Name: Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, osteosarkom hücrelerinde fotodinamik tedavinin sitotoksik etkinliğini in vitro olarak nasıl değerlendirebilirsiniz. M-T-H-P-C fotosensitizörünün hücre içi alımını ölçün ve lazer aktivasyonu sonrası WST-1 testi ile hücre canlılığını analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar nazik onların yardım ve teknik uzmanlık için Susanna GRAFE ve Arno Wiehe özel sayesinde, lipozomal mTHPC formülasyonu ile bize sağlamak için biolitec Araştırma GmbH ile (Jena, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. Biz de sonuçları büyük bir bölümünü oluşturulan ve yayımı 11 coresponsible oldu Kerstin Reidy, teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Schweizerischer Verein Balgrist, Zürih Üniversitesi, Krebsliga Zürih yanı sıra Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, İsviçre hibe ve EuroNanoMed ERA-NET / SNF İsviçreli bir hibe ile hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı 31NM30-131004/1. Bu çalışma aynı zamanda HSM Kanton Zürih Muskuloskeletal Onkoloji (Yüksek İhtisas Tıp) programı tarafından desteklenmiştir.

1.. Bulunduğu Low mTHPC arasında Alımı ve Yüksek Metastatik HOS ve 143B OS Hücre Hatlarının Karşılaştırılması <ol><li> DMEM, Ham F12 ve bir oranı 4.5:4.5:1 içinde ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu ihtiva eden hücre kültür ortamı hazırlayın. Not: PS mTHPC bir lipozom formülasyonu, 1.5 mg / ml mTHPC bir son konsantrasyonda su içinde çözülür. </li><li> Levha 0.2 x 10 6 HOS ve 143B hücre / oyuk, 6 oyuklu tabaklar (her bir durum için kopyaların) ve hücreler gece boyunca uygun sağlar. Not: sayısını tek tek hücre çizgileri için ayarlanmalıdır. % 80-90 arasında bir confluency Deney zamanında en çok uygundur. </li><li> Ertesi gün farklı zaman dilimlerinde (zamana bağlı alımı) için mTHPC sabit bir konsantrasyonu ile inkübe hücreleri, ya da sabit bir süre (doza bağlı bir uptake) boyunca mTHPC artan yoğunluklarda. </li><li> Belirli bir zaman p mTHPC ile hücreleri inkübeoints veya mTHPC konsantrasyonları. Not: Bu çalışmada, HOS 143B ve hücre çizgileri, her ikisi için de 0.6 ug / ml ile inkübe edildi mTHPC 0, 2.5, 5, veya 10 saat, ya da 5 saat boyunca 0, 0.6, 2.5 ve 10 ug / ml ile mTHPC. Uygulanan zaman aralıkları ve dozajlar, kullanılan bir hücre hattı ile ilgili olarak değişebilir. </li><li> Her zaman hücreleri direkt ışık maruz kalmasını önlemek için karanlık veya karartılmış ışık koşullarında çalışmak unutmayın. </li><li> Belirtilen koşullarda hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortam aspire ve hücreler PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 0.5 ml tripsin / EDTA ile hücreleri ayırmak ve hücreleri sayın. </li><li> Ayrıldıktan sonra, 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri orta aspire ve 200,000 hücre / ml &#39;lik bir son yoğunluğa kadar PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Elde edilen hücre süspansiyonu pipetle 100 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde ve bir floresan spektrofotometrede bu hücrelerin floresan ölçer (örneğin 20.000 hücre). AyarımTHPC floresans ölçümleri için ler vardır: emisyon için 652 nm eksitasyon ve 417 nm. </li><li> , Hücre başına içsel mTHPC miktarının hesaplanması aşağıdaki gibi hücre sayısı ve hücre hacmine nispi floresan ünitesi (RFU) normalleştirmek amacıyla: </li><li> 0-4 ug / ml (araç kullanımı üç kopyalı ölçüm) ikinci PBS mTHPC farklı konsantrasyonları kullanılarak standart bir eğri hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her seyreltme oranından 100 ul pipet ve aşama 1.6 altında tarif ayarları kullanarak kuyuların floresan ölçer. </li><li> Kuyuda (ug / ml) mTHPC konsantrasyonunu vermektedir mTHPC, doğrusal standart eğrinin eğimi ile (20,000 hücreler için