, hava kabarcığı oluşmadan slaytın üst kenarına kadar yayılacak şekilde yavaşça indirin; optimal bağlama ortamı miktarını elde etmek, mükemmelleştirilmesi için pratik gerektiren bir tekniktir. Karanlık bir odada bulunan floresan mikroskobunda slaytlar incelenirken, tüm kuyucuğun taraması 20x veya 25x objektif ile gerçekleştirilmelidir. Hücre dağılımını ve floresan üniformitesini değerlendirmek için 40x objektife geçiş yapın.

Pozitiflik ve paternle ilgili nihai yorumu yapmak için pozitif ve negatif kontrollere bakın. Negatif kontrol tamamen karanlık görünmeyebilir ancak genellikle düşük düzeyde non-spesifik floresan gösterecektir. Pozitif kontrol, çekirdekte parlak elma yeşili floresan gösterecektir.

Pozitiflik, bir artıdan dört artıya kadar olan bir reaktivite derecelendirme ölçeği kullanılarak sınıflandırılabilir. Manuel yorumlamanın yanı sıra lamlar, otomatik floresan mikroskobuna yüklenebilir ve taranabilir. Karanlık oda gerekmemektedir.

Uygun slayt tipi seçilerek bir proje oluşturulduktan sonra, cihaz her bir kuyucuktaki hücrelerin yüksek çözünürlüklü dijital görüntülerini elde eder ve depolar. Ayrıca Nova view, floresan ışık yoğunluğunu ölçerek sonuçları pozitif veya negatif olarak kategorize eder ve pozitif örnekler için patern tanıma sağlar. Görüntüler, operatör tarafından yüksek çözünürlüklü bir bilgisayar monitöründe görüntülenerek Nova View'un nihai yorumlanmasına, revize edilmesine ve onaylanmasına olanak tanır.

Onaylanmış sonuçlar üzerinden sonuç raporları oluşturulabilir. Çekirdek içindeki bileşen protein yapılarına oto-antikor bağlanması; homojen, benekli, sentromer, nükleoler ve nükleer nokta dahil olmak üzere beş ana nükleer paternle sonuçlanır. Burada gösterildiği gibi homojen bir paterni tanımlamak için, mitotik veya bölünen hücreleri belirleyin.

Mitotik hücreler, genellikle dinlenme halindeki hücrelere göre daha belirgin olan, katı ve tekdüze bir floresans gösterir. Dinlenme halindeki hücre çekirdekleri, yaygın boyanma ile tekdüze görünmelidir. Bu karakteristik patern, büyük olasılıkla çift sarmallı DNA'ya karşı gelişen otoantikorların sonucudur.

Benekli paternin temel bir özelliği, metafaz mitotik hücrelerin bozuk para yuvası görünümüdür. Bu hücrelerin kromozomal bölgesi negatiftir. Dinlenme halindeki hücreler ise çekirdeklerin tamamında benekli bir patern sergiler.

Beneklenme, kaba veya ince olarak tanımlanabilir. Kaba beneklenme, SM ve RNP'ye karşı gelişen otoantikorların sonucudur. İnce beneklenme ise RNA polimerazın yanı sıra S-S-A-S-S-B'ye karşı gelişen otoantikorlardan kaynaklanabilir.

DFS paterni, yoğun ince benekli (dense, fine speckled) olarak adlandırılır ve DFS 70'e karşı gelişen otoantikoreların göstergesidir. Mitotik hücreler benekli boyanma sergilerken, dinlenme halindeki hücrelerin çekirdeği boyunca tekdüze dağılmış ince benekler görülür. Bu vakalarda, DFS 70 otoantikorlarının bağ dokusu hastalığı olan hastalara kıyasla sağlıklı bireylerde yaygın olması nedeniyle konfirmasyon testleri yapılmalıdır.

Sentromer paternini belirlemek için kuyucukları tarayın ve mitotik veya bölünen hücreleri tespit edin. Bölünen hücreler, genellikle metafaz barı olarak adlandırılan, birbirleriyle yakın ilişkili çok sayıda ayrı benekçi içerir. Dinlenme halindeki hücreler ise çekirdek boyunca dağılmış yaklaşık 40 ila 60 adet ayrı benekçi gösterir.

Sentromer paterni, nükleoler patern ile birlikte sentromer proteinlerine karşı gelişen otoantikorlarla ilişkilidir. Mitotik hücrelerdeki kromozomal bölgenin boyanması değişkendir. Nükleoler patern, dinlenme halindeki hücre çekirdeklerinin nükleoplazmasında görülen zayıf, benekli veya homojen boyanmanın yanı sıra, çekirdeklerin homojen veya benekli boyanmasıyla ilişkilidir.

Bu patern, RNA polimeraz üç fibrillin ve PM SCL antikorlarına karşı gelişen otoantikorlar ile ilişkilidir. Nükleer nokta paterni; negatif metafaz, mitotik hücreler ve dinlenme halindeki hücre çekirdeklerinde birkaç ayrı nokta ile ilişkilidir. Bu karakteristik patern sıklıkla SP 100 PML veya P 80 colan'a karşı gelişen otoantikorların bir sonucudur.

Bu antikorlar primer biliyer siroz ve otoimmün hepatit ile ilişkilidir. Gösterilen görüntüde, nükleer nokta paterni, mitokondriyal antijenlere karşı gelişen otoantikorlar nedeniyle sitoplazmik boyanma sergilemektedir. Anti-nükleer antikor tespiti ve patern tanıma, hasta tanısına yardımcı olmak için önemli bir araç görevi görür.

Çeşitli paternlerin önemini anlamak, klinisyenlerin ve laboratuvar personelinin uygun takip testlerini gerçekleştirmesine olanak tanır. Antinükleer antikor paternlerini doğru bir şekilde tanımlamak için en önemli faktörler, yüksek kaliteli bir hücre substratı seçmek ve lamları tutarlı ve iyi bir teknikle işlemektir. Lam okuma işlemi geleneksel olarak karanlık odalarda floresan mikroskobu ile yapılır ve hücre döngüsü ile hücre morfolojisi bağlamındaki çeşitli paternlere aşina, eğitimli teknologlar tarafından gerçekleştirilir.

Son birkaç yılda, lamların otomatik okunması için dijital görüntüleme sistemleri geliştirilmiştir; bu tür cihazlar iş akışını otomatikleştirir, okuma ve yorumlama tutarlılığını artırır. Ayrıca, barkodlu lamların kullanımı sayesinde, süreç boyunca numune izlenebilirliği sağlanarak potansiyel transkripsiyon hataları ortadan kaldırılır, veri bütünlüğü ve hasta güvenliği artırılır. Bu videoyu izledikten sonra, indirekt immünofloresan prosedürünün her bir adımının nasıl uygulanacağı ve klinik olarak anlamlı antinükleer antikor paternlerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.