Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği In Vitro

Aşağıdaki deneyin genel amacı, osteosarkom hücrelerinde fotodinamik tedavinin sitotoksik etkinliğini göstermektir. Bu, ilk olarak fotosensitizör M-T-H-P-C'nin osteosarkom hücreleri tarafından hücre içi alımının ölçülmesiyle elde edilir. İkinci adımda, M-T-H-P-C'yi aktive etmek ve sitotoksik oksijen radikallerini üretmek için hücrelere lazer ışığı uygulanır.

Son olarak, hücre metabolizması ve hücre sayısı, suda çözünür bir tetra oleum bir veya WST bir tahlil ile ölçülür. Sonuç olarak, WST bir tahlil ve doğrudan hücre sayımı, osteosarkom hücreleri üzerindeki fotodinamik tedavinin sitotoksisitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, in vitro fotodinamik tedavi etkinliğinin ölçülmesine izin verdiği ve şu anda hastalarda kullanılan tekniğe benzediği için osteosarkom tedavisine kadar uzanır.

Osteosarkom hücre hatları arasındaki M-T-H-P-C alımını karşılaştırmak için, 0.2 kez, 10'u altıncı Hoss'a ve kuyucuk başına 143 B hücresine kaplayarak başlayın. Altı oyuklu plakalarda üç kopya halinde, hücrelerin gece boyunca% 80 ila 90 co akıcılığına yapışmasına izin verin ve daha sonra ertesi gün, karanlıkta farklı zaman periyotları için hücreleri sabit bir M-T-H-P-C konsantrasyonu ile inkübe edin Fotosensitizörün hücreler tarafından zamana bağlı alımını değerlendirmek için. İnkübasyonlardan sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra hücreleri 0.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın ve sayın.

Daha sonra, hücreleri 400 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün. Ortamı aspire edin ve peleti PBS'de mililitre başına iki kez 10 ila beşinci hücrelere kadar nihai yoğunluğa yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 96'nın her bir oyuğuna pipetleyin.

417 nanometre uyarma ve 652 nanometre emisyona ayarlanmış bir floresan spektrofotometrede hücrelerin floresansını iyi bir şekilde plakalayın ve ölçün. Daha sonra, mililitre M-T-H-P-C konsantrasyonlarında üç nükte halinde 100 mikrolitre sıfır ila dört miligram kaplayarak standart bir eğri hazırlayın. 96 oyuklu bir plakada ve daha önce ölçülen plakadan kuyu içeren her hücrenin bağıl floresan birimini hesaplamak için standart bir eğri oluşturmak için floresansı gösterildiği gibi ölçün.

Foto duyarlılaştırıcının fototoksisitesini ölçmek için, önce her bir PHOTOSENSITIZER konsantrasyonu için koyu toksisite kontrol hücreleri de dahil olmak üzere, 96 oyuklu bir plakada her M-T-H-P-C konsantrasyonu başına üç kopya halinde kuyu başına 3000 hücre tohumlayın. Hücrelerin ertesi gün gece boyunca %50 ila %60 co akıcılığına bağlı kalmasına izin verin. Hücreleri, inkübasyonu takiben beş saat boyunca karanlıkta bir dizi M-T-H-P-C konsantrasyonu ile inkübe edin.

Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve M-T-H-P-C olmadan, daha sonra M-T-H-P-C absorpsiyon spektrumuna özgü, uygun göz koruması kullanarak taze ortam ekleyin. 652 nanometre diyot lazeri 13,5 santimetre yükseklikte santimetre kare başına 21,88 miliwatt güce ayarlayın. Santimetre kare başına beş jullük bir enerji dozu elde etmek için hücrelere olan mesafe.

Ardından, aydınlatmadan sonra 230 saniye boyunca karanlık toksisite kontrol hücreleri dışındaki hücreleri aydınlatın. Hücreleri 24 saat boyunca karanlıkta 37 santigrat derecede tutun. Daha sonra, 10 mikrolitre wst, 100 mikrolitre ortam başına bir reaktif ekleyin, wst bir reaktifin eklenmesinden üç saat sonra, tek tek kuyucukların emilimini 415 nanometrede ölçün.

Son olarak, WST bir tahliline ek olarak hayatta kalan hücrelerin sayısını hesaplayın. Hücrelerin doğrudan sayımı, hücre toksisitesini ölçmek için ikinci bir yöntemdir. Canlı hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, 2 24 oyuklu plakada oyuk başına 10 ila dördüncü hücreye iki kez tohumlayın ve gece boyunca yapışmalarına izin verin.

Ertesi gün, hücreleri karanlıkta beş saat boyunca M-T-H-P-C ile inkübe edin ve az önce gösterildiği gibi aydınlatın. Karanlık kontrol hücrelerini 24 saat sonra karanlıkta tutun, süpernatanı toplayın, hücreleri bir kez PBS ve tripsin gözlerle yıkayın, sonunda hücreleri aşağı doğru döndürün ve peleti saymak için 200 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin. Bu grafikte gösterilen sonuçlar, üst panelde, M-T-H-P-C'nin hücre içi seviyelerini temsil eden hücre süspansiyonunun floresan yoğunluğu ile zamana bağlı bir şekilde M-T-H-P-C'nin alımını göstermektedir.

Alt panelde. Doza bağlı M-T-H-P-C alımı, bir floresan spektrofotometresi ile M-T-H-P-C'nin floresansı ölçülerek değerlendirilebilir. Bu grafik, M-T-H-P-C'nin hücre içi seviyelerini temsil eden hücre süspansiyonunun floresan yoğunluğu ile zamana bağlı bir şekilde sabit bir M-T-H-P-C konsantrasyonunun alımını göstermektedir.

Bu grafikte, beş saatlik bir inkübasyondan sonra Haass ve 143 B hücresinde doza bağlı M-T-H-P-C alımı gösterilmiştir. Yüksek metastatik hücre hattı 143 B'deki alım, düşük metastatik ebeveyn konak hücre hattından önemli ölçüde daha yüksekti. Osteosarkom hücrelerinin doza bağlı koyu toksisitesi gösterilmiştir.

143 B hücresi farklı M-T-H-P-C dozları ile muamele edildi ve tedavi edilmeyen hücrelerle karşılaştırıldı ve wst bir test ile ölçülen metabolik aktivite ve hücre sayısında doza bağlı bir azalma gözlendi. Azalmış hücre canlılığı, mililitre başına 2.5 mikrograma eşit ve daha yüksek bir M-T-H-P-C konsantrasyonunda kabul edildi. Alttaki grafikte, M-T-H-P-C'nin doza bağlı toksisitesi gösterilmiştir.

Hücreler, farklı M-T-H-P-C dozları ve ardından santimetre kare başına beş joule hızında aydınlatma ile muamele edildi. Hücre metabolik aktivitesinde sonuç olarak bir azalma ve hücre sayısında bir azalma gözlendi. Bu tekniğin geliştirilmesi, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların bu yöntemleri in vivo osteosarkom modellerine ve diğer klinik öncesi araştırmalara uygulamalarının yolunu açtı.