elde edilmiş) RFU bölün. </li><li> (Hücre süspansiyonu 100 ul temsil ug) bir kuyuda mTHPC toplam miktarını almak ve 20,000 hücre hacmi ile bu değeri 10 bölmek için bu mTHPC konsantrasyonu bölün. </li><li> X (4/3 x π): Bir kürenin için formülü ile hacmini hesaplayınR3. Mikroskop altında 20 tripsinize edilmiş hücre çapını ölçmek ve bu değeri 2 ile bölünmesiyle elde edilir yarıçapı r. </li><li> Son olarak, 10 saat (doza bağlı alımı) saat ya da% 100&#39;e ayarlanmış olan 10 ug / ml mTHPC (zamana bağlı alımı) ile işlem gördükten sonra HOS hücreleri için elde edilenlere tüm değerleri normalize. </li></ol> 2. PS in vitro Fototoksisite Ölçümü <ol><li> 96 oyuklu bir plaka (mTHPC her bir konsantrasyonu için kopyaların kullanılır) içerisinde 3,000 hücre / oyuk tohum ve gece boyu bağlı sağlar. Benzer şekilde ek bir 96 oyuklu plaka hazırlanması ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre tedavisi, ancak daha sonra faz kontrastlı görüntüleme için bir kenara koydu. Not: sayı her bir hücre hattı için ayarlanmalıdır. Deneyin zamanında% 50-60 arasında bir confluency idealdir. <ol><li> MTHPC konsantrasyonlarının her biri için hücrelerin gelen karanlık toksisite denetimi eklemek için unutmayın.se mTHPC seçilmiş konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda inkübe edilecek hücreler, ancak aydınlatılmış olmayacaktır. </li></ol></li><li> Ertesi gün, hücre çizgileri ile ilgili olarak mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5 ve 10 ug / ml) farklı konsantrasyonları ile inkübe edilir ve hücreleri 5 saat boyunca karanlıkta tutun. <ol><li> Bölüm 1.3.2 başvurun Not: Kuluçka süresi aydınlatma hücre hattı ve kullanılan PS bağlıdır önce, bu nedenle, ayrı deneylerde, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman noktaları test için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Belirtilen süre için inkübe edildikten sonra, PBS ile iki kez yıkama ve hücreler mTHPC olmadan yeni taze ortam ekleyin. </li><li> MTHPC absorpsiyon spektrumu için özel bir 652 nm diyot lazer, (bkz. Şekil 1) ile hücrelerin aydınlatın. <ol><li> 13.5 cm dista bir yükseklikte, 21.88 mW / cm 2 gücüne lazer ayarlama5 J / cm 2 lik bir enerji dozu elde etmek amacıyla, hücrelerden ım. 230 saniye boyunca hücreleri aydınlatın. (Ve mTHPC olmadan) karanlık toksisite kontrol hücrelerini aydınlatmak etmeyin. Not: Her zaman PS uyarma için kullanılan lazer ışıktan gözleri korumak için gözlük. </li></ol></li><li> Aydınlatma sonra, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de karanlıkta hücreleri tutun. Daha sonra, suda çözülebilen tetrazolium (WST-1) reaktif (orta μl/100 10 ul) ekleyin. </li><li> Üç saat WST-1 reaktifi ilave edildikten sonra, 415 nm&#39;de, 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine absorbansı ölçülür. </li><li> Hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, (örneğin mTHPC olmadan mTHPC ve nonilluminated olmadan aydınlatılmış)% 100 her bir durum için non mTHPC tedavi edilen hücreler için elde edilen değerlerin ortalaması olarak ayarlayın. </li></ol> 3. Hücre Sayım tarafından Hücre sayısı Tahmini <ol><li> Tohum 20,000 hücre / biz, 24 oyuklu bir plaka içerisinde ll ve onları bir gece boyunca bağlı sağlar. </li><li> MTHPC ile 5 saat (0.001, 0.003, 0.15, 0.6 ve 1.25 ug / ml) için hücreler inkübe edin ve yukarıda tarif edildiği gibi, onları aydınlatır. </li><li> Orta toplayın, 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile, bir kez PBS ile yıkayın hücreleri bunları trypsinize ve bunları toplamak. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, ortam aspire taze ortam ve 200 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Bir Neubauer odası içinde hücreleri sayın. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını veya çıkar çatışması beyan ederim.

PDT cevap olarak uygun bir sitotoksisite elde etmek için, doğru lazer ışığı ayarları ve inkübasyon sürelerini seçmek çok önemlidir. Burada açıklanan işlemler PS alımını belirlemek için in vitro ve in PDT kaynaklı sitotoksisite ölçmek için tutarlı ve etkili. PS mTHPC spesifik soğurma dalga boylarını kullanarak, hücresel alımı PS doğrudan bir şekilde tespit edilebilir ve PS sitotoksik reaktif oksijen türleri oluşturmak için etkinleştirilebilir. Bu in vitro kurulumu k...

Osteosarkom (OS) sanat tedavi Bugünkü devlet, bir primer kemik tümörü, neo adjuvan kemoterapi ve cerrahi bir kombinasyonunu kapsar. Bu tedavi rejimi, kemoterapi kullanımından önce, yaklaşık% 20 ila lokalize hastalığı olan hastaların hayatta kalma oranı artışı, şu anda 4,% 3, 60-70 arasındadır. Ancak, son iki yılda, yerel hastalığı olan OS hastaların genel sağkalım, 5 4 durmuş durumda. Ayrıca, bu hastaların% 30-40 tan sonra 3 yıl içinde nüks ve metastatik hastalığı olan hastalarda% 20-30 4 kötü bir hayatta, 6, 7, yaşamaya devam. Bu hastaların sonuçlarını iyileştirmek için, yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi gerekmektedir. Fotodinamik terapi (PDT), bir çok yeni anti-kanser terapisi, bir photosensi uyarılması için belirli bir dalga boyunda ışık kullanırkan akışı içine enjeksiyonundan sonra tümör hücrelerinde biriken tizer (PS). PS&#39;nin Lazer ışığı uyarım tümör hücreleri ve hücre ölümü ile sitotoksik reaksiyonu meydana oksijen mevcudiyetinde oksijen radikalleri oluşturur. PDT tümör enfarktüs yol açan, vazokonstriksiyon ve tümör mikro-damar trombus oluşumuna neden olan ve, dolayısıyla tümör içinde yerel hipoksi ve anoksi Bu birincil mekanizma yanı sıra, iki ek PDT biyolojik işlemler, daha az tümör büyümesine katkıda uyandırdı. Son olarak, PDT yaralı ve ölen tümör hücrelerinin lokal bir bağışıklık tepkisinin, PDT&#39;nin oldukça benzersiz bir özelliği tetikler. Bu, tamamlayıcı sistemi ve dendritik hücreleri antijen sunan 8 aktivasyonunu içerir. Bu durumda, şartlar tümör spesifik bağışıklık yol açan, lenfoid hücrelerin sonraki aktivasyonu tümör antijenlerin sunumu için oluşturulur. Şimdiye kadar, PDT, yumuşak doku tümörleri ve hyperpl çeşitli tedavi etmek için kullanılmaktadırasya adlı, örneğin aktinik keratoz, Barrett özofagus, endobronşiyal tümörler, mesane kanseri, bazal hücreli karsinom, baş ve boyun kanseri 2 palyatif tedavi olarak. Tedavi çok az yan etkileri olan, yerel büyük ölçekli nekroza neden olduğu bilinmektedir ve bu yüzden seçici olarak tümör dokusu ortadan kaldırmak için potansiyele sahiptir. Bu avantajlara rağmen, PDT uygulama kemoterapötik ilaçların uygulanması daha teknik olarak daha zor olmaya devam etmektedir. Maksimal etkinlik, PS konsantrasyonu, ışığa maruz kalma süresini ve toplam ışık enerji transferini elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Bu, in vivo deneyler yapılabilir, ancak Optimize edilmiş gereken parametrelerin görece çok sayıda, bu ilk olarak in vitro en uygun şartları belirlemek için daha etkilidir. Aşağıda tarif edilen deneylerde, PS 5,10,15,20-tetrakis-(meta-hidroksifenil) CHL kullanan PDT in vitro etkinliği testOrin, mTHPC (Şekil 1A) kısaltılır. mTHPC anda baş ve boyun kanseri hafifletici tedavisi için klinikte kullanılan tıbbi ürün Foscan, aktif maddedir. Düşük konsantrasyonlarda zaten büyük hücre hasarının neden olan, en güçlü PS biridir ve bu doku penetrasyonu 9, 10 açısından diğer PS üstün olduğu gösterilmiştir. Hafif emilme tayfı (Şekil 1 B), sırasıyla PS biriken doku lokalizasyonu ve PDT indüksiyonu için kullanılan iki önemli tepe, 417 nm &#39;de bir ve 652 nm&#39; de bir ikinci, göstermektedir. Şu anda, mTHPC için bir lipozomal formülasyon geliştirme aşamasındadır. İşte, biz bu lipozomal formülasyon alımını ölçmek için, ve iki insan OS hücre hatlarında FDT gerçekleştirmek için prosedürleri tarif; düşük metastatik HOS ve yüksek metastatik 143B hücreleri. Burada sunulan verilerin bazıları 11 daha önce rapor edilmiştir. ThBurada anlatılan E yaklaşım PDT etkinliği üzerinde bir metastatik fenotip etkisini araştırmak için bize sağlar. Orthotopically bağışıklık yetersizliği olan SCID farelerinin arka bacaklarda enjekte 143B hücrelerinin metastaz intratibial birincil tümörlerin, yakından insan Metastaz hastalığı taklit eden bir model neden olur. Bu nedenle, önerilen in vitro deneyler uygun PDT ayarlar daha sonra in vivo deneylerde kullanılmak üzere değerlendirmek için mükemmel bir şekilde uygundur.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Almanya</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Almanya</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu</td><td>GIBCO, Basel, İsviçre</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, Jena, Almanya</td><td></td><td>Bu lipozomal formülasyon Ar-Ge'den kaynaklandığı için D şu anda katalog numarası mevcut değil. Stok: 1.5 mg / ml; 9:1 dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) ve dipalmitoilfosfatidilgliserol (DPPG; %>99 saflık) karışımında sağlanır</td></tr> <tr><td>Spectramax Gemini XS plaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA</td><td>ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 nm Lazer</td><td>biolitec AG, Jena, Almanya</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>Suda çözünür tetrazolyum (WST) reaktifi</td><td>Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, İsviçre</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

osteosarkom hücrelerde fotodinamik tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; in vitro</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Son yıllarda, daha az sistemik yan etkiler ile, kansere karşı daha etkili bir tedavi bulma zorluğu olmuştur. Bu nedenle Fotodinamik tedavi, daha seçici tümör tedavisi için yeni bir yaklaşımdır. Oksijen varlığında, belirli bir dalga boyundaki ışık ile aktivasyon üzerine, bir sitotoksik yanıtı ortaya çıkarma 1 oksijen radikal üreten, toksik olmayan bir photosensitizer (PS), kullanan fotodinamik terapi (PDT). FDA tarafından neredeyse yirmi yıl önce onun onayına rağmen, PDT günümüzde sadece kanser türleri (cilt, mesane) ve nononcological hastalıkları (sedef, aktinik keratoz) 2 sınırlı sayıda tedavi etmek için kullanılır. PDT kullanımının en büyük avantajı, sistemik yan etkileri engelleyen bir lokal tedavi, gerçekleştirmek için yeteneğidir. Ayrıca, (sinirler veya kan damarlarının çapında) örneğin hassas bölgelerde tümörlerin tedavisine izin verir. Burada, bir intraoperatPDT ive uygulama osteosarkom (OS), primer tümör uyduları hedef kemik tümör, cerrahi tümör rezeksiyonu sonrasında dokuyu çevreleyen tümör geride kabul edilir. Tedavi nükslerin sayısını azaltmakta ve (postoperatif) metastaz riskini azaltmayı amaçlamaktadır. Bu çalışmada, iyi kurulmuş intratibial OS fare modellerinde, insan hastalığı üretmek için kullanılan yaygın olarak kullanılan OS hücre çizgilerinin etkili bir tedavi için uygun PDT ayarlarını elde etmek üzere in vitro PDT işlemleri içinde mevcut. PS mTHPC alımı, bir spektrofotometre ve fototoksisite bir WST-1 deneyi ile ve hayatta kalan hücrelerin sayımı ile değerlendirilen, hücre ölümünü teşvik etmek için 652 nm&#39;de mTHPC lazer ışığı uyarım ile tahrik edilmiştir ile incelenmiştir. Kurulan teknikleri, hayvan modellerinde gelecekteki çalışmalar için uygun PDT ayarları tanımlamak için bize sağlar. Onlar PDT etkinliğinin değerlendirilmesi için kolay ve hızlı bir araçtır <em&gt; In vitro, in vivo olarak bir uygulama yapılmıştır.

Burada bildirilen teknikler ile, insan OS hücrelerinde mTHPC bazlı PDT incelenmiştir. İlk olarak, mTHPC zamana ve doza bağımlı bir alım, düşük metastatik HOS ve yüksek düzeyde metastatik 143B OS hücre hatlarında araştırılmıştır. mTHPC alımı bir floresan spektrofotometre ile mTHPC floresanı (Reidy et al. 11 izni ile yeniden Şekil 2) ölçülmesi ile değerlendirilebilmektedir. Şekil 2A, bir zaman bağlı bir şekilde mTHPC alımını göstermektedir. Hücre süspansiyonunun flores...

Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, osteosarkom hücrelerinde fotodinamik tedavinin sitotoksik etkinliğini göstermektir. Bu, ilk olarak fotosensitizör M-T-H-P-C'nin osteosarkom hücreleri tarafından hücre içi alımının ölçülmesiyle elde edilir. İkinci adımda, M-T-H-P-C'yi aktive etmek ve sitotoksik oksijen radikallerini üretmek için hücrelere lazer ışığı uygulanır.Son olarak, hücre metabolizması ve hücre sayısı, suda çözünür bir tetra oleum bir veya WST bir tahlil ile ölçülür. Sonuç olarak, WST bir tahlil ve doğrudan hücre sayımı, osteosarkom hücreleri üzerindeki fotodinamik tedavinin sitotoksisitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, in vitro fotodinamik tedavi etkinliğinin ölçülmesine izin verdiği ve şu anda hastalarda kullanılan tekniğe benzediği için osteosarkom tedavisine kadar uzanır.Osteosarkom hücre hatları arasındaki M-T-H-P-C alımını karşılaştırmak için, 0.2 kez, 10'u altıncı Hoss'a ve kuyucuk başına 143 B hücresine kaplayarak başlayın. Altı oyuklu plakalarda üç kopya halinde, hücrelerin gece boyunca% 80 ila 90 co akıcılığına yapışmasına izin verin ve daha sonra ertesi gün, karanlıkta farklı zaman periyotları için hücreleri sabit bir M-T-H-P-C konsantrasyonu ile inkübe edin Fotosensitizörün hücreler tarafından zamana bağlı alımını değerlendirmek için. İnkübasyonlardan sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra hücreleri 0.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın ve sayın.Daha sonra, hücreleri 400 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün. Ortamı aspire edin ve peleti PBS'de mililitre başına iki kez 10 ila beşinci hücrelere kadar nihai yoğunluğa yeniden süspanse edin. 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 96'nın her bir oyuğuna pipetleyin.417 nanometre uyarma ve 652 nanometre emisyona ayarlanmış bir floresan spektrofotometrede hücrelerin floresansını iyi bir şekilde plakalayın ve ölçün. Daha sonra, mililitre M-T-H-P-C konsantrasyonlarında üç nükte halinde 100 mikrolitre sıfır ila dört miligram kaplayarak standart bir eğri hazırlayın. 96 oyuklu bir plakada ve daha önce ölçülen plakadan kuyu içeren her hücrenin bağıl floresan birimini hesaplamak için standart bir eğri oluşturmak için floresansı gösterildiği gibi ölçün.Foto duyarlılaştırıcının fototoksisitesini ölçmek için, önce her bir PHOTOSENSITIZER konsantrasyonu için koyu toksisite kontrol hücreleri de dahil olmak üzere, 96 oyuklu bir plakada her M-T-H-P-C konsantrasyonu başına üç kopya halinde kuyu başına 3000 hücre tohumlayın. Hücrelerin ertesi gün gece boyunca %50 ila %60 co akıcılığına bağlı kalmasına izin verin. Hücreleri, inkübasyonu takiben beş saat boyunca karanlıkta bir dizi M-T-H-P-C konsantrasyonu ile inkübe edin.Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve M-T-H-P-C olmadan, daha sonra M-T-H-P-C absorpsiyon spektrumuna özgü, uygun göz koruması kullanarak taze ortam ekleyin. 652 nanometre diyot lazeri 13,5 santimetre yükseklikte santimetre kare başına 21,88 miliwatt güce ayarlayın. Santimetre kare başına beş jullük bir enerji dozu elde etmek için hücrelere olan mesafe.Ardından, aydınlatmadan sonra 230 saniye boyunca karanlık toksisite kontrol hücreleri dışındaki hücreleri aydınlatın. Hücreleri 24 saat boyunca karanlıkta 37 santigrat derecede tutun. Daha sonra, 10 mikrolitre wst, 100 mikrolitre ortam başına bir reaktif ekleyin, wst bir reaktifin eklenmesinden üç saat sonra, tek tek kuyucukların emilimini 415 nanometrede ölçün.Son olarak, WST bir tahliline ek olarak hayatta kalan hücrelerin sayısını hesaplayın. Hücrelerin doğrudan sayımı, hücre toksisitesini ölçmek için ikinci bir yöntemdir. Canlı hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, 2 24 oyuklu plakada oyuk başına 10 ila dördüncü hücreye iki kez tohumlayın ve gece boyunca yapışmalarına izin verin.Ertesi gün, hücreleri karanlıkta beş saat boyunca M-T-H-P-C ile inkübe edin ve az önce gösterildiği gibi aydınlatın. Karanlık kontrol hücrelerini 24 saat sonra karanlıkta tutun, süpernatanı toplayın, hücreleri bir kez PBS ve tripsin gözlerle yıkayın, sonunda hücreleri aşağı doğru döndürün ve peleti saymak için 200 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin. Bu grafikte gösterilen sonuçlar, üst panelde, M-T-H-P-C'nin hücre içi seviyelerini temsil eden hücre süspansiyonunun floresan yoğunluğu ile zamana bağlı bir şekilde M-T-H-P-C'nin alımını göstermektedir.Alt panelde. Doza bağlı M-T-H-P-C alımı, bir floresan spektrofotometresi ile M-T-H-P-C'nin floresansı ölçülerek değerlendirilebilir. Bu grafik, M-T-H-P-C'nin hücre içi seviyelerini temsil eden hücre süspansiyonunun floresan yoğunluğu ile zamana bağlı bir şekilde sabit bir M-T-H-P-C konsantrasyonunun alımını göstermektedir.Bu grafikte, beş saatlik bir inkübasyondan sonra Haass ve 143 B hücresinde doza bağlı M-T-H-P-C alımı gösterilmiştir. Yüksek metastatik hücre hattı 143 B'deki alım, düşük metastatik ebeveyn konak hücre hattından önemli ölçüde daha yüksekti. Osteosarkom hücrelerinin doza bağlı koyu toksisitesi gösterilmiştir.143 B hücresi farklı M-T-H-P-C dozları ile muamele edildi ve tedavi edilmeyen hücrelerle karşılaştırıldı ve wst bir test ile ölçülen metabolik aktivite ve hücre sayısında doza bağlı bir azalma gözlendi. Azalmış hücre canlılığı, mililitre başına 2.5 mikrograma eşit ve daha yüksek bir M-T-H-P-C konsantrasyonunda kabul edildi. Alttaki grafikte, M-T-H-P-C'nin doza bağlı toksisitesi gösterilmiştir.Hücreler, farklı M-T-H-P-C dozları ve ardından santimetre kare başına beş joule hızında aydınlatma ile muamele edildi. Hücre metabolik aktivitesinde sonuç olarak bir azalma ve hücre sayısında bir azalma gözlendi. Bu tekniğin geliştirilmesi, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların bu yöntemleri in vivo osteosarkom modellerine ve diğer klinik öncesi araştırmalara uygulamalarının yolunu açtı.

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fotodinamik tedavi (PDT), akciğer kanseri tedavisi için non-invaziv ve cerrahi olmayan bir yöntemdir. Işığa duyarlılaştırıcılar seçici olarak tümör dokusunda birikir ve oksijen ve uygun dalga boyundaki ışığın varlığında tümör hücresi ölümüne yol açar. Bu protokol videosunda, akciğer kanseri hücrelerinde potansiyel bir ışığa duyarlılaştırıcının fototoksik potansiyelini değerlendirmek için PDT tabanlı yöntem kullanılmıştır.

İn Vitro Fototoksisite Deneyi: Akciğer Kanseri Hücrelerinde Bir Fotosensitizörün Fototoksik Potansiyelini Değerlendirmek için PDT Tabanlı Bir Yöntem

Fotodinamik tedavi (PDT), akciğer kanseri tedavisi için non-invaziv ve cerrahi olmayan bir yöntemdir. Işığa duyarlılaştırıcılar seçici olarak tümör dokusunda birikir ve oksijen ve uygun dalga boyundaki ışığın varlığında tümör hücresi ölümüne yol açar. Bu video, ışığa duyarlılaştırıcının fototoksik potansiyelini belirlemek için tümör taşıyan bir farede nanopartiküller içeren ışığa duyarlılaştırıcı kullanılarak in vivo anti-tümör etkinlik analizini açıklamaktadır.

PDT'nin İn Vivo Antitümör Etkinlik Analizi: Tümör Taşıyan Farelerde Bir Fotosensitizörün Fototoksik Potansiyelini Belirleme Tekniği

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Fotodinamik tedavi (PDT), akciğer kanseri tedavisi için alternatif bir seçenektir. PDT'nin terapötik etkisini arttırmak için, kemoterapi ile kombine edilmiş akciğer kanseri hedefli nanopartiküller geliştirilmiştir. PDT'nin hazırlanmış nanopartiküllerle hem in vitro hem de in vivo antikanser etkinlikleri değerlendirildi.

Akciğer Kanseri Hedefli Nanopartiküller ile Fotodinamik Tedavi antikanser Etkinliği

Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Fotodinamik Tedavi (PDT) apoptosis ikna etmek için görünür ışık photoactivation tarafından izlenen bir exogenously uygulanan photosensitizer (PS) kuluçka içerir tıbbi bir işlemdir. Biz PS kuluçka ve ışık tedavisi parametreleri farklılıklar çalışmaya kullanılabilir PDT benzetimini yapmak için tasarlanmış bir vitro PDT iletişim kuralı mevcut.

Fotodinamik Tedavi bir Vitro yaklaşım

Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.

2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Dokuları ile Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modelinin Kurulması

Öğrenin, osteosarkom hücrelerinde fotodinamik tedavinin sitotoksik etkinliğini in vitro olarak nasıl değerlendirebilirsiniz. M-T-H-P-C fotosensitizörünün hücre içi alımını ölçün ve lazer aktivasyonu sonrası WST-1 testi ile hücre canlılığını analiz edin.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği

Daha fazla video keşfet